BR112015013567B1 - uso de um extrato de algas - Google Patents

Abstract

EXTRATOS DE ALGAS, PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE UM EXTRATO DE ALGAS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USOS DE UM EXTRATO DE ALGAS. A presente invenção trata de um extrato de algas que compreende polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados, de um processo de preparação de um extrato de algas, bem como de suas aplicações terapêuticas profiláticas.

Description

[001] A presente invenção trata de um extrato de algas que compreende polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados, de um processo de preparação de um extrato de algas, bem como de suas aplicações terapêuticas profiláticas.

[002] As espécies de ulvas (Ulvales, Chlorophyta) são algas abundantes encontradas na zona intertidal, ou seja, na parte da praia deixada a descoberto pela maré baixa. Elas colonizam os substratos duros, ancorados por um disco de fixação, mas algumas espécies podem igualmente dar origem a formas vivas livres, à deriva. As ulvas são algas de crescimento rápido e oportunistas quanto ao espaço e à absorção de nutrientes. Seu crescimento na coluna de água é particularmente observado nas águas costeiras eutrofizadas e nas lagunas nas quais Ulva sp. prolifera na forma de marés verdes" (Fletcher, 1996). Disso resulta frequentemente uma produção de massa e encalhes maciços que produzem gases nocivos durante seu acúmulo (Morand e Briand, 1996). Até agora, essa biomassa possuiu um baixíssimo valor agregado e os meios de utilizá-la fora do composto (Mazé et al. 1993, Cuomo et al. 1995), da produção de metano (Briand e Morand, 1997), do consumo alimentar humano (Pérez, 1997) ou como base de papel (Nicolucci e Monegato, 1993) poderiam permitir um melhor aproveitamento de suas propriedades específicas.

[003] Atualmente, a utilização das algas verdes se baseia essencialmente em usos que permitem abrir novas vias de eliminação para essas algas consideradas indesejáveis. As vias de aplicação consideradas se referem à produção de biogás (Briand & Morand 1997, Morand & Briand 1999, Morand e al., 2006), aos biomateriais (bioplásticos) (Chiellini et al., 2008), aos copinhos biodegradáveis (Sassi et al., 2008), papéis e papelões de embalagem (Nicolucci e Monegata, 1993), nanocompósitos de carga (Demais et al., 2006a, 2006b), à nutrição animal: alimentos desintoxicantes para animais (Demais et al. ,2006a), proteínas e fatores de apetência para criação de peixes (DeBose et al., 2008, Kut Guroy et al., 2007) e à cosmética (tensoativos) (Ranson et al., 2008).

[004] As propriedades químicas e físico-químicas dos polissacarídeos contidos dessas algas fazem deles candidatos atraentes como novos polímeros funcionais e biologicamente ativos nos campos do consumo humano e animal, farmacêutico, químico, da aquacultura e agrícolas (Robic A, et al. Carbohydrate Polymers 77 (2009) 206-216; Lahaye M Robic A, Biomacromolecules Vol 8 N° 6 , 2007).

[005] De acordo com um de seus aspectos, a presente invenção trata de um extrato de algas da ordem das Ulvales, em particular de um extrato de algas verdes de tipo Ulva, que compreende polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados cujo tamanho é inferior ou igual a 50 kDa.

[006] Em particular, os referidos polissacarídeos do extrato de algas de acordo com a presente invenção compreendem manose e/ou arabinose. Mais particularmente, os referidos polissacarídeos compreendem pelo menos 0,005% de manose e/ou pelo menos 0,005% de arabinose, em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas, em particular pelo menos 0,01% de manose e/ou pelo menos 0,01% de arabinose. Mais particularmente ainda, os referidos polissacarídeos compreendem manose em uma quantidade de 0,01 a 0,20% e arabinose em uma quantidade de 0,01 a 0,5%, em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas, em particular manose em uma quantidade de 0,03 a 0,15% e arabinose em uma quantidade de 0,01 a 0,2%.

[007] De modo particular, os referidos polissacarídeos compreendem ainda: - galactose; - glicose; - ramnose; - xilose; e - ácido glicurônico. Mais particularmente ainda, os referidos polissacarídeos compreendem: - de 0,05 a 0,5% de galactose, em particular de 0,1 a 0,4%; - de 0,005 a 0,05% de glicose, em particular de 0,01 a 0,03%; - de 2 a 15% de ramnose, notamment de 5 a 10%; - de 0,1 a 1% de xilose, em particular de 0,3 a 0,7%; e - de 1 a 7% de ácido glicurônico, em particular de 1 a 5%; em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas. -

[008] Assim, pode-se citar, por exemplo, um extrato de algas de acordo com a presente invenção que compreende: - manose; - arabinose; - galactose; - glicose; - ramnose; - xilose; e - ácido glicurônico. -

[009] É possível também citar mais particularmente, por exemplo, um extrato de algas de acordo com a presente invenção que compreende: - de 0,01 a 0,20% de manose, em particular, de 0,03 a 0,15%; - de 0,01 a 0,5% de arabinose, em particular, de 0,01 a 0,2%; - de 0,05 a 0,5% de galactose, em particular de 0,1 a 0,4%; - de 0,005 a 0,05% de glicose, em particular, de 0,01 a 0,03%; - de 2 a 15% de ramnose, em particular, de 5 a 10%; - de 0,1 a 1% de xilose, em particular, de 0,3 a 0,7%; e - de 1 a 7% de ácido glicurônico, em particular de 1 a 5%; em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas. -

[010] É possível ainda, citar mais particularmente, por exemplo, um extrato de algas de acordo com a presente invenção que compreende: - 0,09% de manose; - 0,1% de arabinose; - 0,3% de galactose; - 0,02% de glicose; - 8,1% de ramnose; - 0,5% de xilose; e - 2,6% de ácido glicurônico; em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas.

[011] Mais particularmente, o extrato de algas de acordo com a presente invenção compreende polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados cujo tamanho é inferior a 40, 30, 20 ou 15 kDa. Mais particularmente ainda, os polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados do extrato de algas de acordo com a presente invenção possuem um tamanho inferior ou igual a 15 kDa.

[012] Um dálton (Da) é uma unidade mássica definida como sendo igual a um doze avos da massa de um átomo de carbono 12, massa que se será, em seguida, estimar a partir de uma mistura de vários isótopos (principalmente carbono 12 e carbono 13, que possuem respectivamente de 6 e 7 neutrons a mais dos 6 prótons de qualquer átomo de carbono). Um dálton é, com uma precisão bastante boa, a massa de um átomo de hidrogênio, e o valor exato é 1,00794 uma (unidade de massa atômica). O kilodálton (kDa) é igual a 1000 Da.

[013] No contexto da presente invenção, as massas mencionadas em kDa são determinadas por qualquer método habitualmente empregado pelo técnico o assunto, em particular as massas dos polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados dos extratos de algas de acordo com a presente invenção poderão ser discriminadas por ultrafiltração com membranas deixando apenas filtrar moléculas de tamanhos predeterminados.

[014] Por “algas verdes de tipo Ulva”, entendem-se as algas verdes agrupadas no gênero Ulva, da família das Ulvaceae, da ordem das Ulvales. Podem ser citadas, em particular, as seguintes espécies e subespécies: Ulva acanthophora, Ulva anandii, Ulva angusta, Ulva arasakii, Ulva armoricana, Ulva atroviridis, Ulva attenuata, Ulva beytensis, Ulva bifrons, Ulva brevistipitata, Ulva bulbosa, Ulva burmanica, Ulva byssoides, Ulva californica, Ulva chaetomorphoides, Ulva clathrata, Ulva coccinea, Ulva compressa, Ulva conglobata, Ulva cornucopiae, Ulva cornuta, Ulva covelongensis, Ulva crassa, Ulva crassimembrana, Ulva curvata, Ulva dactylifera, Ulva denticulata, Ulva elegans, Ulva elminthoides, Ulva enteromorpha, Ulva erecta, Ulva expansa, Ulva fasciata, Ulva fenestrata, Ulva flexuosa, Ulva gelatinosa, Ulva geminoidea, Ulva gigantea, Ulva grandis, Ulva hendayensis, Ulva hookeriana, Ulva hopkirkii, Ulva indica, Ulva intestinalis, Ulva intestinaloides, Ulva intricata, Ulva intybacea, Ulva javanica, Ulva kylinii, Ulva lactuca, Ulva lactucaefolia, Ulva laetevirens, Ulva laingii, Ulva linearis, Ulva lingulata, Ulva linkiana, Ulva linza, Ulva lippii, Ulva litoralis, Ulva littorea, Ulva lobata, Ulva lubrica, Ulva marginata, Ulva micrococca, Ulva myriotrema, Ulva neapolitana, Ulva nematoidea, Ulva ohnoi, Ulva olivacea, Ulva olivaceum, Ulva pacifica, Ulva papenfussii, Ulva paradoxa, Ulva parva, Ulva parvula, Ulva patengensis, Ulva percursa, Ulva pertusa, Ulva phyllosa, Ulva popenguinensis, Ulva porrifolia, Ulva procera, Ulva profunda, Ulva proliféra, Ulva pseudocurvata, Ulva pseudolinza, Ulva pulchra, Ulva purpurascens, Ulva quilonensis, Ulva radiata, Ulva ralfsii, Ulva ranunculata, Ulva reticulata, Ulva rhacodes, Ulva rigida, Ulva rotundata, Ulva rubens, Ulva saifullahii, Ulva scagelii, Ulva scandinavica, Ulva sericea, Ulva serrata, Ulva simplex, Ulva sorensenii, Ulva spinulosa, Ulva stenophylla, Ulva stipitata, Ulva sublittoralis, Ulva subulata, Ulva taeniata, Ulva tenera, Ulva tetragona, Ulva torta, Ulva tuberosa, Ulva umbilicata, Ulva uncialis, Ulva uncinata, Ulva usneoides, Ulva utricularis, Ulva utriculosa, Ulva uvoides, Ulva ventricosa.

[015] Mais particularmente, o extrato de algas de acordo com a presente invenção é um extrato de algas da espécie Ulva armoricana.

[016] De acordo com um modo de realização da presente invenção, o extrato de algas compreende: - de 10 a 50% de carbono; - de 1 a 10% de hidrogênio; - de 1 a 5% de nitrogênio; - de 20 a 50% de oxigênio; e - de 1 a 15% de enxofre; em porcentagem mássica da matéria seca total do extrato de algas.

[017] Mais particularmente ainda, o extrato de algas compreende: - de 15 a 30% de carbono; - de 3 a 6% de hidrogênio; - de 1 a 3% de nitrogênio; - de 25 a 40% de oxigênio; e - de 2,5 a 10% de enxofre; em porcentagem mássica da matéria seca total do extrato de algas.

[018] Os outros elementos químicos presentes na matéria seca do extrato são, em particular, representados pelos minerais (Ca, K, Na, Mg, Al, Cl, I, P, Fe, etc).

[019] Mais particularmente, o extrato de algas de acordo com a presente invenção é caracterizado pelo espectro RMN 1H apresentado na Figura 1.

[020] Esse espectro RMN 1H foi registrado a 298 K em um espectrômero Bruker Avance 500 dotado de uma sonda criogênica inversa 5 mm 1H/13C/15N TCI. Antes da análise as amostras foram dissolvidas em 99,97% de átomo de D20. Os deslocamentos químicos são expressos em ppm em relação a um padrão externo (ácido trimetilsililpropiônico). Nenhuma eliminação do sinal HOD foi realizada.

[021] De acordo com outro desses aspectos, a presente invenção trata de um processo de produção de um extrato de algas da ordem das Ulvales, em particular um extrato de algas verdes de tipo Ulva, no qual: a) as algas são lavadas e desareadas; b) as referidas algas são trituradas; c) a fase sólida do triturado é separada de sua fase líquida; d) a referida fase líquida é clarificada; e) o sumo obtido na etapa d) é ultrafiltrado; e f) o sumo de filtração obtido na etapa e) é concentrado e depois secado.

[022] De acordo com um modo de realização do processo de acordo com a presente invenção, as algas são lavadas com água doce.

[023] Elas podem ser desareadas por qualquer meio posto à disposição do técnico no assunto.

[024] As referidas algas são depois trituradas, em particular por meio de um triturador como, por exemplo, um refinador ou um estilete.

[025] Em seguida, a fase sólida do triturado, o bagaço, é separado de sua fase líquida, o sumo, por prensagem do triturado, por exemplo por meio de uma prensa de banda ou de pratos, ou por centrifugação.

[026] Por “sumo”, entende-se o sumo citoplásmico que inclui a estrutura parietal da estrutura dupla das células das algas.

[027] A fase líquida obtida é, depois, clarificada, por exemplo com um clarificador de placas, ou por centrifugação, decantação ou filtração (por exemplo com bolso ou com placa).

[028] O sumo obtido é, em seguida, ultrafiltrado.

[001] De acordo com um modo de realização do processo de acordo com a presente invenção, a ultrafiltração é realizada com uma membrana de menos de 50 kDa, em particular com uma membrana de 40, 30, 20 ou 15 kDa. Mais particularmente, a membrana será uma membrana de 15 kDa.

[029] Essa membrana pode ser, por exemplo, uma membrana de cerâmica ou uma membrana orgânica. Mais particularmente, a membrana será uma membrana de cerâmica.

[030] O sumo de filtração obtido pode, em seguida, ser concentrado, por exemplo por osmose inversa, evaporação ou precipitação, e depois secado por exemplo por liofilização ou atomização.

[031] Opcionalmente, o extrato obtido poderá ser triturado, novamente, a fim de obter um pó homogêneo em termos de granulometria.

[032] De acordo com um desses aspectos, o processo de acordo com a presente invenção ocorre em parte à temperatura ambiente. Por temperatura ambiente, entende-se uma temperatura compreendida entre 5 e 25°C.

[033] De acordo com outro desses aspectos, o processo de acordo com a presente invenção ocorre em parte a uma temperatura compreendida entre 4 e 10°C, a fim de evitar os desenvolvimentos microbianos.

[034] Esse processo difere da maior parte dos processos descritos na arte anterior devido à ausência de uma etapa que implica uma precipitação do extrato de algas. Ele se distingue igualmente dos processos anteriores de extração pela ausência do uso de solventes, em particular orgânicos, o que representa uma vantagem significativa do ponto de vista ecológico.

[035] De acordo com outro desses aspectos, a presente invenção trata de um extrato de algas suscetível de ser obtido pelo processo tal como descrito anteriormente.

[036] De acordo com outro desses aspectos, a presente invenção trata de um extrato de algas tal como definido acima suscetível de ser obtido pelo processo tal como descrito anteriormente.

[037] De acordo com um desses aspectos, a presente invenção trata igualmente de uma composição farmacêutica que compreende um extrato de algas tal como descrito anteriormente bem como menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[038] De acordo com um desses aspectos, a presente invenção trata igualmente de um extrato de algas tal como descrito anteriormente para seu uso como medicamento.

[039] De acordo com um desses aspectos, a presente invenção trata igualmente de um extrato de algas para seu uso na prevenção e/ou o tratamento de distúrbios neurológicos, da depressão, do estresse, da ansiedade, como agente que permite melhorar a memória, em particular, na prevenção e/ou o tratamento do envelhecimento ou da doença de Alzheimer, na prevenção e/ou o tratamento das dores crônicas neuropáticas e inflamatórias, da dor cutânea (da pele, dos tecidos subcutâneos e órgãos associados) ou somática.

[040] De acordo com outro desses aspectos, a presente invenção trata igualmente do uso de um extrato de algas tal como descrito anteriormente como medicamento.

[041] De acordo com um desses aspectos, a presente invenção trata igualmente do uso de um extrato de algas tal como descrito anteriormente na prevenção e/ou o tratamento de distúrbios neurológicos, da depressão, do estresse, da ansiedade, como agente que permite melhorar a memória, em particular na prevenção e/ou no tratamento do envelhecimento ou da doença de Alzheimer, na prevenção e/ou no tratamento das dores crônicas, neuropáticas e inflamatórias, da dor cutânea (da pele, dos tecidos subcutâneos e órgãos associados) ou somática.

[042] Por “distúrbios neurológicos”, entendem-se as doenças do sistema nervoso, em particular do cérebro. Entre essas doenças, podem ser citadas, em particular, as patologias do cérebro como a doença de Parkinson, a esclerose em placas, a doença de Alzheimer, as demências, as enxaquecas, as cefaleias.

[043] Por “depressão”, entende-se um distúrbio do humor caracterizado essencialmente por um estado de perda de motivação ou de impulso vital no indivíduo, associado ou não a diferentes sintomas. Os sintomas mais característicos são uma perda de esperança, de vontade, de autoestima. Outros sinais podem ocorrer, tais como a fadiga, a tristeza, pensamentos negativos, pensamentos sombrios, intenções suicidas, ansiedade ou angústia e, em certos casos extremos, alucinações.

[044] O termo depressão é encontrado sob as denominações “distúrbio depressivo recorrente”, “depressão nervosa”, “depressão clínica”, “depressão unipolar”, “episódio depressivo maior e caracterizado” ou ainda “síndrome depressiva”. A denominação “as depressões” designa o conjunto dos tipos de depressão. Os termos “depressividade” ou “sentimento depressivo” também são utilizados. A linguagem comum usa igualmente o termo “deprê” que designa sinais similares, mas mais atenuados.

[045] Por “estresse”, entende-se o conjunto das respostas de um organismo submetido a pressões ou tensões por parte de seu ambiente. Essas respostas dependem sempre da percepção que o indivíduo tem das pressões que experimenta. Trata-se de uma sequência complexa de eventos que provocam respostas fisiológicas e psicossomáticas.

[046] Por “ansiedade”, entende-se um estado psicológico e fisiológico caracterizado por componentes somáticos, emocionais, cognitivos e comportamentais. Na ausência ou na presença de estresse psicológico, a ansiedade pode criar sentimentos de medo, inquietação, dificuldade e temor. A ansiedade é considerada uma reação normal em uma situação estressante. Quando a ansiedade se torna excessiva, ela pode ser classificada sob a denominação de “distúrbio da ansiedade”.

[047] Assim, um extrato de algas de acordo com a presente invenção pode ser utilizado tanto em aplicações veterinárias como, por exemplo, para prevenir e/ou tratar o estresse nos animais de criação e de companhia ou como agente antidepressivo para animais de criação ou animais de companhia, quanto em aplicações destinadas ao ser humano, por exemplo, por meio de complementos alimentares com vistas para a saúde sem efeitos secundários ou de um medicamento para, por exemplo, prevenir e/ou tratar os distúrbios ligados ao estresse, à ansiedade, à depressão, bem como agente que permite melhorar a memória, em particular nos estudantes, para combater o envelhecimento ou ainda no contexto do tratamento da doença de Alzheimer.

[048] Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis são escolhidos de acordo com a forma farmacêutica e o modo de administração desejado, entre os excipientes habituais que são conhecidos do técnico no assunto.

[049] Nas composições farmacêuticas da presente invenção para a administração oral, sublingual, subcutânea, intramuscular, intravenosa, tópica, local, intratraqueal, intranasal, transdérmica ou retal, o extrato de algas tal como definido acima, pode ser administrado em forma de doses unitárias, em mistura com excipientes farmacêuticos clássicos, nos animais e nos seres humanos, para a prevenção ou o tratamento dos distúrbios precitados.

[050] As formas de administração apropriadas compreendem as formas por via oral tais como que os comprimidos, as gélulas moles ou duras, os pós, os grânulos e as soluções ou suspensões orais, as formas de administração sublingual, bucal, intratraqueal, intraocular, intranasal, por inalação, as formas de administração tópica, parenteral tal como transdérmica, subcutânea, intramuscular ou intravenosa, as formas de administração retal e os implantes. Para a aplicação tópica, podem ser usados os compostos de acordo com a presente invenção em cremes, géis, pomadas ou loções.

[051] Quando uma composição sólida em forma de comprimidos é preparada, o ingrediente ativo principal pode ser misturado com um veículo farmacêutico, tal como a gelatina, o amido, a lactose, o estearato de magnésio, o talco, a goma arábica ou análogos.

[052] Os comprimidos podem igualmente ser revestidos com sacarose, um derivado celulósico, ou outras substâncias apropriadas ou, ainda, podem ser tratados de tal forma que tenham uma atividade prolongada ou retardada e que liberem de uma forma contínua uma quantidade predeterminada de princípio ativo.

[053] Uma preparação em forma de gélulas pode, por exemplo, ser obtida misturando o ingrediente ativo com um diluente e vertendo a mistura obtida em gélulas moles ou duras.

[054] As composições farmacêuticas que contêm um extrato de algas de acordo com a presente invenção podem também se apresentar em forma líquida, por exemplo, em forma de soluções, de emulsões, de suspensões ou de xaropes e, em particular, em uma forma apropriada para uma administração oral ou intranasal, por exemplo. Os suportes líquidos apropriados podem ser, por exemplo, água, solventes orgânicos tais como o glicerol ou os glicóis, bem como que suas misturas, em proporções variadas, na água.

[055] Uma preparação em forma de xarope ou de elixir ou para a administração em forma de gotas pode igualmente conter o ingrediente ativo conjuntamente com um edulcorante, acalórico, por exemplo, metilparabeno e propilparabeno como antisséptico, bem como um agente que confere sabor e um colorante apropriado.

[056] Os pós ou os grânulos dispersíveis na água podem, por exemplo, conter o ingrediente ativo em mistura com agentes de dispersão ou agentes molhantes, ou agentes de colocação em suspensão, como a polivinilpirrolidona, bem como com edulcorantes ou corretores de sabor.

[057] A dose administrada por dia pode atingir no homem de 0,5 a 25 mg/kg, em uma ou mais vezes, em particular de 1,5 a 18 mg/kg, e mais particularmente ainda de 3 a 15 mg/kg. A dose administrada por dia pode atingir no animal de 5 a 150 mg/kg, em uma ou mais vezes, em particular de 10 a 100 mg/kg e mais particularmente ainda de 20 a 80 mg/kg. Em geral, a dose diária do extrato de algas de acordo com a presente invenção será a dose eficaz mais baixa do extrato de algas capaz de produzir um efeito terapêutico.

[058] Por “dose eficaz”, entende-se qualquer quantidade de uma composição que melhore um ou mais dos parâmetros característicos da doença ou do distúrbio a ser tratado.

[059] Pode haver casos particulares em que dosagens mais elevadas ou mais baixas sejam apropriadas; tais dosagens não saem do contexto da presente invenção. De acordo com a prática habitual, a dosagem apropriada a cada paciente, humano ou animal, é determinada pelo médico ou pelo veterinário de acordo com o modo de administração, o peso e a reposta do referido paciente.

[060] De acordo com outro de seus aspectos, um extrato de algas de acordo com a presente invenção pode ser utilizado para a prevenção e/ou o tratamento das patologias precitadas em uma composição alimentar.

[061] Por “composição alimentar”, entende-se, por exemplo, qualquer tipo de alicamento, de produtos alimentares na forma de iogurte ou bebida, láctea em particular, qualquer tipo de matéria prima, aditivo ou auxiliar tecnológico, em forma de pré-misturas, medicamentosas ou não, destinadas a ser incorporadas nos alimentos, qualquer tipo de alimentos integrais ou complementares, destinados ao homem ou ao animal.

[062] A presente invenção, de acordo com outro desses aspectos, trata igualmente de um método de tratamento das patologias indicadas acima que compreende a administração, em um paciente, de uma dose eficaz de um extrato de algas de acordo com a presente invenção.

[063] A presente invenção será ilustrada mais detalhadamente pelas figures e exemplos a seguir que não limitam seu alcance. FIGURAS Figura 1: Espectro RMN 1H de um extrato de algas (EA) de acordo com a presente invenção Figura 2: Cromatograma obtido com o extrato de algas de acordo com a presente invenção separada em duas colunas shodex 802 e 803 Figura 3: Cromatograma obtido após análise de derivados trimetilsililados da amostra do extrato de algas de acordo com a presente invenção por cromatografia em fase gasosa. Com Ara: Arabinose; Gal: Galactose; Glc: Glicose; Xil: Xilose; Man: Manose; Rha: Ramnose, GIcA: Ácido glicurônico Figura 4: Efeitos do EA sobre o número de entradas nos braços abertos no teste do labirinto em cruz elevado Figura 5: Efeitos do EA sobre o tempo passado nos braços abertos no teste do labirinto em cruz elevado Figura 6: Efeitos do EA sobre o número total de apoios acumulados sobre as duas alavancas no teste de aprendizagem da evitação de um estímulo luminoso aversivo Figura 7: Efeitos do EA sobre o número total de apoios sobre as alavancas ativa (A) e inativa (I) a 5 minutos no teste de aprendizagem do TESLA Figura 8: Efeitos do EA sobre o número total de apoios sobre as alavancas ativa (A) e inativa (I) a 10 minutos no teste de aprendizagem do TESLA Figura 9: Efeitos do EA sobre o número total de apoios sobre as alavancas ativa (A) e inativa (I) em 15 minutos no teste de aprendizagem do TESLA Figura 10: Efeitos do EA sobre o número total de apoios sobre as alavancas ativa (A) e inativa (I) em 20 minutos no teste de aprendizagem do TESLA Figura 11: Efeitos do EA sobre a duração de imobilidade(s) no pré-teste do desespero comportamental no D14 (s, Média ± ESM) Figura 12: Efeitos do EA sobre a duração de imobilidade(s) no teste de desespero comportamental no D15 (s, Média ± ESM) EXEMPLOS EXEMPLO 1 PREPARAÇÃO DE UM EXTRATO DE ALGAS DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO

[064] Uma tonelada de algas verdes de tipo Ulva, frescas, brutas, são lavadas com água doce e desareadas a por meio de uma máquina de lavar as algas.

[065] Salvo indicações contrárias, as etapas do processo são realizadas à temperatura ambiente.

[066] As algas (1 tonelada de algas escorridas a 8% de matéria seca) são, em seguida, trituradas em finas partículas por meio de um refinador industrial (marca Inotec tipo "I 175CDI-75D"). Por “finas partículas”, entendem- se partículas cujo tamanho está compreendido entre 50 e 1000 nm, com duas populações, a primeira cujos tamanhos estão compreendidos entre 50 e 200 nm, a segunda cujos tamanhos estão compreendidos entre 600 e 1000 nm.

[067] O triturado é, em seguida, prensado por meio de uma prensa de banda industrial de marca Flottweg tipo "B FRU 800 HK" a um vazão de aproximadamente 1 tonelada/hora.

[068] Essa etapa permite a separação da fase sólida (bagaço) da fase líquida (sumo). O rendimento de sumo obtido é de 75%.

[069] Os 750 kg de sumo bruto obtidos são, em seguida, clarificados por meio de um clarificador de placas de marca Flottweg tipo "AC 2000".

[070] São obtidos assim 710 kg de um sumo claro a 3.10% de massa seca (95 a 98% de rendimento de massa) e um creme (2 a 5% em massa).

[071] Em seguida, o sumo claro é ultrafiltrado sobre uma membrana cerâmica (Tami Industries) de 15 kDa.

[072] São obtidos assim um permeado e um retentado. O permeado é conservado até a obtenção de 640 kg de sumo de filtração (91% de rendimento de volume) a 2,2% de matéria seca.

[073] O sumo de filtração (permeado) e então secada por liofilização após concentração por evaporação.

[074] A concentração é realizada em um evaporador de simples efeito (EVA 1000, Pignat) com os seguintes parâmetros: recirculação forçada, vazão de alimentação 10L/h, pressão de vapor de 1 bar, pressão de vácuo de 0,3 bar e temperatura de evaporação de 90°C.

[075] Uma primeira concentração é realizada com um vazão de água evaporada de 8 L/h e o °brix sobe de 5,5 igual a uma concentração de matéria seca de 4,5%) a 14,7.

[076] Essa solução é, em seguida, concentrada uma segunda vez com uma vazão de água evaporada de 5-6 L/h e o °brix sobe até 34. A concentração de matéria seca da solução é determinada a 38,4%.

[077] A liofilização é, em seguida, realizada por meio de um aparelho Bioblock científico (modelo CHRIST alpha 1-4 LSC) a uma temperatura de congelamento de -80°C que é igualmente a temperatura mínima durante essa etapa.

[078] O pó obtido é, em seguida, triturado com um triturador planetário MiniMill de marca Philips. O foi introduzido em recipientes de trituração (10 g de produto em cada recipiente de trituração com 4 esferas de zircônia). O conjunto foi posto em rotação durante 15 minutos à velocidade 10.

[079] São obtidos assim 14 kg de pó de extrato de algas. EXEMPLO 2 DETERMINAÇÃO DO TAMANHO DOS POLISSACARÍDEOS POLIANIÔNICOS SULFATADOS E NÃO SULFATADOS DE UM EXTRATO DE ALGAS DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO POR GPC (CROMATOGRAFIA POR PERMEAÇÃO DE GEL)

[080] O extrato de algas de acordo com a presente invenção e preparado de acordo com o exemplo 1 é ultrafiltrado sobre uma membrana de 1000 Da e é dissolvido a uma concentração de 0,5 g/L em água. Ele é depois injetado em duas colunas shodex 802 e 803 colocadas em série (campo de fracionamento da coluna 802: 4.103 Da e da coluna 803: 1,7.105 Da). O eluente utilizado é o nitrato de sódio 0,1 M com azoteto de sódio 0,2% a uma vazão de 0,5 ml/min. A detecção é realizada por meio um refratômetro Wyatt e um detector de difusão da luz 18 ângulos Wyatt. Os dn/dc são tomados iguais a 0,150 mL/g.

[081] O cromatograma detectado pelo refratômetro é apresentado na Figura 2.

[082] É obtido um tamanho médio dos polissacarídeos de um extrato de algas de acordo com a presente invenção de 4,4 KDa. EXEMPLO 3 DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO DE UM EXTRATO DE ALGAS DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO

[083] O extrato de algas de acordo com a presente invenção e preparado de acordo com o exemplo 1 é purificado por ultrafiltração frontal em células amicon que funcionam sob agitação. Uma membrana de celulose regenerada de limiar de corte de 1000 Da é utilizada. 572,1 mg de amostra do extrato de algas de acordo com a presente invenção são dissolvidos 150 ml de água ultrapure milli-Q. Cinco litros de água são utilizados para eliminar todas as moléculas de massa inferior a 1000 Da. O retentado é liofilizado. 117 mg de amostra são pesados. O rendimento da ultrafiltração é, portanto, de 20,5% (p/p). As seguintes análises foram efetuadas nas amostras ultrafiltradas.

[084] A razão dos monossacarídeos constitutivos dos polissacarídeos do extrato de algas de acordo com a presente invenção é determinada de acordo com o método de Kamerling (Kamerling et al., 1975) modificado por Montreuil (Montreuil et al., 1986). A identificação e a dosagem dos monossacarídeos requerem uma hidrólise por metanólise do polímero, de forma a obter apenas monômeros. Os resíduos glicosídicos são, em seguida, trimetilsililados a fim de torná-los voláteis. Eles são assim identificados e dosados por cromatografia em fase gasosa em forma de metilglicosídeos Otrimetilsililados.

[085] Os seguintes reagentes são utilizados: - Solução de metanol/HCI 3N (Supelco); - Carbonato de prata; - Mio-inositol; - Piridina; - Reagente Sylon BFT (BSTFA +TMCS 99:1) (Supelco); e Diclorometano.

[086] O modo operatório é o seguinte: 400 μg do extrato de algas de acordo com a presente invenção preparado tal como mencionado acima e 50 μg de mio-inositol são postos em um banho a seco em presença de 500 μl de um mistura metanol/ácido clorídrico 3 N (Supelco) durante 4 horas a 100°C. Após resfriamento a temperatura ambiente, o metanolisado é neutralizado por meio de carbonato de prata. As amostras são centrifugadas 15 minutos a 3000 tr/min e o sobrenadante é evaporado sob jato de nitrogênio. Os compostos são, em seguida, dissolvidos em 80 μl de piridina e incubados durante 25 minutos a 80°C com 80 μl de sylon (BSTFA: TMCS, 99: 1, Supelco). Após evaporação suave dos reagentes em excesso sob jato de nitrogênio, os metilglicosídeos trimetilsililados são recuperados em 500 μl de diclorometano e depois injetados em cromatografia em fase gasosa (injeção in-coluna, detector FID: ionização de chama). O gás vetor é o nitrogênio. A coluna, de tipo HP-5MS (30 m, 0,25 mm de diâmetro interno), é apolar. O programa de subida de temperatura é o seguinte: 120°C mantidos durante 1 minuto e, em seguida, um gradiente de 1.5°C/min até 180°C, seguido de um gradiente de 2°C/min até 200°C.

[087] Cada monossacarídeo é identificado por comparação de seus tempos de retenção relativos em relação ao padrão interno, com os dos monossacarídeos puros tratados nas mesmas condições. Um coeficiente de reposta é calculado para cada monossacarídeo em relação do padrão interno a fim de definir a proporção de cada monossacarídeo no interior dos polissacarídeos do extrato de algas de acordo com a presente invenção.

[088] Os resultados obtidos são apresentados na tabela 1 a seguir e na Figura 3. TABELA 1 COMPOSIÇÃO DO EXTRATO DE ALGAS DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO OBTIDA APÓS ANÁLISE DE DERIVADOS TRIMETILSILILADOS POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA, EXPRESSA EM PESO EM RELAÇÃO AO PESO TOTAL DO EXTRATO DE ALGAS; COM ARA: ARABINOSE; GAL: GALACTOSE; GLC: GLICOSE; XIL: XILOSE;

EXEMPLO 4 AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO EXTRATO DE ALGA (EA) TRAVÉS DE UMA BATERIA FUNCIONAL DE TESTES E DE TESTES COMPLEMENTARES (OPENFIELD, LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO, TESTES DE EVITAÇÃO DE UM ESTÍMULO AVERSIVO)

[089] Os efeitos de um extrato de alga de acordo com a presente invenção (EA) administrado por via oral às doses de 20, 40 e 80 mg/kg durante 14 dias foram avaliados em ratos machos Wistar adultos.

[090] Os efeitos do EA foram avaliados em grupos de 6 ratos em relação a um lote de controle tratado com o veículo (água de fonte através de uma bateria funcional de testes (FOB). Testes complementares, o openfield, o labirinto em cruz elevado e o teste de evitação de um estímulo luminoso aversivo, foram realizados para completar a avaliações dos efeitos do EA.

[091] Os ratos utilizados foram tratados de acordo com as regras éticas promulgadas pela ASAB e pelo Conselho Canadense de Proteção dos Animais. Equipamentos e métodos Animais

[092] Vinte e quatro (24) ratos machos Wistar CrhWI (Han) (Charles River Laboratories, 69-StGermain em ArbresIe, França) com 60 dias foram utilizados. À recepção, os ratos foram marcados e distribuídos por grupos de 2 em gaiolas em policarbonato de tipo F (48 x 27 x 20 cm, U.A.R., 91 - Epinay-Sur-Orge, França). Os animais foram estabulados em um animalário climatizado, a uma temperatura de 22 ± 2°C e uma higrometria de 50 ± 20%. Os ratos dispunham de alimentação padrão 2016 (Mucedola para Harlan, Milan, Itália) e de bebida ad libitum e foram submetidos a um ciclo luz- escuridão invertido de 12 horas (luz de 20h a 08h).

[093] Após uma familiarização de uma semana nas condições do laboratório, os ratos foram pesados e distribuídos ao acaso em 4 grupos de tratamentos (n = 6).

[094] A fim de evitar as eventuais interferências entre os diversos produtos, todos os ratos de uma mesma gaiola receberam o mesmo tratamento. Os ratos dos diferentes grupos foram todos manipulados da mesma maneira e nas mesmas condições. Teste da FOB Nesse teste, forma utilizados os seguintes equipamentos: - uma gaiola de observação transparente; - um dispositivo de suspensão; - um dispositivo de preensão; - um openfield para a atividade locomotora e exploratória; - um aparelho de estimulação auditiva que emite um estímulo sonoro padrão; - um bisturi para diversas estimulações táteis; - um termômetro digital.

[095] O teste da FOB foi realizado às cegas antes da administração do produto (T0) e após um período de 14 dias de tratamento (T14) por via oral nas doses de 20, 40 e 80 mg/Kg.

[096] O teste comportou três fases de observação: - uma fase de observação direta durante a qual o animal não era incomodado; - uma fase de observação ativa durante a qual o animal era manipulado; - uma fase consagrada à avaliação das reações comportamentais dos animais após testes de reatividade.

[097] As variáveis registradas foram as seguintes: - Efeitos comportamentais: atividade locomotora espontânea, distúrbios do comportamento locomotor, reação de esquiva ao toque, irritabilidade, comportamentos de agressividade e de bloqueio (paralisação) provocados, sonolência, micção e defecação, respostas sensomotoras (fixação visual, pinçamento da pata, pinçamento do rabo e reação a um estímulo sonoro). - Efeitos neurológicos: resposta pupilar, reflexo palpebral, elevação pélvica, posição do rabo, tonicidade muscular dos membros e do abdômen, teste de retorno do decúbito dorsal ao decúbito ventral, teste de preensão, tremores e piloereção. - Efeitos fisiológicos: salivação, lacrimação, diarreia, temperatura retal, ritmo cardiorrespiratório. - Mortalidade.

[098] Foram realizados os seguintes testes após as duas semanas de administração dos produtos: Teste do labirinto em cruz elevado (LCS)

[099] O dispositivo experimental, em forma de cruz, é elevado a 80 cm acima do chão. Ele compreende quatro braços de 50 cm de comprimento e de 15 cm de largura. Dois braços opostos são fechados por paredes verticais de 40 cm de altura, e os outros estão abertos sobre o vácuo e, por esse motivo, representam localizações ansiogênicas. No dia 18, uma hora após a administração do tratamento, o animal foi colocado no centro da cruz do dispositivo e pôde acessar livremente o conjunto dos quatro braços. O comportamento do animal foi registrado por meio do sistema ANYMAZE durante 5 minutos. As variáveis estudadas nesse teste foram o número de entradas nos braços abertos, bem como o tempo passado nesses braços abertos. Um pequeno número de entradas e um tempo curto passado nos braços abertos são considerados como índices de ansiedade (Lister, 1987). Teste de evitação de um estímulo luminoso aversivo (TESLA)

[0100] Esse modelo usa a aversão do rato para um ambiente fortemente iluminado. O rato aprende a controlar seu ambiente luminoso aversivo no contexto de um condicionamento operante apoiando sobre uma alavanca ativa para obter períodos de escuridão de 30 segundos como reforço positivo.

[0101] O dispositivo experimental consiste em uma gaiola isolada (50 x 40 x 37 cm), fortemente iluminada e que comporta duas alavancas: uma ativa, que permite, quando é acionada, obter 30 segundos de escuridão seguidos do retorno da luz, ao passo que a outra alavanca é inativa (não desencadeia um reforço positivo). Os apoios sobre a alavanca ativa, durante o período de escuridão, não proporcionam períodos de escuridão adicionais. O rato é colocado na gaiola durante 20 minutos e o número de apoios sobre cada alavanca é contabilizado durante a experimentação.

[0102] A bateria de teste, composta de 4 dispositivos de condicionamento, é totalmente automatizada e comandada por computador. Assim, nenhum experimentador está presente na peça durante o teste.

[0103] Após 18 dias de administração dos produtos a ser testados, os ratos foram testados no plano cognitivo para a aquisição de uma aprendizagem no contexto de um condicionamento operante no modelo do TESLA.

[0104] As variáveis registradas foram os números totais de apoios sobre alavancas ativa (A) e inativa (I) e os números de apoios sobre cada uma das duas alavancas durante a fase de luz.

[0105] Os números de apoios ativos e inativos permitiram a avaliar o nível da atividade manipulatória durante a sessão de teste. A aquisição da aprendizagem (discriminação entre as duas alavancas) foi avaliada comparando os números de apoios sobre cada um das duas alavancas durante a fase de luz (A vs. Ll).

PRODUTO

[0106] O produto é um EA (Extrato de algas) em forma de pó que representa uma fração concentrada liofilizada e triturada de um extrato hidrossolúvel de algas preparado de acordo com o exemplo n°1. O EA é dissolvido em água de fonte e administrado por via oral 60 minutos antes do teste da FOB e testes comportamentais complementares por meio de uma sonde de alimentação intragástrica.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

[0107] O teste de KrusKal-Wallis foi aplicado, seguido, no caso de heterogeneidade, de comparações por meio do teste U de Mann-Whitney para comparar os grupos tratados com o grupo de controle.

[0108] O teste de Wilcoxon foi usado para as comparações duas a duas das medidas repetidas da FOB, entre T0 e T14 em cada um dos grupos e para a discriminação entre as duas alavancas do TESLA em termos de luz.

[0109] Os tratamentos estatísticos e gráficos foram realizados por meio do software StatvieW 5 (SAS Institute, Inc., USA).

RESULTADOS Teste da FOB

[0110] Comparações dos grupos tratados com o grupo veículo nos FOB a T0 e T14

[0111] Na FOB a T0, antes da administração do tratamento, os resultados de todos os grupos de ratos estudados são homogêneos (Tabela 2, Tabela 3).

[0112] Nos testes da FOB a T14 (após 14 dias de administração dos tratamentos), o teste de KrusKal-Wallis mostrou uma homogeneidade dos resultados em relação a numerosas variáveis entre os diferentes grupos de tratamentos (Tabela 2).

[0113] Em compensação, em certas variáveis estudadas, o EA, em certas doses, mostrou efeitos significativos em comparação com o veículo (Tabela 3).

[0114] As principais variáveis modificadas pela administração diária do EA durante suas semanas são: - O comportamento os ratos e sua atividade locomotora espontânea na gaiola de habitação: os ratos tratados com 3 doses são mais ativos e mais alertas, - O comportamento dos ratos na gaiola de observação: nesse caso igualmente, os ratos são mais ativos e mais alertas nas 2 doses mais fortes, - Interesse por um objeto apresentado: nas 3 doses, o EA parece ter um efeito estimulante sobre a curiosidade dos ratos e seu interesse pela novidade (aumento da atividade exploratória, hedonismo, efeito antidepressivo), - As reações de fuga dos ratos à aproximação de um dedo ou ao toque são significativamente diminuídas pelo EA nas 3 doses, o que decorre de um efeito antiestresse /ansiolítico do EA, - as reações ao pinçamento da cauda e ao pinçamento da pata são igualmente diminuídas de forma significativa nas 3 doses. Essas diminuições de reação decorrem de um efeito antiestresse /ansiolítico do EA e/ou de um efeito antálgico, - As frequências cardíaca e respiratória dos ratos parecem menos elevadas nos ratos tratados com o EA nas 3 doses, decorrem de um efeito antiestresse /ansiolítico do EA, - A agitação, o nervosismo e a irritabilidade dos ratos diminuíram significativamente com a administração do EA nas 2 doses mais fortes, decorrem de um efeito calmante, antiestresse e/ou antiagressividade. TABELA 2

[0115] Comparações das diferentes variáveis repetidas entre as FOB a TO e T14

[0116] A administração diária de EA em certas doses, durante 14 dias, parece ter um efeito sobre certas variáveis principais estudadas (Tabela 4): - O comportamento dos ratos e sua atividade locomotora espontânea na gaiola de observação aumentaram de forma significativa com EA nas 3 doses (efeito estimulante ou efeito antiestresse), - A latência do deslocamento dos ratos de controle na arena de observação aumenta e sua atividade locomotora (casas atravessadas) diminui, enquanto nos ratos tratados com o EA essas variáveis permanecem estáveis entre as FOB T0 e T14 (efeitos antiestresse e antidepressivo), O interesse para um objeto apresentado: à dose de 20 mg/Kg, PO (oralmente), o EA estimula o interesse dos ratos para um objeto-estímulo que lhe é apresentado (motivação para a exploração da novidade, hedonismo: efeitos antiestresse e antidepressivo), - O número de casas atravessadas em uma ramificação aberta: em comparação ao EA não diminui o número de casas atravessadas em uma ramificação aberta (efeito antiestresse), - As reações de fuga à aproximação de um dedo: o EA, nas 3 doses, diminui a reação de fuga à aproximação do dedo do experimentador (efeito antiestresse), - A reação ao pinçamento do rabo aumenta no rato de controle, enquanto que com 20 mg/Kg de EA ela diminui (efeito antiestresse e/ou efeito antálgico), - A reação ao pinçamento de uma pata traseira diminui com o EA, nas 3 doses (efeito antiestresse e/ou efeito antálgico), - A reação de sobressalto a um estímulo sonoro diminui significativamente nas doses de EA de 40 e 80 mg/Kg (efeitos calmante e antiestresse), - As frequências cardíaca e respiratória diminuem com EA nas doses de 20 e 40 mg/Kg (efeitos calmante e antiestresse), - A agitação, o nervosismo e a irritabilidade: à forte dose de 80 mg/Kg, o EA mostra um efeito positivo sobre a agitação, o nervosismo e a irritabilidade dos ratos (efeitos calmante, antiestresse e/ou antiagressividade). TABELA 4

N.S.: Não significativo entre T0 e T14 N Diminui entre TO e T14 ^ Aumenta entre TO e T14 *: P < 0,05; #: P < 0,10 (tendência) TESTE DO LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO (LCS) [O117] No teste do labirinto em cruz elevado, após 18 dias de tratamento diário, o EA, nas doses de 20, 40 e 80 mg/Kg, PO, aumenta significativamente o número de entradas (Tabela 5, Figura 4) bem como o tempo passado (Tabela 6, Figura 5) dos ratos tratados nos braços abertos, demonstrando uma atividade antiestresse do EA.

TESTE DE EVITAÇÃO DE UM ESTÍMULO LUMINOSO AVERSIVO (TESLA)

[0118] Após 18 dias de administração diária do EA, o teste de KrusKal-Wallis mostrou que o número total de apoios acumulados sobre as duas alavancas (alavanca ativa+alavanca inativa) dos ratos dos diferentes grupos de tratamentos são homogêneas após 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos e a 20 minutos (Figura 6).

[0119] No teste de evitação de um estímulo luminoso aversivo, no fim dos 5 primeiros minutos de teste, após 18 dias de administração do EA, os ratos tratados à dose de 20 mg/Kg, PO, tendem a discriminar a alavanca ativa da alavanca inativa (Figura 7).

[0120] No fim do período de 10 minutos de teste, os ratos tratados com o EA com a dose de 40 mg/Kg, PO, discriminam significativamente a alavanca ativa da alavanca inativa e os tratados nas doses de 20 e 80 mg/Kg, PO, tendem a operar uma discriminação entre as duas alavancas. Não é o caso dos ratos de controle que não mostram nenhuma tendência à discriminação (Figura 8).

[0121] No fim do período de 15 minutos de teste, os ratos tratados com o EA nas doses de 20 e 40 mg/Kg, PO, discriminam significativamente a alavanca ativa do alavanca inativa. Os ratos tratados com a dose de 80 mg/Kg, PO, não discriminam mais as duas alavancas. Os ratos de controle continuam a não mostrar discriminação nesse estágio do teste de aprendizagem (Figura 9).

[0122] No fim do período de 20 minutos de teste, os ratos tratados a o EA nas doses de 20 e 40 mg/Kg, PO, continuam a discriminar significativamente a alavanca ativa do alavanca inativa. Os ratos tratados com a dose de 80 mg/Kg, PO, não mostram mais discriminação e os ratos de controle começam a mostrar um início de discriminação (Figura 10).

[0123] Esses resultados mostram a eficácia do EA sobre a aquisição de uma aprendizagem e, em particular, nas doses de 20 e 40 mg/Kg, PO. DADOS FISIOLÓGICOS E DE INOCUIDADE

[0124]A administração do EA, em qualquer dose, não mostrou uma influência sobre o peso dos ratos tratados diariamente nas doses de 20, 40 ou 80 mg/Kg, PO, nem sobre suar ingestão alimentar. Nenhuma foi detectada nos animais tratados a o EA nas doses de 20, 40 e 80 mg/Kg/j, PO, durante 21 dias. CONCLUSÃO

[0125]A administração de um extrato de algas de acordo com a presente invenção demonstra efeitos neurológicos do produto, em particular atividades antistresse/ansiolíticas, antidepressiva, antálgica, bem como uma atividade de aquisição precoce da aprendizagem e da facilitação da memória. EXEMPLO 5 AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO EXTRATO DE ALGA (EA) ATRAVÉS DO TESTE DE DESESPERO COMPORTAMENTAL

[0126] Os efeitos antidepressivos de um extrato de alga de acordo com a presente invenção (EA), administrado por via oral em tratamento preventivo em 3 doses (10, 20 e 40 mg/kg/j) foram avaliados em ratos machos Wistar adultos no teste do desespero comportamental (TDC).

[0127] O extrato foi administrado diariamente em tratamento semcrônico durante 14 dias. Os efeitos do extrato foram avaliados no TDC em grupos de 12 ratos em relação a um lote de controle tratado com o veículo (água de fonte) e um lote de referência tratado com Nmipramina à dose de 10mg/kg/j.

[0128] Os ratos utilizados foram tratados de acordo com as regras éticas promulgadas pelo ASAB e o Conselho Canadense de Proteção dos Animais. Equipamentos e métodos ANIMAIS

[0129] Sessenta ratos machos Wistar (Charles River Laboratories, França) que pesam 200-225 g foram utilizados. Na recepção os ratos foram marcados e distribuídos por grupos de 4 em gaiolas em policarbonato de tipo F (48 x 27 x 20 cm, U.A.R., 91 - Epinay-Sur-Orge, França). Os animais foram estabulados em um animalário climatizado, a uma temperatura de 22 ± 2°C e uma umidade relativa de 50 ± 20%. Os ratos dispunham de alimentação padrão 2016 (Harlan, Gannat, França) e de bebida ad libitum. Eles foram submetidos a um ciclo luz-escuridão invertido de 12 horas.

[0130] Após uma familiarização de uma semana nas condições do laboratório, os ratos foram pesados e randomizados em função de seu peso em 5 grupos de tratamentos (n = 12/grupo). Grupos de tratamento: Groupe de Controle: tratamento com água de fonte (Veí), Grupo Imipramina: tratamento com Nmipramine à dose de 10 mg/kg/j (Imi), - Grupo EA 10: tratamento com o EA à dose de 10 mg/kg/j (EA 10), - Grupo EA 20: tratamento com o EA à dose de 20 mg/kg/j (EA 20), - Grupo EA 40: tratamento com o EA à dose de 40 mg/kg/j (EA 40). A fim de evitar as eventuais interferências entre os diferentes tratamentos, todos os ratos de uma mesma gaiola receberam a mesma dose de EA. Os ratos dos diferentes grupos foram todos manipulados da mesma maneira e nas mesmas condições.

TESTE DO DESESPERO COMPORTAMENTAL (TDC)

[0131] Os dispositivos experimentais consistiam de cilindros de Plexiglas de 50 cm de altura e de 20 de diâmetro cheios de água a 25°C até uma altura de 30 cm.

[0132] Após 13 dias de tratamento diário com os produtos a ser testados, os ratos foram colocados no D14, nos dispositivos por uma duração de 15 minutos para avaliar o tempo de imobilidade de cada animal. Imediatamente após esse primeiro teste, os ratos receberam seu 14° tratamento.

[0133] No D15, os ratos receberam dois tratamentos: o primeiro, 5 horas antes do teste e o segundo 1 hora antes do teste. Esse procedimento é habitualmente utilizado na literatura para testar a eficácia de um produto contra a depressão. O teste foi realizado nas mesmas condições que na véspera por uma duração de 5 minutos.

[0134] A duração de imobilidade registrada durante os 5 primeiros minutos dos dois testes (a J14 e J15) reflete a capacidade do animal de se resignar quando se defronta com uma situação da qual não pode escapar. Ce comportamento de resignação é comparado à depressão.

PRODUTO

[0135] O produto é um EA (Extrato de algas) em forma de pó que representa uma fração concentrada liofilizada e triturada de um extrato hidrossolúvel de algas preparado de acordo com o exemplo n°1. O extrato a ser testado foi dissolvido em água de fonte e foi administrado nos ratos por via oral em uma das 3 doses testadas durante 14 dias sucessivos com um volume de administração de 5 ml/kg. Todos os animais foram pesados de dois ou de três dias a fim de adaptar seus tratamentos específicos a seus peso. Suas ingestões alimentar e hídrica foram anotadas de dois ou três dias no decorrer de toda a duração do estudo.

[0136] Os animais do grupo de Referência receberam diariamente 10 mg/kg/j de Cloridrato de Imipramina (Sigma Aldrich) dissolvido em água de fonte com um volume de administração de 5 ml/kg.

[0137] Les animais do grupo Veículo receberam diariamente água de fonte com um volume de administração de 5 ml/kg.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

[0138] Uma ANOVA em modo paramétrico foi aplicada, seguida, no caso de heterogeneidade, de comparações por meio do teste-t não pareado para comparar os grupos tratados com o grupo Veículo e com o grupo Referência.

[0139] Uma ANOVA pareada foi utilizada, seguida, no caso de uma heterogeneidade, de comparações por meio do teste-t pareado para as comparações duas a duas das medidas repetidas do TDC em cada um dos grupos.

[0140] Para as ingestões alimentar e hídrica, uma análise em modo não paramétrico foi aplicada: um teste de Kruskal-Wallis seguido, se for o caso por um teste U de Mann Whitney para comparar os grupos dois a dois.

[0141] Os tratamentos estatísticos e gráficos foram realizados por meio do software Statview5 (SAS Institute, Inc., USA). RESULTADOS

[0142] Teste de desespero comportamental: Pré-teste no D14

[0143] No D 14, no pré-teste do desespero comportamental, a ANOVA não mostrou heterogeneidade para o tempo de imobilidade dos animais dos diferentes grupos de tratamento (Tabela 7; Figura 11). Esse pré- teste permite obter a indução da resignação nos animais dos diferentes grupos de tratamento. TABELA 7

NS: não significativo. TESTE DE DESESPERO COMPORTAMENTAL NO D15

[0144] No D 15, no teste do desespero comportamental, a ANOVA mostrou uma heterogeneidade para o tempo de imobilidade dos animais dos diferentes grupos de tratamento (Tabela 8).

[0145]O teste-t não apareado mostrou que os tempos de imobilidade dos animais tratados com a Imipramina, EA 20 e EA 40 eram significativamente mais curtos que o dos animais tratados com o Veículo (t=,.69, P=0,0013; t=2.20, P=0,039 e t=3.29, P=0,003, respectivamente).

[0146]O teste-t não apareado mostrou que o tempo de imobilidade dos animais tratados com EA 20 tendia a ser significativamente mais longo que o dos animais tratados coma Imipramina (t=1,72, P=0,099) (Tabela 8; Figura 12). TABELA 8

NS: não significativo. COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS DOS TESTES NO D14 E D15

[0147] O teste-t apareado mostrou que as durações de imobilidade dos ratos tratados com a Imipramina e EA 40 diminuíram significativamente entre D14 e D15 (t=2,90, P=0,015 e t=2.42, P=0,034, respectivamente) (Tabela 9). TABELA 9 COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS DOS TESTES NO D14 E NO J15 (S, MÉDIA ± ESM)

NS: não significativo.

EVOLUÇÃO PONDERAL, INGESTÃO ALIMENTAR E HÍDRICO

[0148] Nenhum efeito do 'EA administrado nas três doses foi demonstrado no que diz respeito à evolução ponderal e as ingestões alimentar e hídrica dos animais.

TESTE DE DESESPERO COMPORTAMENTAL

[0149] No J14: durante o teste de implantação da resignação nos animais, embora que as durações de imobilidade dos animais tratados com o EA nas doses de 20 e 40 mg/kg sejam mais curtas que dos animais animais dos outros grupos, nenhuma diferença significativa foi observada entre os ratos tratados com o Veículo, a Imipramina e o EA administrado nas três doses testadas.

[0150] No D15: o efeito antidepressivo do EA administrado nas doses de 20 e 40 mg/kg a foi demonstrado pois as durações de imobilidade dos animais tratados com essas doses eram significativamente mais curtas que a dos animais tratados com o Veículo. O EA administrado à dose de 40mg/kg permitiu obter uma duração de imobilidade similar a dos animais tratados com a Imipramina a 10mg/kg. Um efeito dose-dependente foi observado nos animais tratados com o EA nas doses de 10, 20 e 40 mg/kg.

[0151]Comparação das durações de imobilidade no D14 e no D15: somente os animais tratados com a Imipramina à dose de 10 mg/kg e com o EA à dose de 40 mg/kg diminuíram significativamente suas durações de imobilidade entre D14 e D15. COMPORTAMENTO DOS ANIMAIS E INOCUIDADE DO EXTRATO DE ALGAS

[0152] Nenhum comportamento anormal do conjunto dos animais foi observado durante a experimentação para o 'EA administrado nas doses de 10, 20 e 40 mg/kg. Nenhuma toxidez foi detectada nos animais tratados com o EA nas doses de 10, 20 e 40 mg/kg/j durante 14 dias.

CONCLUSÃO

[0153] A administração de um extrato de algas de acordo com a presente invenção demonstra um efeito antidepressivo do produto.

Claims (13)

1. USO DE UM EXTRATO DE ALGAS, da ordem das Ulvales, em particular extrato de algas verdes de tipo Ulva, caracterizado por compreender polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados cujo tamanho é inferior ou igual a 50 kDa, na fabricação de um medicamento para prevenção e/ou tratamento de distúrbios neurológicos, depressão, estresse, ansiedade, ou como agente que permite melhorar notavelmente a memória para prevenção e/ou tratamento do envelhecimento ou da doença de Alzheimer, para prevenção e/ou tratamento das dores crônicas neuropáticas e inflamatórias, dor cutânea (da pele, dos tecidos subcutâneos e órgãos associados) ou dor somática.

2. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos referidos polissacarídeos compreenderem manose e/ou arabinose.

3. USO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelos referidos polissacarídeos compreenderem pelo menos 0,005% de manose e/ou pelo menos 0,005% de arabinose em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas.

4. USO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelos referidos polissacarídeos compreenderem manose em uma quantidade de 0,01 a 0,20% e arabinose em uma quantidade de 0,01 a 0,5% em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas.

5. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelos referidos polissacarídeos compreenderem ainda: - galactose; - glicose; - ramnose; - xilose; e - ácido glicurônico.

6. USO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelos referidos polissacarídeos compreenderem: - de 0,05 a 0,5% de galactose; - de 0,005 a 0,05% de glicose; - de 2 a 15% de ramnose; - de 0,1 a 1% de xilose; e - de 1 a 7% de ácido glicurônico; em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas.

7. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelos referidos polissacarídeos possuírem um tamanho inferior ou igual a 15 kDa.

8. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo dito extrato de algas compreender: - de 10 a 50% de carbono; - de 1 a 10% de hidrogênio; - de 1 a 5% de nitrogênio; - de 20 a 50% de oxigênio; e - de 1 a 15% de enxofre; em porcentagem em peso da matéria seca total do extrato de algas.

9. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo dito extrato de algas compreender: - de 15 a 30% de carbono; - de 3 a 6% de hidrogênio; - de 1 a 3% de nitrogênio; - de 25 a 40% de oxigênio; e - de 2,5 a 10% de enxofre; em porcentagem em peso da matéria seca total do extrato de algas.

10. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo dito extrato de algas ser obtido por um processo em que: a) as algas são lavadas e desareadas; b) as referidas algas são trituradas; c) a fase sólida do triturado é separada de sua fase líquida; d) a referida fase líquida é clarificada; e) o sumo obtido na etapa d) é ultrafiltrado sobre uma membrana de menos de 50 kDa; e f) o sumo de filtração obtido na etapa e) é concentrado e depois seco.

11. USO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo sumo obtido na etapa d) ser ultrafiltrado sobre uma membrana de 15 kDa.

12. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 11, caracterizado pela etapa c) do processo ser realizada por prensagem do triturado obtido na etapa b).

13. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo método compreender as seguintes etapas: a) as algas são lavadas com água doce e desareadas; e/ou b) as referidas algas são trituradas com um refinador; e/ou c) a fase sólida do triturado é separada de sua fase líquida por prensagem do triturado com uma prensa de banda; e/ou d) a referida fase líquida é clarificada com um clarificador de placas; e/ou e) o sumo obtido na etapa d) é ultrafiltrado sobre uma membrana cerâmica de 15 kDa; e/ou f) o sumo de filtração obtido na etapa e) é concentrado por evaporação e depois seco por liofilização ou atomização.

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