CN116284485A - 一种抗疲劳提高免疫力的多花黄精多糖及其制备方法与应用 - Google Patents

一种抗疲劳提高免疫力的多花黄精多糖及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗疲劳提高免疫力的多花黄精多糖及其制备方法，该多花黄精多糖由10个α‑Fruf以(2→6)糖苷键连接而成，其两端果糖2号和6号位的碳原子分别以(2→4)和(1→6)糖苷键连接着α‑Galp和3‑MeO‑β‑Glcp。实验结果表明：多花黄精多糖具有很好的抗氧化、抗疲劳和提高免疫力的功效，同时多花黄精多糖还可能作为一种益生元增加肠道有益菌的相对丰度，让肠道保持健康状态，为开发多花黄精多糖的药用价值开发提供理论依据。

Description

一种抗疲劳提高免疫力的多花黄精多糖及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种植物多糖，具体涉及一种抗疲劳提高免疫力的多花黄精多糖及其制备方法。
背景技术
快节奏的生活让高压状态的人群倍感疲劳和免疫力低下，诱发许多疾病。疲劳是一种非特异性的症状，不仅存在于许多疾病中，还可以作为一个单独的症状在普通人群中。在疲劳状态下，人们的免疫力被削弱变得更易感染各种疾病。长期累积的疲劳还会导致慢性综合征，这容易使机体产生一系列的健康问题，例如咽炎、肌痛、认知障碍等。因此，疲劳是一个重要的公共卫生问题。缓解疲劳获得高质量的生活是亟待解决的难题。
剧烈运动、缺氧严重或是长期疾病都能导致机体疲劳。在现代人群中，运动是疲劳的一个主要来源。适当运动可以增进健康，然而过度的运动会让机体处于极端的生理环境中，破坏身体平衡，影响系统和器官的正常功能，导致疲劳。
中医中通常将疲劳称作“疲极”“倦怠”“困顿”，更有“恍惚善忘”“四肢疼痛，百节劳倦”等描述[5]。历代医家把这种症状归于虚劳、虚损的范畴，认为五脏功能失调对疲劳的发生影响很大，中医中常采用补虚药治疗和改善疲劳征状[2]。
从中药补虚药中寻找抗疲劳活性成分是预防和缓解疲劳的一个重要方向。黄精是一种中药补虚药，也是药食同源类中药，其为百合科黄精属多年生草本植物滇黄精(Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.)、黄精(Polygonatum sibiricum Red.)和多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)的干燥根茎。黄精归脾、肺、肾经，主治脾气虚、肺阴虚、肾阴虚证，具有补气养阴、健脾润肺、益肾固精的功效，主要用于体倦乏力、劳嗽咳血、精血不足等。结合中医和现代医学理论，黄精的传统功效主要体现在抗疲劳、抗衰老、降血糖，是开发抗疲劳健康产品的良好选择。
发明内容
发明目的：本发明的目的是为通过系统分离纯化多花黄精多糖，并经过分子量、单糖组成、结构特点确定结构，并通过药理实验筛选出具有抗疲劳和提高免疫力的多花黄精多糖。
技术方案：为了实现以上目的，本发明采用的技术方案为：
一种抗疲劳提高免疫力的多花黄精多糖，该多花黄精多糖的结构式如图13所示。
作为优选方案，以上所述的抗疲劳提高免疫力的多花黄精多糖，该多花黄精多糖是一种直链多糖，由10个α-Fruf以(2→6)糖苷键连接而成，其两端果糖2号和6号位的碳原子分别以(2→4)和(1→6)糖苷键连接着α-Galp和3-MeO-β-Glcp。
本发明所述的抗疲劳提高免疫力的多花黄精多糖的制备方法，包括以下步骤一种或多种：
(1)多花黄精粗多糖提取；(2)大孔树脂纯化；(3)Sephadex G-100柱层析；(4)制备液相纯化得到。
一种抗疲劳提高免疫力的多花黄精多糖，它是通过以下方法制备得到的：
(1)多花黄精粗多糖提取：取多花黄精粗粉加适量水6～10倍浸泡后，加入煎煮提取1～2次，每次1～2h，合并煎煮液，浓缩，加75～80％乙醇沉淀，得多花黄精粗多糖；
(2)大孔树脂纯化：取步骤(1)的多花黄精粗多糖上D301型树脂纯化得到多花黄精多糖PCDP，工艺参数为多花黄精粗多糖样品浓度为5mg/mL，树脂用量为2g/20mL，吸附时间为2h，吸附温度为35℃。
作为优选方案，所述的抗疲劳提高免疫力的多花黄精多糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)多花黄精粗多糖提取：取多花黄精粗粉加适量水6～10倍浸泡后，然后煎煮提取1～2次，每次1～2h，合并煎煮液，浓缩，加75～80％乙醇沉淀，得多花黄精粗多糖；
(2)大孔树脂纯化：取步骤(1)的多花黄精粗多糖上D301型树脂纯化得到多花黄精多糖PCDP，工艺参数为多花黄精粗多糖样品浓度为5mg/mL，树脂用量为2g/20mL，吸附时间为2h，吸附温度为35℃；
(3)Sephadex G-100柱层析：称取步骤(2)的多花黄精多糖PCDP溶解于蒸馏水中，10000rpm离心5min，取上清液过0.22μm水系滤膜，滤液用于进样分析，将多花黄精多糖PCDP滤液装载到Sephadex G-100柱上，用蒸馏水以0.4mL/min流速洗脱，每管1mL收集洗脱液，并用苯酚硫酸法测定，绘制洗脱曲线，依照曲线合并主要馏分，冷冻干燥得多花黄精多糖细分产物PCDP-2；
(4)制备液相纯化得到：取步骤(3)得到的多花黄精多糖细分产物PCDP-2配制成浓度10mg/mL水溶液，进样HPLC制备分离系统，单次进样体积20μL，流动相为0.5mM乙酸铵，流速为0.5mL/min，色谱柱为TSK G4000PWXL(7.8*300mm)，柱温保持30℃，收集保留时间在18～22min的洗脱液，合并收集液，装入截留分子量为500Da透析袋中，纯净水静置透析48h，后冷冻干燥可得PCDP-2b样品。
本发明所述的多花黄精多糖在制备抗疲劳、提高免疫力和改善胃肠道菌群的药物或保健品中的应用。
发明可将多花黄精多糖和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、颗粒剂或丸剂剂型的药物。
本发明在制成片剂时，在多花黄精多糖中添加载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。
在制成胶囊剂时，将多花黄精多糖和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。
本发明在制成颗粒剂时，把多花黄精多糖和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。
有益效果：本发明提供的多花黄精多糖和现有技术相比具有以下优点：
本发明提取多花黄精多糖后进行分离纯化，主要有两步：首先对D301型大孔树脂纯化工艺进行优化得到最佳纯化工艺(吸附温度为35℃，样品浓度为5mg/mL，吸附时间为2h，树脂用量为2g/20mL)，在此条件下，PCCP的多糖保留率、脱色率和脱蛋白率分别为93.5％、79.15％和23.85％，由此获得了多花黄精精制多糖PCDP；对纯化后的多糖PCDP进行了Sephadex G-100柱层析，发现其主要有PCDP-1和PCDP-2组成，对量丰组分PCDP-2进行富集与分析，结果表明其仍然为非单一组分，接着采用液相制备获得了其量丰组分PCDP-2b，其在HPGPC谱中为一单峰，是一种均质多糖。
PCDP的抗疲劳活性研究：研究多花黄精精制多糖抗疲劳作用的可能机制，结果显示，PCDP能显著提高小鼠胸腺指数，增强机体免疫力，降低肌肉中CK、LA含量，减缓力竭运动过程中ATP的耗竭和肌肉中乳酸的堆积，并减少肌肉损伤；PCDP还能提高肝脏中SOD、CAT和GSH-Px酶活力，减少肝脏中过氧化氢和MDA的产生，减少力竭运动过程中大量自由基对体内细胞和器官的损伤；此外，本文还对口服PCDP的小鼠肠道菌群进行测序分析，结果表明，PCDP能增加一些有益菌的相对丰度，提高机体免疫，是一种潜在的益生元。
PCDP对过氧化氢诱导的L02人正常肝细胞氧化应激损伤的保护作用：首先采用MTT法对PCDP的细胞毒性考察，确定干预实验汇总PCDP的低中高三个剂量浓度分别为100、200和400μg/mL；其次对过氧化氢造模剂时间和温度进行考察，确定造模浓度为1200μmol/L、造模时间为6h；最后考察PCDP对过氧化氢诱导的L02细胞氧化应激损伤的保护作用，发现不同浓度的PCDP预孵育12h后造模，能提高细胞活力，减少细胞死亡、漂浮。
附图说明
图1为分子量标准品拟合曲线；
图2为PCDP-2b的HPGPC图；
图3为PCDP-2b的FT-IR图谱；
图4为单糖混标的PMP图；
图5为PCDP-2b的PMP图；
图6为单糖混标的GC图；
图7为PCDP-2b水解液的GC图；
图8为PCDP-2b的1H-NMR；
图9为PCDP-2b的13C-NMR；
图10为PCDP-2b的H-H COSY；
图11为PCDP-2b的HSQC；
图12为PCDP-2b的HMBC；
图13为PCDP-2b的结构；
图14为PCDP对小鼠体重(a)、负重游泳时间(b)、胸腺指数(c)和脾脏指数(d)的影响。(n＝8,数据用均值±标准差表示,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)；
图15为PCDP对小鼠肌酸激酶(a)、肌乳酸(b)、血尿素氮(c)和血尿酸(d)的影响。
(n＝8,数据用均值±标准差表示,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)；
图16为PCDP对小鼠肝脏SOD(a)、GSH-Px(b)和CAT(c)的影响。(n＝8,数据用均值±标准差表示,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)；
图17为PCDP对小鼠肝脏MDA(A)和H2O2(B)的影响。(n＝8,*p<0.05,**p<0.01,
***p<0.001)；
图18为门水平下，CG、PG、HP和LP组的肠道菌群组成；
图19为小鼠肠道菌群中个别菌种的组间差异检验；
图20为不同浓度处理L02细胞活力12h的MTT结果(n＝6)；
图21为6h、12h和24h不同浓度H2O2浓度对L02细胞活力影响的MTT结果(n＝6)；
图22为不同浓度PCDP对H2O2造成的L02细胞活力影响结果(n＝6，与Control组相比；
*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,与模型组相比,#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001)；
图23为不同浓度PCDP对细胞形态的影响。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例1的材料与仪器如下表1。
表1主要材料试剂与仪器列表
Figure BDA0004153719210000041
Figure BDA0004153719210000051
实施例1多花黄精多糖的制备方法
(1)多花黄精粗多糖提取：取多花黄精粗粉加适量水10倍浸泡30min后，煎煮提取2次，每次2h，合并煎煮液，浓缩，加75％乙醇沉淀，得多花黄精粗多糖；
(2)大孔树脂纯化：取步骤(1)的多花黄精粗多糖上D301型树脂纯化得到多花黄精多糖PCDP，工艺参数为多花黄精粗多糖样品浓度为5mg/mL，树脂用量为2g/20mL，吸附时间为2h，吸附温度为35℃；
实施例2多花黄精多糖的制备方法
(1)多花黄精粗多糖提取：取多花黄精粗粉加适量水10倍浸泡30min后，煎煮提取2次，每次2h，合并煎煮液，浓缩，加75％乙醇沉淀，得多花黄精粗多糖；
(2)大孔树脂纯化：取步骤(1)的多花黄精粗多糖上D301型树脂纯化得到多花黄精多糖PCDP，工艺参数为多花黄精粗多糖样品浓度为5mg/mL，树脂用量为2g/20mL，吸附时间为2h，吸附温度为35℃；
(3)Sephadex G-100柱层析：称取步骤(2)的多花黄精多糖PCDP溶解于蒸馏水中，10000rpm离心5min，取上清液过0.22μm水系滤膜，滤液用于进样分析，将多花黄精多糖PCDP滤液装载到Sephadex G-100柱上，用蒸馏水以0.4mL/min流速洗脱，每管1mL收集洗脱液，并用苯酚硫酸法测定，绘制洗脱曲线，依照曲线合并主要馏分，冷冻干燥得多花黄精多糖细分产物PCDP-2；
(4)制备液相纯化得到：取步骤(3)得到的多花黄精多糖细分产物PCDP-2配制成浓度10mg/mL水溶液，进样HPLC制备分离系统，单次进样体积20μL，流动相为0.5mM乙酸铵，流速为0.5mL/min，色谱柱为TSK G4000PWXL(7.8*300mm)，柱温保持30℃，收集保留时间在18～22min的洗脱液，合并收集液，装入截留分子量为500Da透析袋中，纯净水静置透析48h，后冷冻干燥可得PCDP-2b样品。
实施例3多花黄精均质多糖PCDP-2b的分析
1.材料与仪器如下表2；
表2主要材料试剂与仪器列表
Figure BDA0004153719210000052
Figure BDA0004153719210000061
Figure BDA0004153719210000071
2.实验方法
2.1高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)检测分子量
绘制分子量标准曲线：用分子量为3000、10000、70000、100000、500000的葡聚糖分子量标准品制作分子量标准曲线。精密称取10.00mg的PCDP-2b干燥多糖样品，溶解于超纯水中，配制成浓度为2mg/mL的糖液，用水系微孔滤膜过滤后上机测定。HPGPC分析条件：进样体积为20μL，流动相为5mM乙酸铵，流速为0.5mL/min，色谱柱为TSK G4000PWXL(7.8*300)，柱温30℃，检测器为蒸发光散射检测器(ELSD)，漂移管温度116℃，气体流量4.0L/min。
2.2单糖组成分析
采用PMP柱前衍生化法和三甲基硅醚衍生化-气相法相结合对实施例1的多花黄精多糖PCDP-2b的单糖组成进行确定。
精确称PCDP-2b粉末10mg，加入3mol/L的三氟乙酸溶液2.0mL超声溶解，转移至安瓿瓶，封口，105℃水解6h，放冷至室温，离心(3000r/min，10min)，取上清液减压蒸干，加甲醇溶解蒸干3次，残渣加超纯水溶解定容至1mL，制得水解后样品供试液。取适量多糖水解溶液进行单糖PMP衍生化反应，充分反应后，用氯仿萃出未反应PMP试剂，水相定容后进样HPLC分析单糖组成。HPLC条件：流动相A为pH6.7 0.1mol/L磷酸二氢钾缓冲盐，流动相B为乙腈；流速为1.0mL/min；柱温为30℃；检测波长为250nm。采用梯度洗脱的方式：0～3min，13％(B)；3～8min，13％～16(B)；8～15min，16％～23％(B)；15～30min，23％(B)。
另取适量多糖样品进行三甲基硅醚衍生化衍生，方法参照经典文献报道。10mgPCDP-2b样品于5mL安瓿瓶，加入4mL 2mol/L的三氟乙酸，氮吹封口，置于105℃下水解6h，60℃真空干燥，多次加入甲醇挥干去除多余的三氟乙酸，残留物加2mL甲醇溶解后转移至具塞试管中，氮气吹干，加入适量35mg/mL的盐酸羟胺吡啶溶液2mL，加适量六甲基二硅胺烷(HMDS)与三氟乙酸，混合均匀，静置15分钟，过0.22μm有机滤膜，取滤液1.2mL加至含0.1mL正十二烷的氮吹仪吹干后，混匀密封，于80度烘箱内反应1h，反应产物加0.5mL氯仿萃取两次，取氯仿层过0.22μm有机滤膜，进行气相色谱分析。气相色谱分析条件：色谱柱HP-5(30m×0.32mm×0.25mm)毛细管色谱柱，流速为1mL/min，检测器FID，载气为99.999％高纯氮气，2mL/min；升温程序为130℃保持1min，以5℃/min升至180℃，保持2min，再以5℃/min升至220℃，保持2min；进样口温度为230℃，检测器温度为230℃；进样量为1μL，分流比为20:1。
2.3NMR分析
将10mg PCDP-2b样品溶解于1mL D2O中，冷冻干燥交换三次，最后将样品溶于0.6mL D2O中，离心，置于5mm核磁管中，在室温下记录一维NMR(1H-NMR、13C-NMR)和二维NMR(1H-1HCOSY、HSQC、HMBC)图谱。
3.结果与分析
3.1.高效凝胶色谱法(HPGPC)
如表3所示，不同葡聚糖分子量标准品的保留时间与其分子量的对数值表，绘制成图即得图1，葡聚糖标准品的保留时间tR为横坐标，分子量的对数值LgMw为纵坐标，得葡聚糖标准品回归方程y＝-0.3519x+10.383,R2＝0.9918。如图2所示，PCDP-2b为单一峰均一性良好，保留时间代入标准曲线算得其相对分子量为2048Da。
表3分子量标准品高效液相色谱分析结果
分子量Mw LogMw 保留时间min
3000 3.477 19.514
10000 4.000 18.318
70000 4.845 15.854
100000 5.000 14.95
500000 5.699 13.461
3.2傅里叶变换光谱分析(FT-IR)
图3中，PCDP-2b的峰在3315.59、2935.14和1420.53cm-1附近，被报道为多糖的典型特征峰[87]。3315.59cm-1处的强吸收峰为-OH的伸缩振动峰；2935.14和1420.53cm-1分别为C-H的伸缩振动和弯曲振动。PCDP-2b的C-O-C的不对称振动峰出现在1027.45cm-1处；D型吡喃环的伸缩振动峰出现在930.80cm-1处；α糖苷键的吸收峰在818.29cm-1处。根据红外光谱的上述特征吸收，可以初步测PCDP-2b可能含有α-D-吡喃糖。
3.3单糖组成分析
图4为PMP柱前衍生化法的结果，单糖PMP衍生物的洗脱峰按时间先后依次为甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖以及半乳糖。将PCDP-2b的色谱峰与之比对得到图5，结果表明，PCDP-2b由葡萄糖以及半乳糖组成。但该法无法辨别果糖，还需其他方法加以证明。
将单糖单个标准品、单糖混合标准品和PCDP-2b水解液进行三甲基硅醚衍生化，对衍生化的样品依次进样。根据单糖单个标准品图的保留时间对单糖混合标准品图中的吸收峰进行指认，结果如图6和7所示，单糖混合标准品衍生物按出峰时间依次为阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、果糖、半乳糖以及葡萄糖。将PCDP-2b水解液衍生物图与之对比发现，PCDP-2b由葡萄糖、半乳糖和果糖构成，根据公式计算得葡萄糖：半乳糖：果糖＝1.8:1.5:10.9。
表4单糖标准品的气相色谱分析结果
Figure BDA0004153719210000091
3.4NMR分析
3.4.1 1H-NMR分析
在1H-NMR谱中，大部分氢信号集中在3.0-4.0ppm之间，不易进行归属；异头H所在区域(4.5-5.4ppm)有较好的分离度，是多糖结构单元归属的重要判据。在PCDP-2的1H-NMR图谱(图8)中可以看到2个异头H信号，化学位移为δ5.38(A)、4.61(B)，其归属为两种醛糖单元，另外4.20和4.05(C)ppm处信号属于果糖单元(H3与H4)特征信号，表明PCDP-2b有3种单糖残基。其余的化学位移在3.0-4.0ppm之间的信号属于糖骨架的质子峰，可通过COSY与HMBC图谱进行糖单元中其它H信号的归属。
糖残基异头氢的信号峰面积能基本反映该残基在多糖中比例。对三种单元的特征氢峰面积及果糖单元H4面积进行积分，得到A:B:C:＝1:1:10，这与GC分析的单糖种类相同与比例基本一致。PMP衍生化反应不能检测果糖的存在，而三甲基硅醚化反应条件苛刻，可能会让果糖未充分，以其为结果单糖摩尔比计算会存在一定的误差，故此，结合GC检测与核磁数据，确认了PCDP-2b的三种结构单元的摩尔比应以为1：1：10。
3.4.2 13C-NMR分析
多糖分子的13C-NMR中异头碳的化学位移集中在90-110ppm，C2-C6吸收峰位置在60-90ppm。异头碳种类与糖残基种类数目相对应，故90-110间峰的个数即为糖残基种类数。
图9所示，PCDP-2b的13C-NMR图谱中在90-110ppm间有3个吸收峰，PCDP-2b有3种单糖残基，该结果与氢谱检测结果吻合。3种糖残基异头碳的化学位移为δ92.34、104.32和103.55ppm，其应该属于半乳糖、葡萄糖与果糖的C1信号。
3.4.3H-H COSY和HSQC分析
如图10和11分别为PCDP-2的H-H COSY和HSQC图谱，H-H COSY中能找到与异头氢交叉的信号峰和相邻氢的耦合关系，从而确定相邻氢的化学位移，再依次找到其余氢的信号。根据已确定的氢化学位移，能在HSQC谱中找到相应氢的交叉峰信号，确定与氢相连的糖的化学位移。由此可对化合物基团结构中的所有C和H的化学位移进行归属，其结果见表5。
表5多花黄精均质多糖PCDP-2b中各糖苷键的1H和13C化学位移
Figure BDA0004153719210000101
3.4.4HMBC分析
HMBC反映的是化合物的C-H远程相关信息，可以此归属结构单元C、H信息，还能判定糖单元的连接情况。可以根据PCDP-2b的HMBC谱(图12)，并结合氢与碳的化学位移归属获得各糖单元的连接顺序，从中发现到了A-C和B-C相连接的信息，化合物单元拼接应为B-C-A结构。结合PCDP-2b的NMR图谱信息，可以确定PCDP-2b的结构(图13)是一种直链多糖，其由10个α-Fruf以(2→6)糖苷键连接而成，两端果糖的2号和6号位碳原子分别以(2→4)和(1→6)糖苷键连接着α-Galp和3-MeO-β-Glcp，属于杂化果聚糖类型型多糖。计算其分子量大小约为2048Da，这与HPGPC分析结果基本吻合。
实施例4抗疲劳活性研究
1.本实施例的材料与仪器如表6。
表6主要材料试剂与仪器列表
材料与试剂 来源 规格或型号
红牛冻干粉 实验室冻干获得 棕黄色粉末
数显恒温水浴锅 州朗越仪器制造有限公司 HH-2
酶标仪 帝肯(上海)实验器材有限公司 SPARK 10M
组织匀浆机 武汉赛维尔生物科技有限公司 KZ-Ⅱ
纯水仪 易普易达科技有限公司 SAGA-10TQ
电子天平 赛多利斯科学仪器北京有限公司 Sartorius CPA 225D
台式高速离心机 湘仪实验室仪器开发有限公司 TG16-WS
冻干机 照生有限公司 LABONCO
2.实验动物
ICR雄性健康小鼠(体重18-22g)，从南京中医药大学实验动物中心购买，动物许可证号：SCXK(沪)2022-0004。动物实验方法和处死程序通过伦理审查。所有小鼠购买以后适应性饲养1周，期间自由摄食饮水。
3.实验方法
3.1给药与分组
ICR小鼠适应性喂养一周，对其进行游泳训练。在此期间，淘汰游泳过长或过短的小鼠。剩余小鼠被随机分为四组，每组8只。按照阴性对照组(CG)、阳性药组(PG)、实施例1制备得到的多花黄精多糖PCDP高剂量组(450mg/kg，HP)和PCDP低剂量组(150mg/kg，LP)。处理组给予红牛冻干粉或PCDP，对照组给予等量蒸馏水，持续4周。每5天测定小鼠体重，最后一天灌胃30min后测定小鼠的游泳能力、脏器指数和生化指标等。
3.2负重游泳实验
在最后一次灌胃30分钟，将各组小鼠置于一个游泳池(高30厘米，直径25厘米，25±1℃)中强迫游泳。将铅皮(小鼠体重的7％)置于每只小鼠的尾根上。游泳时间是指小鼠在水中正常游泳至挣扎直至体力耗尽所用的时间。当小鼠在8秒内不能浮到水面呼吸时，它们就被认为疲劳。力竭游泳结束后，将小鼠从水中取出，用纸巾擦干，放回笼中。从游泳到精疲力竭的时间被用作强迫游泳能力的指标。
3.3生化指标的测定
游泳结束后，立即对小鼠并进行摘眼球取血，血液在4℃下3000r/min离心，收集上清液并转移到新的1.5mL离心管中，保存于-80℃冰箱备用。上清液用于后续生化指标测定，包括血尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)和血尿酸(Urea acid，UA)。处死小鼠后，解剖获得其胸腺、脾脏、肝脏和腓肠肌称重，计算各脾脏指数和胸腺；肝脏组织用于后续生化指标检测，主要包括超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)，过氧化物酶(Catalase，CAT)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、过氧化氢(Hydrogen peroxide，H2O2)。腓肠肌组织用于肌酸激酶(Creatine kinase，CK)和乳酸(Lactic acid，LA)的测定。
3.4数据统计
数据使用SPSS软件进行分析(Vision 26.0,SPSS Inc.,Chicago,Illinois)，并用均值±标准误差表示。采用单因素方差分析进行分析，LSD法进行多重比较。采用GraphpadPrism 8.0.2软件进行数据处理。
4.结果与分析
4.1PCDP对小鼠负重游泳时间和脏器指数的影响
在长期灌胃后，接受PCDP的小鼠身体看起来十分健康，表现为毛发色泽光亮和精神状态正常等现象。记录小鼠的体重生长曲线(图14)，结果显示所有治疗组的小鼠体重与CG组对比无显著差异。实验期间，给予PCDP的小鼠体重与CG组相比没有显著变化，这表明150-450mg/kg剂量范围内，PCDP的生物安全性高、无毒。如图14c和14d所示，相比于NC和PG组，HP组小鼠的胸腺指数显著增加(p<0.01)；与PG组对比，HP组小鼠的脾脏指数显著升高(p<0.01)；与CG组相比，LP组的胸腺指数和脾脏指数均无显著差异(p>0.05)。
小鼠的负重游泳实验是用于评价药物或食物抗疲劳作用的常用实验方法，其游泳时间长短可以客观地反应机体抗疲劳能力的强弱。如图14b所示，与CG组比较，PG和HP组小鼠的负重游泳时间明显延长(P<0.01)，LP组小鼠的负重游泳时间也有延长，但无统计学意义(P>0.05)。
以上结果表明，PCDP生物安全性高，相比于市面常见的抗疲劳功能食品更有优势。在450mg/kg剂量下，PCDP能显著延长小鼠负重游泳时间，同时小鼠的免疫器官脏器指数显著升高，这说明高剂量的PCDP可能通过提高机体免疫，延迟疲劳。
2.2PCDP对肌肉和血清中生化指标的影响
肌酸激酶(Creatine kinase，CK)是一种重要的激酶，与能量转移、肌肉收缩和ATP再生直接相关。CK水平升高与ATP消耗和肌肉损伤呈正相关。图15a中，各给药组小鼠的肌CK含量均显著低于正常对照组(PG组:p<0.01,HP组:p<0.01,LP组:p<0.05)。骨骼肌中过量的乳酸(Lactic acid，LA)堆积是运动性疲劳的重要原因，它可以降低肌肉的pH值和能量供应。如图15b，与CG组和PG组相比，HP组小鼠肌肉中LA含量均显著降低，且HP组和LP组组间差异较小(p<0.05)。
血尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)是蛋白质和氨基酸代谢的结果，是评估身体在负荷下的重要指标。BUN水平增加得越明显，身体对运动耐力的适应越差。身体疲劳期间，血尿酸(Urea acid，UA)和水平越高，机体ATP降低的程度越大。如图15c和15d，与CG组相比，LP和HP组小鼠的BUN和UA最低,此时小鼠的身体负荷相对较弱，疲劳程度相对较低。
2.3PCDP对肝脏中生化指标的影响
对于氧化损伤，本发明检测了肝组织中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)，过氧化物酶(Catalase，CAT)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、过氧化氢(Hydrogen peroxide，H2O2)的水平(图16和图17)。与CG组相比，HP组SOD(p<0.01)、GSH-Px(p<0.001)和CAT含量(p<0.05)显著升高，MDA(p<0.05)和H2O2(p<0.001)浓度显著降低。与CG组相比，LP组SOD(p<0.05)和GSH-Px(p<0.01)含量显著升高，CAT含量无显著差异(p>0.05)。CG组相比，PG组小鼠CAT活性显著升高(p<0.01)，其MDA和H2O2浓度未见显著降低(p>0.05)。本研究结果表明，大剂量PCDP可有效增强抗氧化酶活性，抑制过氧化氢，减轻细胞损伤，延缓氧化损伤引起的机体疲劳。
以上结果表明，PCDP具有抗疲劳活性，可以通过多个方面改善小鼠的运动疲劳，其能显著增强肝脏中抗氧化物酶的活力，帮助机体对抗力竭运动过程中产生的大量自由基，减轻其对机体的损伤；能显著减少肌肉中乳酸堆积和肌酸激酶的活力，可能可以减轻肌肉损伤；PCDP还能加快清除运动过程中产生的代谢产物，提高机体对运动的耐力。
实施例5对小鼠肠道菌群的影响
1.材料与仪器
表7主要材料试剂与仪器列表
Figure BDA0004153719210000131
2.实验动物与分组
ICR雄性健康小鼠(体重18-22g)，从南京中医药大学实验动物中心购买，动物许可证号：SCXK(沪)2022-0004。动物实验方法和处死程序通过伦理审查。所有小鼠购买以后适应性饲养1周，期间自由摄食饮水。
ICR小鼠适应性喂养一周，对其随机分为四组，每组6只。按照阴性对照组(CG)、阳性药组(PG)、PCDP高剂量组(450mg/kg，HP)和PCDP低剂量组(150mg/kg，LP)。处理组给予红牛冻干粉或PCDP，对照组给予等量蒸馏水，持续5周。
3.实验方法与数据分析
肠道菌群测序：最后一天灌胃30min后，处死，解剖，在无菌环境下收集小鼠结肠内容物2-3粒置于无菌1.5mL EP管内，将收集粪便立即存于-80℃冰箱，利用公司的平台进行测序(委托上海美吉生物医药科技有限公司完成)，通过对比数据库分析不同样品的细菌群落组成。
下一代测序分析采用Kruskal-Wallis秩和检验进行事后检验，采用Tukey-kramer检验两两比较的显著性水平，p<0.05被认为差异有统计学意义。
4.结果与分析
4.1对肠道菌群结构的影响
接下来，在门、科、属、种水平下分析了小鼠肠道微生物的群落结构。在门水平下的分析结果显示(图18)，小鼠肠道菌群主要由厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、放线菌门(Actinobacteriota)、脱硫杆菌门(Desulfobacterota)、髌骨杆菌门(Patescibacteria)组成。
在科水平下的分析结果显示，小鼠肠道微生物群的主要科为乳杆菌科(Lactobacillaceae)、韦荣球菌科(Erysipelotrichaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、Muribaculaceae、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)。与CG组相比，各给药组小鼠肠道微生物中与免疫有关的益生菌群(韦荣球菌科、毛螺菌科和Muribaculaceae)相对丰度增加，对肠道微生物组产生积极的影响。
在属水平下的分析结果表示，小鼠肠道菌群的主要属为乳酸菌属(Lactobacillus)、杜氏杆菌属(Dubosiella)、norank_f_Mueibaculaceae、Allobaculum和unclassified_f_Lachnospiraceae。与CG组相比，杜氏杆菌属、norank_f_Mueibaculaceae和Allobaculum是各给药组共同增加的益生菌,而这些菌群都与免疫相关，Allobaculum被报道与疲劳相关，杜氏杆菌参与短链脂肪酸的产生。其中LP和HP组的杜氏杆菌属相对丰度略大于PG组。
对个别菌种进行组间差异性检验结果如图19，与PG组相比，LP组小鼠肠道中Paramesenteroides的相对丰度显著增加(p<0.05)。相关报道指出，Paramesenteroides是一种益生菌，能提高短链脂肪酸产生菌的相对丰度从而促进短链脂肪酸的产生，还能抑制促炎细胞因子和诱导抗炎介质来调节免疫。值得注意的是，相比于CG组，PG组小鼠肠道中Helicobacter相对丰度显著增加，这是一种对人类健康造成严重威胁的致病菌。可见，红牛冻干粉长期食用会对肠道带来不良影响。
接下来，通过对不同组别小鼠肠道菌群KEGG pathway(level2)进行丰度组成分析，发现小鼠肠道菌群富集的通路主要包括膜转运、糖代谢、复制和修复、氨基酸代谢、翻译和能量代谢。与CG组相比，LP和HP组可能表现出更高水平的膜转运、氨基酸代谢和能量代谢。
以上实验表明，本发明制备得到的PCDP能抑制小鼠体内一些致病菌的生长，促进和支持健康微生物组，提高有益菌的相对丰度，提高机体免疫，还能增加促短链脂肪酸细菌的相对丰度。
实施例6对H2O2诱导的L02细胞氧化损伤的保护作用研究
1.材料与仪器
Figure BDA0004153719210000141
Figure BDA0004153719210000151
2.实验方法
将L02细胞接种于含10％FBS、1％青霉素-链霉素混合溶液的DMEM培养基中，置于含有5％CO2的37℃恒温细胞培养箱中培养。每1-2天进行换液，细胞贴壁长满70-80％后用0.25％胰蛋白酶消化后，传代，继续培养。
2.1PCDP作用浓度的确定
以5×10^5个/mL密度种板，每孔100μL加入96孔板中，96孔板分为调零组、空白对照组、不同浓度给药组，每组设6个复孔，平行三份。种板12h后，弃旧培养基，分别给药，使PCDP终浓度为100、200、400、600、800、1000μg/mL。给药24h后，每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，CO2培养箱中孵育4h后取出，小心吸弃上清，加入100μL DMSO，置摇床上200rpm振荡10min溶解紫色结晶，测定490nm波长处的吸光度值(A)，按照公式计算细胞生存率：
Figure BDA0004153719210000152
2.2H2O2诱导的L02细胞损伤模型的建立
以6×10^5个/mL密度种板，每孔100μL加入96孔板中，将96板分组为调零组、空白对照组、不同浓度过氧化氢组，每组设6个复孔，三块板分别设为造模4h、造模6h、造模8h，重复做三次。种板12h后，加入50μL H2O2造模剂使其终浓度为100、200、400、800、1200和1600μmol/L。造模时间结束后，采用MTT法测定OD490值，按照公式4.1计算细胞生存率。
2.3MTT法检测PCDP对H2O2诱导的L02细胞损伤保护作用
以6×10^5个/mL密度种板，每孔100μL加入96孔板中，将细胞分组为调零组、空白对照组、不同浓度给药组组，每组设6个复孔，造模6h，重复做3次。种板12h后，加100μL不同浓度(100、200、400μg/mL)PCDP药液，孵育12h后，加入25μL H2O2造模剂(终浓度为1200μmol/L。造模结束后，采用MTT法测定OD490值，按照公式4.1计算细胞生存率。
2.4显微镜观察法判断PCDP对H2O2诱导的L02细胞损伤保护作用
以3×10^5个/mL密度种板，每孔1mL加入24孔板中，将24孔板分为空白对照组、H2O2造模组以及不同浓度给药组，重复3次。细胞种板12h后，加入PCDP药液(终浓度为100、200、400μg/mL)，孵育12h后，加入H2O2造模剂(终浓度1200μmol/L)。造模结束后，将24孔板置于显微镜下，用显微镜观察并拍照。
2.5数据统计
数据使用SPSS软件进行分析(Vision 26.0,SPSS Inc.,Chicago,Illinois)，并用均值±标准误差表示。采用单因素方差分析进行分析，LSD法进行多重比较。采用GraphpadPrism 8.0.2软件进行数据处理。
3.结果与分析
3.1PCDP作用浓度的确定
对不同浓度PCDP孵育L02细胞12h后的细胞活力进行测定，以说明PCDP的细胞毒性。由图20可知，多花黄精多糖在200-1000μg/mL范围内对细胞没有毒性。结合文献中中药多糖的作用浓度，选择PCDP的作用浓度为100、200和400μg/mL用于接下来的研究。
3.2H2O2诱导的L02细胞损伤模型的建立
采用不同浓度的H2O2对L02细胞进行不同时间的培养，其细胞活性测定结果见图20，随着浓度的升高，细胞活力逐渐降低，不同时间，H2O2浓度为1600μmol/L时，活力降低得最快；处理时间延长，细胞活性也在逐渐下降，但H2O2在200-1200μmol/L范围时，作用时间对其影响略小。当H2O2浓度为1200μmol/L，作用时间为12h时，此时模型组细胞活力为70.82±3.78％，细胞处于有一定的死亡率，但未达半数致死状态，能较好地检验药物的作用，因此选择该条件作为H2O2的造模条件。
3.3MTT法检测PCDP对H2O2诱导的L02细胞损伤保护作用
细胞种板12h后，采用100、200和400μg/mL的PCDP孵育L02细胞12h后，给予细胞H2O2造模剂至使其终浓度为1200μmol/L，造模6h后测定细胞活力，结果如图21所示。给予细胞100、200和400μg/mL的PCDP均能让细胞组细胞活力恢复到control组水平。在H2O2和200、400μg/mL浓度的PCDP共同作用下，细胞活力竟然有所提升(p<0.05)。总体而言，PCDP能够保护H2O2对L02细胞造成的损伤。
3.4形态法观察PCDP对H2O2诱导的L02细胞损伤保护作用
细胞种板12h后，采用100、200和400μg/mL的PCDP孵育L02细胞12h后，给予细胞H2O2造模剂至使其终浓度为1200μmol/L，造模12h后显微镜下观察其形态，结果如图22所示。Conrol组L02正常细胞形态呈现梭形，有少数透明光亮、圆形细胞漂浮在培养基上；模型l组中细胞失去原有梭形，细胞核皱缩，细胞膜呈泡状，有大量透明光亮、圆形细胞漂浮；相比于模型组，不同PCDP浓度给药组细胞随着给药浓度的提高，透明光亮、圆形细胞漂浮的数量逐渐变少，但底层大部分细胞还是失去了原有的梭形，细胞核皱缩，细胞膜呈泡状。由此可见，PCDP对H2O2诱导的L02细胞损伤有一定的保护作用，能减少造模过程中细胞的死亡数量。
以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种抗疲劳提高免疫力的多花黄精多糖，其特征在于，该多花黄精多糖结构式如下:
Figure FDA0004153719200000011
2.根据权利要求1所述的抗疲劳提高免疫力的多花黄精多糖，其特征在于，该多花黄精多糖是一种直链多糖，由10个α-Fruf以(2→6)糖苷键连接而成，其两端果糖2号和6号位的碳原子分别以(2→4)和(1→6)糖苷键连接着α-Galp和3-MeO-β-Glcp。
3.权利要求1或2所述的抗疲劳提高免疫力的多花黄精多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)多花黄精粗多糖提取；(2)大孔树脂纯化；(3)Sephadex G-100柱层析；(4)制备液相纯化得到。
4.根据权利要求3所述的抗疲劳提高免疫力的多花黄精多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)多花黄精粗多糖提取：取多花黄精粗粉加适量水浸泡后，煎煮提取1～3次，每次1～2h，合并煎煮液，浓缩，加70～90％乙醇沉淀，得多花黄精粗多糖；
(2)大孔树脂纯化：取步骤(1)的多花黄精粗多糖上D301型树脂纯化得到多花黄精多糖PCDP；工艺参数为多花黄精粗多糖样品浓度为5mg/mL，树脂用量为2g/20mL，吸附时间为2h，吸附温度为35℃；
(3)Sephadex G-100柱层析：称取步骤(2)的多花黄精多糖PCDP溶解于蒸馏水中，10000rpm离心5min，取上清液过0.22μm水系滤膜，滤液用于进样分析，将多花黄精多糖PCDP滤液装载到Sephadex G-100柱上，用蒸馏水以0.4mL/min流速洗脱，每管1mL收集洗脱液，并用苯酚硫酸法测定，绘制洗脱曲线，依照曲线合并主要馏分，冷冻干燥得多花黄精多糖细分产物PCDP-2；
(4)制备液相纯化得到：取步骤(3)得到的多花黄精多糖细分产物PCDP-2配制成浓度2～10mg/mL水溶液，进样HPLC制备分离系统，单次进样体积20～50μL，流动相为0.5mM乙酸铵，流速为0.5mL/min，色谱柱为TSK G4000PWXL，7.8*300mm，柱温保持30℃，收集保留时间在18～22min的洗脱液，合并收集液，装入截留分子量为500Da透析袋中，纯净水静置透析48h，后冷冻干燥可得PCDP-2b样品。
5.一种抗疲劳提高免疫力的多花黄精多糖，其特征在于，它由以下方法制备得到：
(1)多花黄精粗多糖提取：取多花黄精粗粉加适量水浸泡后，煎煮提取1～3次，每次1～2h，合并煎煮液，浓缩，加70～90％乙醇沉淀，得多花黄精粗多糖；
(2)大孔树脂纯化：取步骤(1)的多花黄精粗多糖上D301型树脂纯化得到多花黄精多糖PCDP；工艺参数为多花黄精粗多糖样品浓度为5mg/mL，树脂用量为2g/20mL，吸附时间为2h，吸附温度为35℃。
6.权利要求1、2或5所述的多花黄精多糖在制备抗疲劳的药物或保健品中的应用。
7.权利要求1、2或5所述的多花黄精多糖在制备提高免疫力的药物或保健品中的应用。
8.权利要求1、2或5所述的多花黄精多糖在制备改善肠道菌群的药物或保健品中的应用。
9.根据权利要求5～8任一项所述的应用，将多花黄精多糖和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂剂型的药物。
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