CN105050608A

CN105050608A - 含有硫化和非硫化聚阴离子多糖的藻类提取物及其应用

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Publication number: CN105050608A
Application number: CN201380072763.0A
Authority: CN
Inventors: H·德玛斯; I·勒彻威尔
Original assignee: Amadeite SAS
Current assignee: Amadeite SAS
Priority date: 2012-12-11
Filing date: 2013-11-18
Publication date: 2015-11-11
Anticipated expiration: 2033-11-18
Also published as: US10821144B2; WO2014090515A1; BR112015013567B1; FR2999084A1; CN105050608B; EP2931295B1; JP6440631B2; DK2931295T3; JP2016502983A; HUE045232T2; BR112015013567A2; EP2931295A1; US11633443B2; US20150320811A1; PT2931295T; US20180303887A1; US20210038662A1; ES2746106T3; BR112015013567A8; FR2999084B1

Abstract

本发明涉及一种含有硫化和非硫化聚阴离子聚多糖的藻类提取物，涉及一种制备藻类提取物的方法及其治疗性和预防性应用。

Description

含有硫化和非硫化聚阴离子多糖的藻类提取物及其应用

本发明涉及一种含有硫化和非硫化聚阴离子多糖的藻类提取物、一种制备藻类提取物的方法及其治疗性和预防性应用。

石莼种(石莼目，绿藻门)是在潮间带或前滩区域发现的丰富藻类。它们移居在坚硬的基质上，利用附着盘固定，但有些种类也形成自由移动的生存形式。石莼藻类是生长迅速的藻类，且对于空间和营养的吸收伺机而动。在富含营养的沿海水域以及泻湖中可以特别观察到其在水柱中的生长，其中石莼种以“绿潮”(Fletcher，1996)的形式增殖。通常大量的生长和大串(植物)，因此，在其堆积时会产生有害气体(Morand和Briand，1996)。直至现在，这样的生物量鲜有附加价值，除了用作肥料(Mazé等，1993，Cuomo等，1995)、生产甲烷(Briand和Morand，1997)、作为人类食品消费(Pérez，1997)或作为造纸的基料(Nicolucci和Monegato，1993)以外的利用途径或许可以提供将其特殊性质利用至最佳的可能性。

目前，绿藻的利用基本基于为开发将绿藻作为非需要品去除的新路径而提供可能性的应用。预期的应用路径涉及到生物气(Briand和Morand1997，Morand和Briand1999，Morand等，2006)、生物材料(生物塑料)(Chiellini等，2008)、生物可降解杯子(Sassi等，2008)、纸张和用于打包的硬纸板(Nicolucci&Monegata等，1993)、充电纳米复合物(Demais等，2006a，2006b)的生产，动物营养学：动物的无毒饲料(Demais等，2006)、养鱼业的偏好因素(DeBose等，2008，KutGuroy等，2007)以及化妆品(表面活性剂)(Ranson等，2008)。

这些藻类中含有的聚多糖的化学及理化性质使得它们在人类和动物消费领域的制药、化学、养鱼业和农业中作为新功能性和生物学活性聚合物的引人注目的候选者(RobicA,等，CarbohydratePolymers77(2009)206-216；LahayeMRobicA，BiomacromoleculesVol8No.6，2007)。

根据这些方面之一，本发明涉及一种从石莼目的藻类中的提取物，尤其是从石莼种类的绿藻中的提取物，含有硫化和非硫化的聚阴离子聚多糖，其大小小于等于50KDa。

具体地，本发明所述藻类提取物聚多糖含有甘露糖和/或阿拉伯糖。更具体地，所述聚多糖含有至少0.005％的甘露糖和/或至少0.005％的阿拉伯糖(以基于藻类提取物干物质总重量的重量计)，特别地，至少0.01％的甘露糖和/或至少0.01％的阿拉伯糖。更进一步具体地，所述多聚体含有的甘露糖的量在0.01-0.20％的范围内，和阿拉伯糖的量在0.01-0.5％的范围内(以基于藻类提取物干物质总重量的重量计)，特别地，甘露糖的量在0.03-0.15％的范围内，和阿拉伯糖的量在0.01-0.2％的范围内。

具体地，所述聚多糖还含有：

-半乳糖；

-葡萄糖；

-鼠李糖；

-木糖；和

-葡萄糖醛酸。

更具体地，所述聚多糖含有：

-0.05-0.5％的半乳糖，特别为0.1-0.4％；

-0.005-0.05％的葡萄糖，特别为0.01-0.03％；

-2-15％的鼠李糖,特别为5-10％；

-0.1-1％的木糖，特别为0.3-0.7％；和

-1-7％的葡萄糖醛酸，特别为1-5％；

以基于藻类提取物干物质的总重量的重量计。

因此，本发明藻类提取物的一个例子可含有：

-甘露糖；

-阿拉伯糖；

-半乳糖；

-葡萄糖；

-鼠李糖；

-木糖；和

-葡萄糖醛酸。

对于本发明藻类提取物的一个更具体的例子可作如下描述，含有：

-0.01-0.20％的甘露糖，特别为0.03-0.15％；

-0.01-0.5％的阿拉伯糖，特别为0.01-0.2％；

-0.05-0.5％的半乳糖，特别为0.1-0.4％；

-0.005-0.05％的葡萄糖，特别为0.01-0.03％；

-2-15％的鼠李糖，特别为5-10％；

-0.1-1％的木糖，特别为0.3-0.7％；和

-1-7％葡萄糖醛酸，特别为1-5％；

以基于藻类提取物干物质的总重量的重量计。

本发明藻类提取物的另一个更具体的例子可含有：

-0.09％的甘露糖；

-0.1％的阿拉伯糖；

-0.3％的半乳糖；

-0.02％的葡萄糖；

-8.1％的鼠李糖；

-0.5％的木糖；和

-2.6％的葡萄糖醛酸；

以基于藻类提取物干物质的总重量的重量计。

更具体地，本发明藻类提取物含有硫化和非硫化的聚阴离子聚多糖，其大小小于40、30、20或15KDa。更具体地，本发明藻类提取物的硫化和非硫化聚阴离子聚多糖的大小小于等于15KDa。

一道尔顿(Da)是一重量单位，其定义为等于碳12原子质量的十二分之一，该质量大致通过数种同位素的混合物(主要为碳12和碳13，除了与任何碳原子一样的6个质子以外，还各自具有6个和7个中子)估算。一道尔顿非常精准地等于一个氢原子的质量，其精确值为1.00794amu(原子质量单位)。千道尔顿(KDa)等于1000Da.

在本发明范围内，以kDa提及的质量通过本领域技术人员通常采用的任何方法测得，尤其是本发明藻类提取物中硫化和非硫化的聚阴离子多糖的质量可通过只允许预定大小分子通过的膜超滤来辨别。

“石莼种类的绿藻”指的是来自于石莼目下石莼科家族石莼种组下的绿藻。尤其是以下种类和亚种：鱼栖台石莼(Ulvaacanthophora)、阿南德氏石莼(Ulvaanandii)、窄叶石莼(Ulvaangusta)、阿氏石莼(Ulvaarasakii)、阿莫里加石莼(Ulvaarmoricana)、绿石莼(Ulvaatroviridis)，薄叶石莼(Ulvaattenuata)，贝特石莼(Ulvabeytensis)，双面石莼(Ulvabifrons)，短柄石莼(Ulvabrevistipitata)，球石莼(Ulvabulbosa)，缅甸石莼(Ulvaburmanica)，柔石莼(Ulvabyssoides)，加州石莼(Ulvacalifornica)，蝶形石莼(Ulvachaetomorphoides)，格石莼(Ulvaclathrata)，猩红石莼(Ulvacoccinea)，扁石莼(Ulvacompressa)，簇石莼(Ulvaconglobata)，羊角石莼(Ulvacornucopiae)，角石莼(Ulvacornuta)，科夫龙石莼(Ulvacovelongensis)，厚石莼(Ulvacrassa)，厚膜石莼(Ulvacrassimembrana)，拱石莼(Ulvacurvata)，常石莼(Ulvadactylifera)，锯齿石莼(Ulvadenticulata)，秀丽石莼(Ulvaelegans)，艾米氏石莼(Ulvaelminthoides)，肠形石莼(Ulvaenteromorpha)，直石莼(Ulvaerecta)，宽石莼(Ulvaexpansa)，带石莼(Ulvafasciata)，窗石莼(Ulvafenestrata)，曲石莼(Ulvaflexuosa)，胶石莼(Ulvagelatinosa)，双生石莼(Ulvageminoidea)，巨石莼(Ulvagigantea)，大石莼(Ulvagrandis)，亨德石莼(Ulvahendayensis)，勾石莼(Ulvahookeriana)，霍克石莼(Ulvahopkirkii)，印氏石莼(Ulvaindica)，细长石莼(Ulvaintestinalis)，类细长石莼(Ulvaintestinaloides)，绞石莼(Ulvaintricata)，管状石莼(Ulvaintybacea)，加哇石莼(Ulvajavanica)，科林石莼(Ulvakylinii)，莴石莼(Ulvalactuca)，莴叶石莼(Ulvalactucaefolia)，亮绿石莼(Ulvalaetevirens)，朗吉石莼(Ulvalaingii)，线石莼(Ulvalinearis)，舌石莼(Ulvalingulata)，链石莼(Ulvalinkiana)，林氏石莼(Ulvalinza)，里皮石莼(Ulvalippii)，滨海石莼(Ulvalitoralis)，海岸石莼(Ulvalittorea)，裂石莼(Ulvalobata)，滑石莼(Ulvalubrica)，镶边石莼(Ulvamarginata)，微球石莼(Ulvamicrococca)，米亚塔石莼(Ulvamyriotrema)，那不勒斯石莼(Ulvaneapolitana)，线虫石莼(Ulvanematoidea)，欧尼石莼(Ulvaohnoi)，橄石莼(Ulvaolivacea)，橄榄石莼(Ulvaolivaceum)，太平洋石莼(Ulvapacifica)，匙形石莼(Ulvapapenfussii)，奇形石莼(Ulvaparadoxa)，小石莼(Ulvaparva)，微小石莼(Ulvaparvula)，潘腾石莼(Ulvapatengensis)，狭带石莼(Ulvapercursa)，孔石莼(Ulvapertusa)，菲氏石莼(Ulvaphyllosa)，珀石莼(Ulvapopenguinensis)，韭叶石莼(Ulvaporrifolia)，阔石莼(Ulvaprocera)，深石莼(Ulvaprofunda)，浒石莼(Ulvaprolifera)，假曲石莼(Ulvapseudocurvata)，假林氏石莼(Ulvapseudolinza)，丽石莼(Ulvapulchra)，紫丝石莼(Ulvapurpurascens)，奎隆石莼(Ulvaquilonensis)，辐状石莼(Ulvaradiata)，拉尔夫石莼(Ulvaralfsii)，毛茛石莼(Ulvaranunculata)，网纹石莼(Ulvareticulata)，拉科石莼(Ulvarhacodes)，硬石莼(Ulvarigida)，切叶石莼(Ulvarotundata)，鲁本斯石莼(Ulvarubens)，塞弗拉石莼(Ulvasaifullahii)，斯凯戈尔石莼(Ulvascagelii)，斯堪的纳维亚石莼(Ulvascandinavica)，赛瑞石莼(Ulvasericea)，齿叶石莼(Ulvaserrata)，单叶石莼(Ulvasimplex)，索伦森石莼(Ulvasorensenii)，纺石莼(Ulvaspinulosa)，狭叶石莼(Ulvastenophylla)，柄石莼(Ulvastipitata)，海边石莼(Ulvasublittoralis)，针叶石莼(Ulvasubulata)，带状石莼(Ulvataeniata)，细叶石莼(Ulvatenera)，四角石莼(Ulvatetragona)，绞线石莼(Ulvatorta)，荸荠石莼(Ulvatuberosa)，脐状石莼(Ulvaumbilicata)，芒石莼(Ulvauncialis)，钩刺石莼(Ulvauncinata)，松萝石莼(Ulvausneoides)，囊状石莼(Ulvautricularis)，革质石莼(Ulvautriculosa)，卵形石莼(Ulvauvoides)，紫萼石莼(Ulvaventricosa)。

更具体地，本发明的藻类提取物为来自Ulvaarmoricana种的藻类提取物。

根据本发明的一种实施方式，所述藻类提取物含有：

-10-50％的碳；

-1-10％的氢；

-1-5％的氮；

-20-50％的氧；和

-1-15％的硫；

以藻类提取物干物质的总质量百分比计。

更具体地，所述藻类提取物含有：

-15-30％的碳；

-3-6％的氢；

-1-3％的氮；

-25-40％的氧；和

-2.5-10％的硫；

以藻类提取物干物质的总质量百分比计。

在所述提取物的干物质中的其他特别代表性的化学元素为矿物质(Ca、K、Na、Mg、Al、Cl、I、P、Fe等)。

更具体地，本发明藻类提取物还具有如图1所示¹HNMR图谱特征。

在298K下，用装配有反向TCI低温探头5mm¹H/¹³C/¹⁵N的BrukerAvance500分光仪对该¹HNMR谱进行记录。在分析之前，将样本溶解于99.97％的D₂O原子(atom)中。化学位移相对于外标(三甲基硅基丙酸)以ppm表示。无HOD信号抑制。

根据另一方面，本发明涉及一种石莼目藻类提取物、尤其是石莼种中绿藻提取物的制备方法，其中：

a)清洗藻类使其不含沙土；

b)粉碎所述藻类；

c)在粉碎的产物中将固体相从液体相中分离出来；

d)澄清所述液体相；

e)对步骤d)中获得的汁液进行超滤；和

f)将e)中获得的过滤汁液进行浓缩和干燥。

根据本发明方法的一个实施方式，所述藻类经清水清洗。

可采用现有技术中任何可用的方法进行沙石的去除。

然后将所述的藻类进行研磨，特别是通过研磨机进行，例如精炼机或切割机。

接着，通过挤压研磨产物，例如通过带压或碟压或离心，将研磨后的固体产物(榨渣)与其液体相(汁液)进行分离。

“汁液”指的是含有藻类细胞双层结构的壁结构的细胞质汁液。

然后将所获得的液相通过具有叠装碟组的澄清器、或通过离心、倾倒或过滤(如用袋子或盘子)进行澄清。

然后将获得的汁液进行超滤。

根据本发明方法的一个实施方式，超滤在一个小于50KDa的膜上，尤其是在40、30、20或15KDa的膜上进行。更具体地，所述膜为15KDa的膜。

所述膜可以是，例如，陶瓷膜或有机膜。更特别地，所述膜可以是陶瓷膜。

接着，可将过滤获得的汁液进行浓缩，例如通过反渗透、蒸发或沉淀，然后通过例如冻干或雾化进行干燥。

任选地，还可再对所获得的提取物进行粉碎，从而获得颗粒大小均匀的粉末。

根据一个方面，本发明所述方法部分在室温下进行。室温指的是5-25℃之间的温度。

根据另一个方面，本发明方法部分在4-10℃之间的温度下进行，这是为了避免微生物的生长。

该方法与现有技术中描述的大多数方法不同，因为它少了涉及对藻类提取物进行沉淀的步骤。也因为其不使用溶剂，尤其是有机溶剂，而与先前的提取方法不同，这从生态学角度来说意味着较大的优势。

根据另一方面，本发明涉及一种可根据上述方法获得的藻类提取物。

根据另一方面，本发明涉及一种可根据上述方法获得的如上所述的藻类提取物。

根据另一方面，本发明还涉及一种含有如前所述的藻类提取物以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

根据另一方面，本发明还涉及上述藻类提取物作为药物的应用。

根据另一方面，本发明还涉及上述藻类提取物作为一种改善记忆，尤其是预防和/或治疗衰老或阿尔兹海默症的药物用于预防和/或治疗神经障碍、抑郁、应激、焦虑的应用，用于预防和/或治疗神经性和炎症性慢性疼痛、皮肤(皮肤、皮下组织和相关器官)疼痛或体部疼痛的应用。

根据一方面，本发明还涉及上述藻类提取物作为一种改善记忆，尤其是预防和/或治疗衰老或阿尔兹海默症的药物用于预防和/或治疗神经障碍、抑郁、应激、焦虑的应用，用于预防和/或治疗神经性和炎症性慢性疼痛、皮肤(皮肤、皮下组织和相关器官)疼痛或体部疼痛的应用。

“神经障碍”指的是神经系统尤其是脑部的疾病。在这些疾病中，可尤其提及的脑部病理状况例如帕金森氏病、多发性硬化、阿尔兹海默症、痴呆、偏头痛、头痛。

“抑郁”指的是一种情绪性障碍，主要特征在于个体处于失去积极性和生命动力的状态，伴有或不伴有不同症状。最典型的症状是失去希望、渴求和自尊。还会出现其它征象，例如乏力、忧郁、消极思维、阴暗思维、自杀倾向、焦虑或恐惧，或在极少的情况下会有幻觉。

术语抑郁也可被命名为“复发性抑郁障碍”、“精神崩溃”、“临床抑郁”、“单相抑郁”、“重度抑郁特征性发作”或还有“抑郁综合征”。所述术语“抑郁”指的是抑郁的所有类型。也可采用术语“抑郁症”或“抑郁感”。通俗语言也可称为“情绪低落”，其症状类似但更轻。

“应激”指的是在面对压力或限制下，器官在其环境中所作出的整体反应。这些反应始终取决于个体在他/她感觉到压力时对其所具有的感知。这是会导致生理和心理反应的一系列复杂事件。

“焦虑”指的是一种生理和心理状态，其特征为肉体、情绪、认知和行为组成。在缺乏或存在生理应激时，焦虑可产生恐惧、不安、困惑和忧虑的情绪。焦虑被认为是一种在应激情况下的正常反应。当焦虑过度，其可被分类称为“焦虑障碍”。

因此，本发明藻类提取物也可用于兽医用途，例如，用于预防和/或治疗家畜和宠物应激、或作为家畜或宠物的抗焦虑药物；和用于人类用途，例如出于健康目的而作为食物添加剂而无任何副作用，或作为药物用于例如预防和/或治疗应激、焦虑、抑郁相关疾病，以及能够改善记忆，尤其是对于学生，对抗衰老，或进一步地包括治疗阿尔兹海默症的范围。

药学上可接受的赋形剂根据药剂形式以及所需的给药途径，自本领域技术人员熟知的常用赋形剂中进行选择。

在用于口服、舌下、皮下、肌内、静脉内、外用、局部、气管内、鼻内、经皮或直肠给药的药物组合物中，上述的藻类提取物可与药学上常规的赋形剂混合并按单位计量施用于动物或人类，用于预防或治疗前述疾病。

适合的给药形式包括口服形式，例如片剂、软或硬胶囊、粉剂、颗粒剂或口服溶液或混悬液、舌下、口腔、气管内、眼内、鼻内给药形式，通过吸入、外用、肠胃外途径例如经皮、皮下、肌内或静脉内给药形式、直肠内给药形式以及植入剂。对于外用用途，本发明化合物可用于药霜、凝胶、药膏或洗剂。

当制备固体组合物(例如片剂)时，可以将主要活性成分与药学上可接受的载体(例如明胶、淀粉、乳糖、硬脂酸镁、滑石粉、阿拉伯胶或其类似物)混合。

所述的片剂也可以用蔗糖、纤维素衍生物、或其他合适的材料包覆，或所述的片剂可以被处理从而具有延长的或延迟的活性，且持续释放预定量的活性成分。

如胶囊这样的制剂，可通过例如将活性成分和稀释剂混合并将获得的混合物灌入软或硬胶囊内而获得。

含有本发明藻类提取剂的所述药物组合，还可呈液体形式，例如，溶液、乳剂、混悬剂或糖浆，尤其是用于例如口服或鼻内给药的适合形式。合适的液体支撑剂可以是例如水、有机溶剂如甘油或乙二醇，也可以是它们以不同的比例在水中的混合物。

糖浆或用于滴服药剂的制剂还可含有活性成分以及不含热量的(acaloric)甜味剂，例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯作为防腐剂，也可以作为提供尝味剂及合适的着色剂。

粉剂或在水中可分散的颗粒剂可含有与分散剂或润湿剂、混悬剂(例如聚乙烯吡咯烷酮)，以及甜味剂或风味调节剂的混合的活性成分。

人类的每日给药剂量可达到0.5-25mg/kg，一次或多次摄入，具体可以是1.5-18mg/kg，更具体地为3-15mg/kg。动物的每日给药剂量可以达到5-150mg/kg，一次或多次摄入，具体可以是10-100mg/kg，甚至更具体地可以是20-80mg/kg。通常，本发明藻类提取物的日剂量是能够产生治疗效果的藻类提取物的最小有效剂量。

“有效剂量”，指组合物可改善所需治疗的疾病或障碍一种或多种特征性参数的任意剂量。

在一些特别的病例中，可能适用较高或较低的剂量，这些剂量并不脱离本发明的范围。根据习惯做法，每个患者、人类或动物的适合剂量均由医师或兽医师根据给药途径、体重、所述患者的反应进行决定。

根据另一方面，本发明藻类提取物可以食品组合物的形式用于预防和/或治疗前述疾病。

“食品组合物”指的是例如用于人类或动物的任何种类的营养食品、食物产品，如酸奶、饮料，尤其是乳制品，以及任何种类的原材料、工艺添加剂或助剂，以预混的形式，无论要用与否，均加入到食品中，任何形式的完整或补充食品。

根据另一方面，本发明还涉及一种治疗上述疾病的方法，包括向患者施用有效剂量的本发明藻类提取物。

本发明将通过以下附图和实施例的方式更具体地进行描述，而并非对其范围进行限制。

附图

图1：本发明藻类提取物(AE)的¹HNMR图谱。

图2：在Shodex802和803两个柱上分离到的本发明藻类提取物的色谱图。

图3：本发明藻类提取物样品的三甲基硅烷衍生物采用气相色谱进行分析后获得的色谱图。其中Ara：阿拉伯糖；Gal：半乳糖；Glc：葡萄糖；Xyl：木糖；Man：甘露糖；Rha：鼠李糖；GlcA：葡萄糖醛酸。

图4：在高架十字迷宫实验中，AE对于开放臂进入次数的效果。

图5：在高架十字迷宫实验中，AE对于开放臂停留时间的效果。

图6：灯光厌恶刺激的学习实验中，AE对于两个杠杆按压动作累积总次数的效果(ALSAR指的是灯光厌恶刺激回避反应)。

图7：在ALSAR实验中，AE对于5分钟内对作用杠杆(LA)和非作用杠杆(LI)的按压动作总次数的效果。

图8：在ALSAR实验中，AE对于10分钟内对作用杠杆(LA)和非作用杠杆(LI)的按压动作总次数的效果。

图9：在ALSAR实验中，AE对于15分钟内对作用杠杆(LA)和非作用杠杆(LI)的按压动作总次数的效果。

图10：在ALSAR实验中，AE对于20分钟内对作用杠杆(LA)和非作用杠杆(LI)的按压动作总次数的效果。

图11：在第14天的行为绝望预实验，AD对于静止持续时间的效果(s，平均值±SME)。

图12：在第15天的行为绝望实验，AD对于静止持续时间的效果(s，平均值±SME)。

实施例

实施例1：制备本发明的藻类提取物

取一公吨石莼种的新鲜粗绿藻，经清水清洗，并用清洗藻类的机器去除沙石。

除非另行指出，该方法的步骤在室温下进行。

然后通过工业精炼机(Inotec品牌类型“I175CDI-75D”)将所述藻类(1公吨沥干藻类有8％的干物质)粉碎至细颗粒。“细颗粒”指的是颗粒大小在50-1000nm之间的颗粒，分两类，其一是大小为50-200nm之间的，另一类是大小在600-1000nm之间的。

然后通过工业带压(Flottweg品牌，“BFRU800HK”型)将经粉碎的物质进行压榨，吞吐量在1吨/小时左右。

该步骤使得固相(榨渣)和液相(汁液)分离。所获汁液的收率为75％。

然后通过带有叠装碟组的澄清器(Flottweg品牌，“AC2000”型)对所获得的750kg粗汁液进行澄清。

然后就获得了含3.10％干物质(95-98％质量收率)和霜状物(2-5％，以质量计)的710kg澄清汁液。

接着，将澄清的汁液在15kDa的陶瓷膜(Tami工业)上进行超滤。

然后获得了渗透物和渗余物。保留渗透物直至获得含有2.2％干物质的640kg过滤汁液(91％的体积收率)。

蒸发浓缩后，通过冻干对所述过滤汁液(渗透物)进行干燥。

浓缩为通过一简易效应蒸发器(EVA1000，Pignat)进行，参数如下：压力回流，供给流量速度为10L/h，蒸汽压力1bar，真空压力0.3bar，蒸发温度90℃。

蒸发水流8L/h、白利度(Brixdegree)从5.5(等于干物质浓度为4.5％)上升至14.7时获得了第一浓缩物。然后将该溶液在蒸发水流5-6L/h、白利度上升到34时进行第二次浓缩。所述溶液的干物质浓度经测定为38.4％。

然后通过Bioblock科学仪器(版本CHRISTα1-4LSC)，在-80℃的冷冻温度即该步骤的最低温度下进行冻干。

然后通过行星式研磨机MiniMill(品牌Philips)对所获得的粉末进行研磨。将产物放入研磨碗(每个研磨碗中10g产物、4个氧化锆珠)。整体设置旋转15分钟，速度为10。

于是获得了14kg的藻类提取物粉末。

实施例2通过GPC(凝胶渗透色谱法)测定本发明藻类提取物硫化和非硫化聚阴离子聚多糖的大小

将根据实施例1制备的本发明藻类提取物在1000Da的膜上进行超滤，并溶于水至浓度为0.5g/L。然后灌入连续放置的两个柱Shodex802和803中(802柱的分馏区：4.10³Da，803柱分馏区：1.7.10⁵Da)。所用的洗脱液是0.1M的硝酸钠和0.2％的叠氮化钠，流速0.5ml/min。经Wyatt折射计和Wyatt18-角度光散射检测仪进行测定。假设dn/dc等于0.150ml/g。

经折射计测定的色谱图如图2所示。

即从本发明藻类提取物中获得了平均大小为4.4kDa的聚多糖。

实施例3本发明藻类提取物组成的测定

实施例1中制备的本发明藻类提取物在超滤单元(amiconcells)中，在搅拌操作下前流超滤纯化。采用截止阈值为1000Da的再生纤维素膜。将572.1mg的本发明藻类提取物样本溶解于150ml超纯水。利用5升水将所有质量小于1000Da的分子去除。将渗余物进行冻干。称得117mg样品。超滤收率即为20.5％(w/w)。将超滤后的样品进行以下分析：

根据由Montreuil(Montreuil等，1986)改进的Kamerling法(Kamerling等，1975)对构成本发明藻类提取物聚多糖的单糖比例进行测定。单糖的鉴定和剂量需要对聚合物进行水解(甲醇分解)，从而仅获取单体。然后对糖苷残基进行三甲基硅烷化从而使其挥发。以此通过气相色谱分析，以O-三甲基硅烷化的甲基糖苷形式被鉴定和测试。

采用以下试剂：

-3N甲醇/HCl溶液(Supelco)；

-碳酸银；

-肌醇；

-吡啶；

-SylonBFT(BSTFA+TMCS99:1)试剂(Supelco)；和

-二氯甲烷。

操作过程如下：取400μg如上制备的本发明藻类提取物以及50μg肌醇放入500μl的3N甲醇/盐酸混合物(Supelco)干浴，100℃下4小时。冷却至室温后，将甲醇溶解物用碳酸银中和。样品3000rpm离心15分钟，在氮气射流下蒸发上清液。然后将化合物溶解于80μl的吡啶中，并于80℃下与80μl的sylon(BSTFA:TMCS，99:1，Supelco)孵育25分钟。在氮气射流下温和蒸发多余的试剂后，将三甲基硅烷化的甲基糖苷放入500μl的二氯甲烷，然后将其灌注到气相色谱仪(灌入色谱柱，FID检测仪：火焰电离)。载气为氮气。HP-MS类型色谱柱(30m，内径0.25mm)，为非极性。升温程序如下：120℃维持1分钟，然后以1.5℃/min的梯度上升至180℃，再以2℃/min的梯度上升至200℃。

通过相对于内参标准的相对保留时间，将每种单糖与在相同条件下处理的纯单糖进行比较从而对其进行鉴定。计算每种单糖相对内参标准的响应系数，从而确定本发明藻类提取物多糖中每种单糖的比例。

所获结果如下表1和图3所示。

表1：经气相色谱分析三甲基硅烷衍生物而获得的本发明藻类提取物组合物，由基于藻类提取物总重量的重量表示；Ara：阿拉伯糖；Gal：半乳糖；Glc：葡萄糖；Xyl：木糖；Man：甘露糖；Rha：鼠李糖；GlcA：葡萄糖醛酸。

样品	超滤液的重量％	超滤收率	粗提取物的重量％
				Ara	0,6	20.50％	0.123
Gal	1.3	20.50％	0.267
				Glc	0.1	20.50％	0.021
Xyl	2.45	20.50％	0.502
				Man	0.45	20.50％	0.092
Rha	39.6	20.50％	8.118
				GlcA	12.9	20.50％	2.645

实施例4：通过功能性组合实验和附加实验对藻类提取物(AE)的效果评估(户外、高架十字迷宫、厌恶刺激逃避实验)

将本发明藻类提取物(AE)以20、40和80mg/kg向成年雄性Wistar大鼠口服给药14天并测定其效果。

AE效果在一组6只大鼠与载体(矿泉水)处理的对照批次中经功能性组合实验(FOB)进行比较并测定。为了完善AE的效果测定，进行了附加实验，户外、高架十字迷宫以及灯光厌恶刺激逃避实验。所采用的大鼠根据ASAB以及加拿大动物保护委员会颁布的伦理条例处理。

设备与方法

动物

取24只60日龄的WistarCrl:WI(Han)大鼠(查尔斯河实验室(CharlesRiverLaboratories)，69-St-Germainsurl'Arbresle，法国)。获得大鼠后，将其进行标记并分成2组放入F型聚碳酸酯笼内(48x27x20cm，U.A.R.，91-Epinay-Sur-Orge法国)。将动物安置在有空调的动物房设施内饲养，温度为22±2℃，湿度50±20％。大鼠摄入标准2016饲料(Mucedola，Harlan，米兰，意大利)并随意饮水，并放置入12小时倒置的光照-黑夜循环中(8p.m.-8a.m.提供光照)。

经适应实验室条件一周后，对大鼠称重并将其随机分为4个处理组(n＝6)。

为了避免不同产品之间可能的干扰，同笼的大鼠均接受相同的处理。不同组间的大鼠均在相同的条件下进行相同方式的处理。

FOB实验

该实验用到以下设备：

-透明观察笼；

-悬挂装置；

-夹取装置；

-用于运动和探索活动的开放场地；

-发出标准声音刺激的听觉刺激仪器；

-用于不同触觉刺激的尖笔；

-数字温度计。

在口服途径给药20、40、80mg/kg剂量产品之前(T0)以及处理14天时间(T14)之后，FOB实验均采用盲法进行。

该实验包括三个观察阶段：

-动物未受干扰前的直接观察阶段；

-动物受处理时的活动观察阶段；

-进行反应测试后的评估动物行为反应的阶段。

所记录的变量如下：

-行为效应：自主运动活性、运动行为障碍、触摸后的逃避性反应、易怒性、引发的攻击性(causedaggressivity)和木僵行为、困倦、排尿及排便、感觉运动反应(视觉定位、捏爪、捏尾以及对声音刺激的反应)。

-神经效应：瞳孔反应、眼睑反射、骨盆抬高、尾部位置、四肢及腹部的肌紧张、翻转实验、抓握实验、颤抖及立毛。

-生理效应：唾液分泌、流泪、腹泻、直肠温度、心跳-呼吸节律。

-死亡率。

在施用产品两周后，进行了如下实验：

高架十字迷宫实验(LCS)

实验器械呈十字型，架高于离地80cm处。其包括长度为50cm、宽度为15cm的四条臂。两条相对的臂由高40cm的垂直墙封闭，另两条臂则对空间开放，并因此代表了产生焦虑的位置。第18天，在接受处理后1小时，动物被置于器械十字的中央，并能够自由到达所有四条臂。经ANYMAZE系统进行5分钟的动物行为记录。在本实验中研究的变量是进入开放臂的次数，以及在开放臂中的停留时间。进入次数少以及在开放臂中的时间短被认为表示焦虑(Lister，1987)。

灯光厌恶刺激逃避反应(ALSAR)实验

该模型利用了大鼠对强光环境的厌恶。大鼠在调节操作按压活动杠杆来获取30秒时间的黑暗(作为正强化)的范围内学习掌控其厌恶的灯光环境。

该实验仪器由一个强光照射的独立笼子(50x40x37cm)组成，并含有两个杠杆：一个作用杠杆，触发它时能够获得30秒的黑暗，然后恢复光照，而另一个杠杆则是不起作用的(不产生任何正强化)。在黑暗期间，对作用杠杆的按压不会提供额外的黑暗时间。将大鼠置于笼中20分钟，并记录实验期间对每个杠杆的按压动作次数。

该实验组合具有4组完全受控于电脑的全自动调节装置。因此在实验过程中并无实验员出现在房间内。

在施用待测产品18天后，测试大鼠在ALSAR模型的操作调节中获得的训练的认知水平。

所记录的变量是在作用(LA)和非作用(LI)杠杆上按压动作的总次数以及在光照期间在两个杠杆上各自的按压次数。

作用和非作用按压动作次数能够评价出测试阶段中操控活动的水平。获得性训练(两个杠杆的辨别)则通过在光照期间对两个杠杆各自的按压动作次数进行评估(LA对LI)。

产品

所述产品是AE(藻类提取物)以实施例1制备的水溶性藻类提取物的冻干粉末和粉碎浓缩部分。将AE溶于泉水，并在FOB实验以及附加行为测试前60分钟经胃饲针头口服给药。

统计学分析

对异质性的情况即采用克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallistest)，其通过比较曼-惠特尼U检验(Mann-WhitneyUtest)的平均值比较来对处理组和对照组进行比对。

秩和检验(Wilcoxon’stest)用于每组T0至T14之间重复FOB测定的两-两对比以及在光照环境下两个ALSAR杠杆的区分。

统计及图表处理操作采用StatvieW5(SAS研究所公司，USA)软件包进行。

结果

FOB实验

比较经载体组处理的组在T0和T14之间的FOBs

在T0的FOB，给药处理前，所有研究大鼠组的结果都是均一的(表2、表3)。

在T14的FOB实验(给药处理后14天)，克鲁斯卡尔-沃利斯检验显示在不同处理组之间许多变量结果的均一性(表2)。

另一方面，对于某些研究变量，与载体相比，特定剂量的AE显示出显著的效果(图3)。

每日施用AE两周后所改善的主要变量是：

-大鼠的行为及其在饲养笼里的自主运动活性：3种剂量处理的大鼠更活跃，也更警惕，

-在观察笼里的大鼠行为：同样，2种加强剂量的大鼠更活跃，也更警惕，

-对显示目标的兴趣：3种剂量下，AE似乎对大鼠的好奇心以及对新生物的兴趣具有刺激作用(增加了探索活动、欣快感(hedonisme)、抗抑郁效应)，

-在3种AE剂量下，手指接近或受到触碰之后的逃避反应显著减少，这显现出AE的抗应激/焦虑效应，

-在3种剂量下，捏尾部和捏爪的反应也显著减少。这些降低的反应是出于AE的抗应激/焦虑效应和/或止痛效应，

-大鼠的心跳和呼吸频率似乎在3种AE剂量下处理的大鼠中更低，这是出于AE的抗应激/焦虑效应，

-大鼠的烦躁、神经过敏以及易怒性则在2个AE最强剂量给药下显著减少，这是出于镇静、抗应激和/或抗攻击性效应。

表2：在经过14天剂量为20、40和80mg/kg的AE口服施用前(T0)和之后(T14)的变量状态。

表3：在经过14天剂量为20、40和80mg/kg的AE口服施用前(T0)和之后(T14)的变量状态。

#P<0.10；*P<0.05；**P<0.01(曼-惠特尼检验:相对于载体)

FOBs中T0和T14的不同重复变量间的比较

每天摄入一定剂量的AE共14天似乎能够对所研究的特定主要变量具有影响(表4)：

-3种AE剂量下，观察笼内的大鼠行为及其自主运动活性显著增加(刺激效应或抗焦虑效应)，

-在观察场地对照大鼠的位移延迟增加，且其活动活性(跨越的空格数)下降，而经AE处理的大鼠，这些变量在T0和T14的FOBs之中保持稳定(抗应激和抗抑郁效应)，

-对于显示目标的兴趣：在剂量为20mg/kg，p.o.(口服)时，AE能够刺激大鼠对呈现在它们面前的刺激目标产生兴趣(对新事物进行探索的积极性，欣快感：抗应激和抗抑郁效应)，

-在开放分支上跨越的空格数：与载体组相比，AE并未降低在开放分支上的跨越空格数(抗应激效应)，

-手指接近时的逃避反应：3个剂量下的AE降低了实验员将手指靠近后的逃避反应(抗应激效应)，

-在对照大鼠中，对捏尾产生的反应增加，而在AE为20mg/kg时则减少(抗应激效应和/或止痛效应)，

-3种AE剂量下，对捏后肢的反应减少(抗应激效应和/或止痛效应)，

-在40和80mg/kg的AE剂量下，对声音刺激的跳跃反应显著减少(镇静和抗应激效应)，

-在20和40mg/kg的AE剂量下，心跳和呼吸频率下降(镇静和抗应激效应)，

-烦躁、神经过敏和易怒性：在80mg/kg的剂量下，AE对大鼠的烦躁、神经过敏和易怒性显示出积极效果(镇静、抗应激和/或抗攻击性效果)。

表4：在各处理组中，AE对T0-T14间FOBs的变量时间依赖性变化的效果

N.S.：在T0和T14之间不显著

在T0和T14之间下降

在T0和T14之间上升

*:P<0.05；#:P<0.10(趋势)

高架十字迷宫实验(LCS)

在高架十字迷宫实验中，经过18天的每日处理，按20、40和80mg/kg口服AE显著增加了大鼠进入开放臂中的次数(表5，图4)以及停留时间(表6，图5)，这显示出AE的抗应激活性。

表5：AE对高架十字迷宫实验中进入开放臂次数的效果

表6：AE对高架十字迷宫实验中进入时间的效果

灯光厌恶刺激逃避反应实验(ALSAR)

在每日施用AE18天后，克鲁斯卡尔-沃利斯检验显示，在5分钟、10分钟、15分钟和20分钟时，不同处理组中大鼠对两个杠杆(作用杠杆+非作用杠杆)的累积按压次数较为平均(图6)。

在灯光厌恶刺激逃避实验中，经20mg/kg的AE剂量给药处理了18天后的大鼠，在实验的首个5分钟结束时趋向于区分活动杠杆和非活动杠杆(图7)。

在实验的10分钟阶段结束时，经40mg/kg的AE剂量口服处理的大鼠能够明显地区分开活动杠杆和非活动杠杆，而那些经20和80mg/kg口服处理的则趋于区分操作两个杠杆。而对照大鼠并非如此，其未能显示出能够区分的倾向(图8)。

在实验的15分钟阶段结束时，经20和40mg/kg的AE剂量口服处理的大鼠能够明显地区分开活动杠杆和非活动杠杆。经80mg/kg口服处理的大鼠则不再区分两个杠杆。对照大鼠则未在此实验训练阶段中有任何区分表现(图9)。

在实验的20分钟阶段结束时，经20和40mg/kg的AE剂量口服处理的大鼠仍然能够明显地区分开活动杠杆和非活动杠杆。经80mg/kg口服处理的大鼠不再有任何区分表现，而对照大鼠则开始表现有区分的端倪(图10)。

这些结果显示了AE对于获得性训练的效果，尤其是在20和40mg/kg剂量口服后。

生理及无伤性数据

AE的施用，无论剂量多少，均未对每天经20、40或40mg/kg口服处理的大鼠表现出任何体重或食物摄入影响。在20、40和80mg/kg口服处理21天后的动物中，均未检测到毒性。

结论

本发明藻类提取物的施用显示出该产品的神经学效应，尤其是抗应激/焦虑、抗抑郁、止痛活性以及训练和记忆促进的早期获得能力。

实施例5：通过行为绝望实验对藻类提取物(AE)的效果评估

对成年雄性Wistar大鼠口服施用3个剂量(10、20和40mg/kg/d)的本发明藻类提取物(AE)作为预防性治疗，并采用行为绝望实验(BDT)对其抗焦虑效果进行评估。

每天施用所述提取物作为半长期治疗共14天。所述提取物对一组12只大鼠的效果通过BDT评估，将经载体(矿泉水)处理的对照批以及经10mg/kg/d剂量的丙咪嗪处理的参照批作为比较。

所用的大鼠根据ASAB和加拿大动物保护委员会颁布的伦理条例进行处理。

设备和方法

动物

取60只体重在200-225g的雄性Wistar大鼠(查尔斯河实验室，法国)。获得大鼠后，将其标记并分成4组放入F型聚碳酸酯笼内(48x27x20cm，U.A.R.，91-Epinay-Sur-Orge，法国)。将动物安置在有空调的动物房设施内饲养，温度为22±2℃，相对湿度50±20％。大鼠摄入标准2016饲料(Harlan，加纳，法国)并随意饮水，并放置入12小时倒置的光照-黑夜循环中(8p.m.-8a.m.提供光照)。

经适应实验室条件一周后，对大鼠称重并根据其体重随机分为5个处理组(n＝12/组)。

处理组：

-对照组：采用矿泉水处理(载体)，

-丙咪嗪组：按10mg/kg/d的剂量用丙咪嗪处理(Imi)，

-AE组10：按10mg/kg/d的剂量用AE处理(AE10)，

-AE组20：按20mg/kg/d的剂量用AE处理(AE20)，

-AE组40：按40mg/kg/d的剂量用AE处理(AE40)。

为了避免不同产品之间可能干扰，同笼的大鼠均接受相同的AE剂量。不同组间的大鼠均在相同的条件下以相同方式进行处理。

行为绝望实验(BDT)

实验器材置于有机玻璃圆筒中，其高度为50cm，直径为20cm，其中注入25℃的水到高度为30cm。

在每天用待测产品处理13天后，第14天将动物置于器材中15分钟，从而评估每个动物的静止时间。在这样的第一次测试后立即给予大鼠第14次处理。

在第15天，给予大鼠两次处理：第一次为测试前5小时，第二次为测试前1小时。该方法通常在文献中使用来测试产品对抗抑郁的有效性。该实验在前一天以相同的条件进行5分钟时间。

在两个实验(D14和D15)的第一个5分钟内所记录的静止持续时间反应了动物在面对其无法逃脱的情况下使自己屈从的能力。该屈从行为与抑郁相关。

产品

所述产品是AE(藻类提取物)以实施例1制备的水溶性藻类提取物的冻干粉末和粉碎浓缩部分。将AE溶于矿泉水并按5ml/kg的施用体积以3种测试剂量之一连续15天口服给予大鼠。每2-3天对动物进行称重以此使具体的处理与它们的体重相适应。在整个研究期间，每2-3天对它们的食物和水的摄入进行记录。

参照组的动物每天给予10mg/kg/d盐酸丙咪嗪(西格马奥瑞奇(SigmaAldrich))，其溶于水中，施用体积为5ml/kg。

载体组的动物每日被给予矿泉水，施用体积为5ml/kg。

统计学分析

在异质性的情况下采用了参数模态的ANOVA，通过对非配对t-检验进行比较，用于比较处理组、载体组以及参照组。

在异质性的情况下采用了配对ANOVA，通过配对t-检验对各组中的BDT重复测定的两-两比较进行比对。

对于食物和水的摄入，采用了非参模态分析：克鲁斯卡尔-沃利斯检验(若必要)及后续的曼-惠特尼U检验用于组间两-两比对。

统计及图表处理操作采用StatvieW5软件包(SAS研究所公司，USA)进行。

结果

行为绝望实验：D14天的预实验

在第14天的行为绝望预实验中，ANOVA未能对不同处理组动物的静止时间显现出任何异质性(表7；图11)。该预实验提供了不同处理组动物中获得屈从诱导的可能性。

表7：在第14天的行为绝望预实验中，AE对于静止时间的效果(s,均值±SME)

NS：不显著

第15天的行为绝望实验

在第15天的行为绝望实验，ANOVA显示出不同处理组动物静止时间的异质性(表8)。

非配对t-检验显示经丙咪嗪、AE20、AE40处理后的动物在静止时间上显著短于经载体处理的动物(分别为：t＝3.69，P＝0.0013；t＝2.20，P＝0.039以及t＝3.29，P＝0.003)。

非配对t-检验显示经AE20处理后的动物在静止时间上显著长于经丙咪嗪处理的动物(t＝1.72，P＝0.099)(表8；图12)。

表8：在第15天的行为绝望预实验中，AE对于静止时间的效果(s,均值±SME)

NS：不显著

第14天和第15天的实验结果比较

配对t-检验显示经丙咪嗪和AE40处理的小鼠在第14天和第15天之间，静止时间显著下降(分别为：t＝2.90,P＝0.015和t＝2.42，P＝0.034)(表9).

表9：第14天和第15天的实验结果比较(s,均值±SME)

NS：不显著

体重改变、食物和水的摄入

对于动物的体重改变、食物和水的摄入来说，在3个剂量下进行AE的施用并未显示出任何影响。

行为绝望实验

在第14天：在动物的屈从实验中，尽管经20和40mg/kg剂量AE处理的动物的静止持续时间比其他组动物较短，但在经载体、丙咪嗪和3个剂量AE施用处理的大鼠之间并未观察到显著性差异。

在第15天：施用剂量为20和40mg/kg的AE抗焦虑效果得以确认，因为经这些剂量处理后的动物的静止持续时间显著短于经载体处理的动物。剂量为40mg/kg的AE的给予使获得与10mg/kg丙咪嗪处理动物相似静止持续时间成为可能。在给予剂量为10、20和40mg/kg的AE处理的动物中观察到了剂量依赖效应。

第14和第15天的静止持续时间的对比：只有经剂量为10mg/kg的丙咪嗪处理以及经剂量为40mg/kg的AE处理的动物在第14和第15天之间静止持续时间有显著的下降。

动物行为及藻类提取物的无伤害性

在按10、20和40mg/kg的剂量施用AE的实验期间，所有动物并未观察的任何异常行为。在经AE以10、20和40mg/kg的剂量处理14天后未在动物中检测到毒性。

结论

本发明藻类提取物的施用即表现出该产品的抗抑郁效果。

Claims

1.来源于石莼目的藻类提取物，尤其是石莼种中绿藻的提取物，含有硫化和非硫化聚阴离子聚多糖，其大小小于等于50kDa。

2.如权利要求1所述的藻类提取物，其特征在于，所述聚多糖含有甘露糖和/或阿拉伯糖。

3.如权利要求2所述的藻类提取物，其特征在于，所述聚多糖含有至少0.005％的甘露糖和/或至少0.005％的阿拉伯糖，以基于藻类提取物干物质总重量的重量计。

4.如权利要求3所述的藻类提取物，其特征在于，所述聚多糖含有量在0.01-0.20％的范围内的甘露糖，和量在0.01-0.5％的范围内的阿拉伯糖，以基于藻类提取物干物质总重量的重量计。

5.如权利要求1-4所述的藻类提取物，其特征在于，所述聚多糖还含有：

-半乳糖；

-葡萄糖；

-鼠李糖；

-木糖；和

-葡萄糖醛酸。

6.如权利要求5所述的藻类提取物，其特征在于，所述聚多糖含有：

-0.05-0.5％的半乳糖；

-0.005-0.05％的葡萄糖；

-2-15％的鼠李糖；

-0.1-1％的木糖；和

-1-7％的葡萄糖醛酸；

以基于藻类提取物干物质的总重量的重量计。

7.如以上任一权利要求所述的藻类提取物，其特征在于，所述多糖的大小小于等于15kDa。

8.如以上任一权利要求所述的藻类提取物，含有：

-10-50％的碳；

-1-10％的氢；

-1-5％的氮；

-20-50％的氧；和

-1-15％的硫；

以藻类提取物干物质的总质量百分比计。

9.如以上任一权利要求所述的藻类提取物，含有：

-15-30％的碳；

-3-6％的氢；

-1-3％的氮；

-25-40％的氧；和

-2.5-10％的硫；

以藻类提取物干物质的总质量百分比计。

10.如以上任一权利要求所述的藻类提取物，其具有如图1所示¹HNMR图谱特征。

11.一种石莼目藻类提取物、尤其是石莼种中绿藻的提取物的制备方法，其特征在于：

a)清洗藻类使其不含沙土；

b)粉碎所述藻类；

c)在粉碎的产物中将固体相从液体相中分离出来；

d)澄清所述液体相；

e)对步骤d)中获得的汁液在小于50kDa的膜上进行超滤；和

f)将e)中获得的过滤汁液进行浓缩和干燥。

12.如权利要求11所述藻类提取物的制备方法，其特征在于，步骤d)中获得的汁液在15kDa的膜上进行超滤。

13.如权利要求11-12任一所述藻类提取物的制备方法，其特征在于，步骤c)通过将步骤b)中获得的粉碎产物经挤压进行。

14.如权利要求11-13任一所述藻类提取物的制备方法，其特征在于，

a)利用清水清洗藻类使其不含沙土；和/或

b)利用精炼机粉碎所述藻类；和/或

c)利用带压挤压粉碎产物从而从粉碎的产物中将固体相从液体相中分离；和/或

d)利用具有叠装碟组(discstacks)的澄清器澄清所述液体相；和/或

e)利用15kDa的陶瓷膜对步骤d)中获得的汁液进行超滤；和/或

f)将e)中获得的过滤汁液通过蒸发进行浓缩，然后通过冻干或雾化进行干燥。

15.如权利要求11-14中任一所述方法可获得的藻类提取物。

16.如权利要求11-14中任一所述方法可获得的如权利要求1-10任一所述的藻类提取物。

17.药物组合物，含有权利要求1-10及15-16任一所述藻类提取物，和至少一种药学上可接受的赋形剂。

18.权利要求1-10及15-16任一所述藻类提取物作为药物的用途。

19.权利要求1-10及15-16任一所述藻类提取物，用于预防和/或治疗神经障碍、抑郁、应激、焦虑，作为改善记忆、尤其是用于预防和/或治疗衰老或阿尔兹海默症、预防和/或治疗神经性和炎症性慢性疼痛、皮肤(皮肤、皮下组织和相关器官)疼痛或体部疼痛的药物。