CN111808208B - 一种具有抗疲劳作用的西藏凹乳芹多糖的制备方法及应用 - Google Patents

一种具有抗疲劳作用的西藏凹乳芹多糖的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

西藏凹乳芹(Vicatia thibertica de Boiss)属伞形科。西藏凹乳芹粗多糖可降低乳酸生成含量，增强代谢产物消除效率，从而达到抗疲劳的作用。由此可知，两藏凹乳芹的抗疲劳作用效果明显，且抗疲劳的活性部位为多糖部分。本发明提供一种西藏凹乳芹多糖的制备方法，明确其抗疲劳效果，并深入研究均一多糖组分的抗疲劳机制，开发其在抗疲劳保健品或药品制备中的应用。

Description

一种具有抗疲劳作用的西藏凹乳芹多糖的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种中药提取物，具体涉及一种从西藏凹乳芹中提取分离得到的具有抗疲劳 活性的多糖及其应用。
背景技术
由于工作、生活压力及社会环境因素，约有70％左右人群处在亚健康状态。亚健康状态 是介于疾病和健康之间的一种心理、生理功能降低状态，表现为活力降低、反应能力及适应 能力减退。在日常生活中，“疲劳”已成为一种普遍的亚健康状态表述。疲劳可以是一种症 状形式伴随着其他的疾病，如缺铁性贫血、恶性肿瘤、硬化综合征等出现，又可作为一种疾病单独出现。随着时代发展，疲劳已逐渐成为了影响人类健康的一种“隐形杀手”。世界卫 生组织把疲劳列为了21世纪影响危害人类健康的重要因素之一，因此有关疲劳的研究也引 起了广泛关注。调查发现，有1/2以上的人都会感觉到疲劳，其中有超过1/3的人明确受到疲劳影响而降低了生活质量及工作效率。
越来越多证据显示，从植物中提取的多糖在抗疲劳方面具有低毒、高效的优势。如：枸 杞多糖有抗疲劳作用；五味子多糖显著改善小鼠的抗疲劳和耐缺氧作用；荔枝多糖可增加小 鼠糖原储备，能减少小鼠运动后尿素氮、乳酸的蓄积，具有较好的抗疲劳作用；黄精多糖通过调节小鼠脑内DA和5-HT含量，延缓运动导致的疲劳作用。
西藏凹乳芹(Vicatia thibertica de Boiss)属伞形科。主要分布在云、藏、川等地，尤其是云 南的大理地区其资源丰富。西藏凹乳芹物质成分中糖和糖醇的两种糖含量较高，总多糖的含 量为32.71％。课题组前期研究结果表明西藏凹乳芹的粗提物具有抗缺氧和耐高温等作用，能延长运动小鼠负重游泳力竭时间。而后续的研究中发现西藏凹乳芹粗多糖能显著降低运动性 疲劳小鼠血清中肌酸激酶、血乳酸、血清尿素氮的值，显著提高肝糖原的含量，表明西藏凹 乳芹确实有明显的抗疲劳作用。西藏凹乳芹粗多糖可降低乳酸生成含量，增强代谢产物消除 效率，从而达到抗疲劳的作用。由此可知，西藏凹乳芹的抗疲劳作用效果明显，且抗疲劳的活性部位为多糖部分。但西藏凹乳芹多糖的分子结构和抗疲劳机制尚不清楚，本研究拟对西 藏凹乳芹粗多糖进行分离、纯化，寻找到均一多糖组分。并明确均一多糖组分的抗疲劳效果， 再深入研究均一多糖组分的抗疲劳机制，为西藏凹乳芹在抗疲劳的应用供科学依据。
发明内容
发明目的：本发明的目的是为了发明一种西藏凹乳芹多糖的制备方法，明确其抗疲劳效 果，并深入研究均一多糖组分的抗疲劳机制，开发其在抗疲劳保健品或药品制备中的应用。
技术方案：
1、西藏凹乳芹粗多糖的制备
取干燥的西藏凹乳芹，经粉碎后用10倍量的85％乙醇在室温下浸提3次，乙醇提取后 的西藏凹乳芹，经过干燥后，按照料液比为1∶10加入蒸馏水，85℃加热提取3次，1h/ 次，离心(4500r/min，20min)收集上清液，60℃减压浓缩至浸膏。在搅拌条件下，将浸膏 加入10倍浸膏重量体积的95％乙醇中，室温静置48h，离心(10000r/min，10min)，沉 淀用水溶解，浓缩，冷冻干燥得西藏凹乳芹粗多糖。
2、西藏凹乳芹多糖的纯化
多糖纯度直接影响到多糖质量和作用效果，因此对西藏凹乳芹多糖进一步纯化，具体过 程如下：
(1)脱色
采用大孔吸附树脂(D101型)对以上粗多糖进行脱色。将大孔吸附树脂用95％的乙醇浸 泡24h后，倒入层析柱(10cm×90cm)，用蒸馏水洗脱平衡12h。将粗多糖溶于水，上样后吸附过夜，用蒸馏水洗脱，减压浓缩洗脱液，冷冻干燥后，得到脱色后的粗多糖。
(2)脱蛋白
取脱色后的粗多糖，溶于蒸馏水中，置于分液漏斗，加入糖液的1/2体积Sevag试剂(试 剂配比为三氯甲烷∶正丁醇＝5∶1)，然后剧烈震荡5min后，静置分层，离心(3000r/min)， 收集上清液，重复操作至无变性蛋白层出现，减压浓缩，加入10倍量95％乙醇，4℃静置过夜，离心，冷冻干燥，得脱蛋白的西藏凹乳芹多糖，命名为VTP(Vicatia thibertica deBoiss Polysaccharide，VTP)。
(3)蛋白去除率的计算
蛋白去除率＝(去除蛋白前蛋白的含量-去除蛋白后蛋白的含量)/去除蛋白前蛋白的含量 *100％。
3、西藏凹乳芹多糖含量测定
采用苯酚-硫酸法检测所制得西藏凹乳芹多糖中总糖含量，以葡萄糖作为标准品，用3， 5-二硝基水杨酸法测定所制得西藏凹乳芹多糖中还原糖含量，以葡萄糖醛酸作为标准品。
(一)苯酚-硫酸法来测定所制备西藏凹乳芹多糖中总糖的含量
(1)试剂配制
①苯酚溶液配制：取精制的苯酚加蒸馏水，配制成6％苯酚溶液，备用。
②标准溶液配制：精密称取0.5000g葡萄糖，于100mL容量瓶中定容，从中取出1mL溶液加水定容到50mL，得到100μg/mL的标准溶液。
(2)标准曲线的制作
用微量移液器分别取100μg/mL的标准溶液0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL 定容于50mL的容量瓶中，分别取1mL于试管中，各加入6％苯酚1mL，浓硫酸5mL，摇 晃试管，混合，静置，用722型分紫外光度计于490nm处测吸光度值。求算回归方程。
(3)西藏凹乳芹多糖中总糖含量测定
将检测样品配成200μg/mL溶液，然后取样1mL，其他步骤和标准曲线制作一致。检测 结束后，计算西藏凹乳芹多糖总糖含量。
(二)3，5-二硝基水杨酸法测所制备西藏凹乳芹多糖中还原糖的含量
(1)试剂的配置
①间羟基联苯的配制：称取间羟基联苯用5mg/mL NaOH溶液配成质量浓度为1.5mg/mL，4℃避光保存。
②四硼酸钠硫酸溶液配制：取四硼酸钠用浓硫酸配成0.125mol/L，室温保存。
③葡萄糖醛酸标准溶液的配制：准确称取0.5000g葡萄糖醛酸，用蒸馏水配成100μg/mL 的标准溶液。
(2)葡萄糖醛酸标准曲线的制作
用微量移液器分别取100μg/mL的标准溶液0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL到试管中，加蒸馏水补到1mL，冰浴，加四硼酸钠硫酸溶液5mL，沸水浴，加间羟 基联苯溶液100μL，37℃恒温水浴10min。用722型分光光度计于525nm处测吸光度值。 求算回归方程。
(三)多糖糖醛酸含量测定
将检测样品配制成为200μg/mL溶液后，取1mL于试管中，其他步骤和标准曲线制作一 致。测量完毕后，计算西藏凹乳芹糖醛酸含量。
(四)多糖得率计算公式
西藏凹乳芹多糖得率Y(％)＝(WE×(CT-CR))/WP×100 (1.2)
WE为纯化后多糖的重量，WP为每次实验中使用的西藏凹乳芹预处理样品重量，CT和 CR分别为纯化后多糖中总糖及还原糖的含量。
4、多糖分离纯化
(1)采用DEAE-琼脂糖凝胶FF柱色谱分离纯化。将一定量的DEAE-琼脂糖凝胶FF倒入到 层析柱(2.6cm×20cm)中，用蒸馏水持续洗涤DEAE柱至pH值为7.0，并用玻璃棒搅拌凝胶排除空气。将西藏凹乳芹多糖配成20mg/mL溶液，上样，自动接样器接样。用去离子水 和0.1、0.2、0.3mol/L氯化钠洗脱，用苯酚-硫酸法在490nm跟踪检测西藏凹乳芹多糖吸光 度值，绘制洗脱分布曲线图，分段收集，合并洗脱液，透析，浓缩，冷冻干燥48h，得到白 色有光泽的4种西藏凹乳芹均一多糖，根据西藏凹乳芹的拉丁名命名为：VTP1、VTP2、VTP3 和VTP4。
(2)取一定量的葡聚糖凝胶G-100加水溶胀后，100℃煮沸1h，冷却至室温，倒入到固定 好的层析柱(2.6cm×20cm)，接上自动接样器，用蒸馏水洗脱平衡24h。由于VTP1和VTP2 的回收率高、分离效果好，因此对这两个均一多糖组分进行进一步的纯化。取适量的VTP1 和VTP2用水溶解，上样，水洗脱，用苯酚-硫酸法于490nm跟踪检测西藏凹乳芹多糖的吸 光度值，绘制洗脱分布曲线图，分段收集，合并洗脱液，冷冻干燥，得到更纯的均一多糖。
采用运动性疲劳模型对VTP1、VTP2、VTP3、VTP4的抗疲劳作用进行研究。
SPF级昆明种小鼠(20±2g)，6-8周龄，雌雄各半，购于湖南斯莱克景达实验动物有限 公司，其许可证编号为SCXK(湘)2016-0002。辅酶Q10(批号：140611)：卫材药业有限 公司；VTP1、VTP2、VTP3和VTP4(自制)。
药品及试剂的配制：
(1)辅酶Q10的配制
取一定量的辅酶Q10药片研磨成粉末，小鼠的给药剂量是按《药理实验方法学》体表面 积计算法换算，且查附表所得小鼠与人之间按体表面积算等效剂量的比值，即为70kg人和 20g小鼠之间的等效剂量的比值为0.0026。计算得出，辅酶Q10每只每天2.7mg/kg。
(2)VTP1、VTP2、VTP3和VTP4的配制
取一定量的VTP1、VTP2、VTP3和VTP4，各组分的高剂量(200mg/kg)、中剂量(100mg/kg)和低剂量(50mg/kg)组，按照给药容量(0.2mL/10g体重)配制成浓度分别为1％、0.5％和0.25％的药液，现配现用。
建立运动性疲劳造模：
运动性疲劳模型以负重游泳为运动方式，游泳是小鼠本能的运动方式，可以通过适宜的 温度和一定的空间能使小鼠运动能力充分发挥。向游泳箱(50cm×40cm×40cm)中注入水， 水深度应能避免小鼠尾巴撑在游泳箱底休息。游泳箱内放置量程为0～100℃水银温度计，以 控制水温在22±2℃。将每组小鼠放在游泳箱中进行负重游泳实验，持续运动后容易产生疲劳。对运动性疲劳的判断标准是小鼠游泳至力竭的状态，即：小鼠头部沉入水中8秒不再浮出水 面。小鼠每天负重游泳运动训练，造模结束后回笼子休息。清洁游泳箱，补充笼内饲料。持 续造模14d。
分组给药：
取150只昆明种小鼠，温度为22±2℃，湿度为50～70％。饲养3d适应环境后，将小鼠 进行随机分为15组，每组10只，处理如下：
表1运动性疲劳小鼠的分组和给药情况
Figure SMS_1
负重游泳造模14天，于小鼠的尾根系上小鼠体重5％铅块(使小鼠负重游泳并快速至力 竭状态)，把负重好的小鼠放入水温：22±2℃，水深30cm游泳箱内进行负重游泳，造模同 时给予药物，正常组与模型组按体重灌胃给予生理盐水，给药时间14天，1次/天。14d后记录小鼠负重游泳力竭时间。
实验的数据导入SPSS统计软件，采用one-way ANOVA检验方法分析，且计量资料以均 值±标准差
Figure SMS_2
表示，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
负重游泳时间，间接反应了肌肉的耐受力。和正常组比较，模型组明显缩短小鼠负重游 泳力竭时间(P＜0.01)。和模型组比较，VTP1-H和VTP1-M能延长小鼠负重游泳力竭时间 (P＜0.01)。同剂量组之间比较，VTP1(高剂量组、中剂量组、低剂量组)均显著提高小鼠的负重游泳力竭时间(P＜0.01)，说明VTP1增强肌肉耐受力及抗疲劳活性强。
表2 VTP1对疲劳小鼠负重游泳力竭时间的影响
Figure SMS_3
Figure SMS_4
注：和正常组比较#P＜0.05，##P＜0.01；和模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.01；同剂量组间比较*P＜0.05，**P ＜0.01。
由于疲劳临床表现的主观性、发病的机制不明确及临床无有效的干预药物，因此目前没 有公认的动物运动性疲劳模型。所以，本研究在前期文献分析整理的基础上，针对小鼠的游 泳行为学能力，采用水环境负重游泳力竭模型。运动性疲劳是由于持续过度的躯体运动导致特别复杂的身体状态，它会直接导致躯体的活动能力下降，以及其他外周和中枢的代谢紊乱 等明显症状。在运动性疲劳中，负重游泳力竭时间是评价躯体耐受能力的核心指标。
本实验中，4个均一多糖组分各剂量组均提高了小鼠的负重游泳力竭时间，表明西藏凹 乳芹多糖能改善小鼠的躯体活动能力，其中VTP1增强肌肉耐受力和力量的作用优于其他3 个组分。
对VTP1的抗疲劳作用的进一步研究：
取一定量的VTP1，按给药剂量：200、100、50mg/kg和给药容量(0.2mL/10g体重)，配制成浓度为1％、0.5％和0.25％的药液，现配现用。
取60只昆明种小鼠(雌雄各半)，环境温度为22±2℃，湿度为50～80％。适应环境饲养 3d后，将小鼠随机分6组，每组10只。具体见下表所示：
表3运动性疲劳小鼠的分组及给药情况
Figure SMS_5
第一天造模开始给药，正常组与模型组按体重灌胃给予生理盐水灌胃，每天称重，连续 给药14d，1次/天。末次给药30min后检测各项指标。
行为学实验以及观察指标
小鼠负重游泳实验按照文献方法进行，按照小鼠体重的5％，称取铅块系在其1/3处尾根， 将小鼠放入游泳箱中，开始计时，小鼠头部全部沉入水中8s不再浮出水面时视为力竭，记录 小鼠游泳力竭的时间。实验中六个游泳箱同时进行，每次分别从各组中取一只小鼠分别放入 六个游泳箱中，由六名实验员分开进行计时，每六只小鼠负重游泳结束后迅速换水，检测指标是小鼠游泳力竭时间。每天记录小鼠的体重和一般状态，14d后检测各项指标。
体重及一般情况变化
和正常组相比，模型组小鼠的体重显著降低(P＜0.01)，各给药组分别与模型组对照，体重 无明显变化，无显著性差异。此外，和正常组比较，模型组小鼠出现精神萎靡，毛发干枯且 没有光泽，少动，耳廓和尾部颜色变浅，进食量减少，粪便稀溏。而西藏凹乳芹多糖各剂量 组能有效改善以上情况。
表4各组小鼠造模/给药期间的体重变化
Figure SMS_6
Figure SMS_7
注：和正常组比较#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.01；和VTP1-H组
比较*P＜0.05，**P＜0.01。
负重游泳力竭时间的变化情况为：
游泳力竭时间体现了小鼠躯体的耐受力。和正常组比较，模型组小鼠负重游泳力竭时间 显著缩短(P＜0.01)。和模型组比较，阳性组显著延长小鼠负重游泳力竭时间(P＜0.01)， 说明造模成功。和模型组比较，VTP1各剂量组也延长小鼠负重游泳力竭时间(P＜0.01或P ＜0.05)，且具有量效关系。
表5 VTP1对运动性疲劳小鼠负重游泳力竭时间的影响
Figure SMS_8
Figure SMS_9
注：和正常组比较#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.01。
结果表明：
小鼠体重的变化能反应其生理机能水平，对测定机体生长发育水平有重要作用。实验结 果表明：各治疗组和模型组相比，小鼠体重有增高的变化，但无显著性差异。从外观看，各 给药组小鼠的毛发比较光滑，精力旺盛。小鼠的体重主要取决于其食物摄取量和活动过程中的能量消耗等情况。运动性疲劳会引起躯体功能下降，认知损伤，造成负性情绪，从而影响 小鼠的食欲降低。综合评价，VTP1改善了运动性疲劳小鼠食欲并且降低其消耗。
除此之外，运动疲劳会导致躯体活动能力下降，而躯体耐受力主要由负重游泳力竭时间 来体现。本研究中，VTP1明显提高小鼠负重游泳力竭时间，表明VTP1可增强肌肉耐受力，改善躯体活动功能。
VTP1对疲劳小鼠抗氧化作用的影响研究
疲劳小鼠血清中CK、BUN和LDH检测
小鼠游泳至力竭后，眼窦静脉丛取血，置于EP管中，4℃静置，分离血清，取上清液，-80℃保存。用酶标仪测定血清中CK、BUN、LDH的含量。实验步骤为：
(1)稀释标准品：将标准品梯度稀释，稀释后浓度分别为1000、500、250、125、62.5、31.2、15.6pg/mL。
(2)洗涤：用洗涤液洗板重复5次，拍干。
(3)加样及孵育：将标准品、样品、样本加到孔中，25℃孵育2h。
(4)洗涤：同上洗涤步骤。
(5)加抗体及温育：加生物素化抗体，25℃用震荡器震荡(100r/min)孵育1h。
(6)洗涤：同上洗涤步骤。
(7)加酶及温育：配制酶结合物的工作液，置于25℃用震荡器震荡(100r/min)孵育30min。
(8)洗涤：洗涤步骤同上。
(9)显色：加显色剂，室温反应，避光显色10～20min。
(10)终止：加终止液后检测。
运动性疲劳小鼠肝脏中MDA和SOD检测
取完血清后，剪开小鼠胸腔，并露出肝脏，在相同位置，剪下一定大小的肝脏组织放-80℃ 冰箱备用。取肝脏组织检测MDA和SOD的含量。按说明书测定。
实验结果表明：
VTP1对血清生化学指标的影响情况为：
和正常组比较，模型组小鼠血清中CK活性升高(P＜0.05)；和模型组比较，阳性组、VTP1-H和VTP1-M组显著降低其活性(P＜0.01)。和正常组相比，模型组疲劳小鼠血清中 BUN的含量升高(P＜0.05)；和模型组比较，阳性组、VTP1-H和VTP1-L量组小鼠血清中 BUN含量显著减少(P＜0.01)。和正常组相比，模型组疲劳小鼠血清中的LDH活性明显升 高(P＜0.01)；和模型组比较，各给药组均能降低其活性，但无显著差异(P＞0.05)。
表6 VTP1对疲劳小鼠血清中CK、BUN和LDH的影响
Figure SMS_10
Figure SMS_11
注：和正常组比较#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.01；与VTP1-H剂量组组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
VTP1对肝脏中MDA和SOD的影响情况为：
和正常组相比，模型组疲劳小鼠肝脏中MDA含量明显升高(P＜0.01)；和模型组比较， VTP1-H组的小鼠肝脏中MDA含量明显减少(P＜0.01)；VTP1-M和VTP1-L组小鼠肝脏中MDA含量均减少，但无显著性差异(P＞0.05)。提示：VTP1剂量到达高剂量后才能明显降 低小鼠肝脏中MDA含量，且药效呈剂量依赖性。和模型组比较，VTP1-H组提高小鼠肝脏中 SOD活性(P＜0.05)，VTP1-M和VTP-L均能增强小鼠SOD活性，但无显著性差异(P＞0.05)。提示：VTP1高剂量能显著提高小鼠肝脏中SOD活性，且药效呈剂量依赖性。
表7 VTP1对疲劳小鼠肝脏中MDA和SOD的影响
Figure SMS_12
Figure SMS_13
注：和正常组比较#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.01。
运动性疲劳的能量代谢和细胞的氧化作用紧密相关。运动性疲劳可通过氧化作用降低躯体 的肌肉力量和工作效率。肌酸激酶(CK)、血尿素氮(BUN)和乳酸脱氢酶(LDH)是躯体 活动功能的重要评价指标。BUN主要反应蛋白代谢情况，同时CK和LDH含量反应骨骼肌功能状态。当机体负荷过大时，能量需求剧增，脂肪和糖供能不足，就会不断增加蛋白分解和消耗，并促使尿素生成，最终导致BUN的含量增加。本课题实验中，模型组小鼠血清中 BUN明显升高，说明疲劳状态下，脂肪与糖来源不足，消耗过多，从而引起蛋白质开始分解 来提供能量。VTP1各剂量组分别降低了小鼠血清中的BUN含量，表明给药后蛋白质的分解 程度均下降及BUN消除加速。
另外，LDH和CK水平主要用来评价机体细胞内损伤程度。LDH和CK是大分子物质不能直接进入到循坏系统。机体处在疲劳时，细胞膜结构和成分受到破坏，最终导致CK和LDH外露，进而通过机体淋巴系统最终进入血液当中，导致血清中各指标升高。同时，CK是控制ATP-PC系统的主要蛋白酶，LDH是糖代谢主要反应酶。本课题实验中，各给药组降低了小 鼠血清中CK含量。其中，VTP1中剂量组降低小鼠血清中CK含量具有显著差异，表明VTP1 对细胞损伤后恢复和功能保护效果显著。与模型组相比，VTP1各剂量组小鼠血清中LDH水 平下降，说明运动性疲劳小鼠细胞损伤处于轻微或中等状态。
肝脏是人体主要的代谢器官，其组织氧化应激作用的加剧可引起疲劳发生。SOD是人体 内抗氧化应激作用重要反应酶，可防止机体氧化应激的损伤。人体处于运动疲劳时，外周和 中枢氧化磷酸化的反应增加，引起氧自由基大量产生，需要大量的抗氧化剂去清除，不然自 由基过多会使机体氧化损伤，致使细胞结构及功能破坏。肝脏MDA是前列腺素和脂质过氧 化生物合成产物，MDA水平直接反应氧化损伤程度。SOD能清除机体内自由基，减少脂质 过氧化，维持氧化及抗氧化之间的平衡。本实验的结果表明，运动疲劳模型导致小鼠SOD活 性显著降低，提高MDA含量，说明氧化损伤的程度加剧。而VTP1各剂量组可提高小鼠SOD 活性，降低其MDA含量，表明VTP1能增强机体的抗氧化应激作用。
结果表明：VTP1抗疲劳的作用与抗氧化应激作用增强、外周代谢产物消除加快、维持机 体氧化及氧化损伤平衡密切相关。
VTP1对疲劳小鼠骨骼肌线粒体形态和mtDNA表达量的影响研究
一、VTP1对运动性疲劳小鼠骨骼肌线粒体超微结构的影响
(1)取材
造模及行为学实验结束后，先眼窦静脉丛取血，再颈椎脱臼处死小鼠，从左侧骨骼肌确 定取材部位，组织减少挤压、挫伤与牵拉等机械损伤，组织的体积不超过1mm×1mm×1mm。
(2)样品前固定
将左侧骨骼肌样本放入到电镜固定液中4℃固定2-4h。
(3)冲洗
将组织使用磷酸缓冲液洗3次，15min/次。
(4)样品后固定
1％的锇酸缓冲液冲洗，室温(20℃)固定2h。
(5)冲洗
组织块用PBS溶液冲洗3次，15min/次。
(6)梯度脱水
将组织依次用不同浓度的酒精和丙酮脱水，15min/次。
(7)树脂渗透
丙酮与Epon812包埋剂配比为1∶12，烘4h，丙酮与Epon812包埋剂配比为1∶2，渗 透过夜，包埋5-8h，37℃烘箱过夜。
(8)浸蜡与包埋
将组织块置于石蜡中，于54℃恒温箱透蜡3h，置于包埋盒凹槽内包埋，在常温下将其 凝结即为蜡块。
(9)固化
37℃烘箱放12h；
45℃烘箱放12h；
60℃烘箱放48h。
(10)切片与展片
包埋好的蜡块切片(厚度4μm)，切片在30％～40％乙醇及38℃水中按顺序展开，取出蜡片于37℃干燥箱过夜，常温保存。
(11)染色
铀铅双染色，放置室温干燥。
(12)观察
在透射电镜下进行观察，拍照，图像分析。观察骨骼肌病理变化。
二、VTP1对运动性疲劳小鼠骨骼肌mtDNA表达量的影响
(1)取材
造模及行为学实验结束后，眼窦静脉丛取血，冰上快速剥离小鼠骨骼肌，免疫组化、 Western blot和RT-qPCR样本取右侧骨骼肌，分装，-80℃冷冻保存备用。
(2)引物设计与合成：引物设计与合成
用软件设计GAPDH和mtDNA mRNA的引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成引物序列。
表8 GAPDH和mtDNA mRNA的引物序列
Figure SMS_14
(3)组织总RNA提取
①将储于冰箱的股骨肌取出，称100mg组织放入离心管中，加入RNA Lysis/2-MESolution，用组织研磨器进行细胞充分裂解，直至液体不再粘连。
②裂解组织，离心，取上清。
③加等体积的70％乙醇，用微量移液器混合均匀。
④取混合均匀的液体，离心，弃滤液。
⑤加RNA Wash Solution I，离心1min，14000r/min，丢弃滤液。
⑥将配好DNase I的DNase Incubation Buffer混合液加到RNA的吸附柱膜中心，置于 室温(25～28℃)孵育15min。
⑦再加RNA Wash Solution I到RNA吸附柱中，离心1min，14000r/min，弃滤液。
⑧加RNA Wash Solution II，离心1min，14000r/min，弃滤液，除残留乙醇。
⑨RNA吸附柱置于收集管中，加50μL Nuclease-free water至RNA吸附柱，静止1min， 离心1min，14000r/min，回收RNA。
(4)RNA检测
检测RNA OD260与OD280计算比是否满足于1.8～2.0之间。如果满足以上的条件说明样品RNA无降解情况符合实验条件要求。
(5)使用两步法合成cDNA
(5.1)逆转录的反应体系配置
①按照说明书上步骤合成cDNA：取4μL的RNA样品，根据40μL反应体系，于RNasefree离心管中进行配置混合液：
Figure SMS_15
吹打充分混匀，42℃2min。
②第一步反应体系中加入5×HiScript II qRT SuperMix II：
Figure SMS_16
再次吹打混匀。
(5.2)逆转录的反应条件
Figure SMS_17
(5.3)反应产物检测
(5.3.1)反应体系
Figure SMS_18
(5.3.2)反应条件
Figure SMS_19
按上述条件进行25个循环。
制备2％琼脂糖凝胶，取5μL反应物和loading buffer混合液加到加样孔，100mA，80 V，电泳30min。在电泳结束后，放凝胶成像仪上观察，通过鉴定为特异性条带，说明提取的RNA完整性和纯度较好。
(6)RT-qPCR检测基因mRNA表达
(6.1)先按照下表配置成RT-qPCR反应体系，逆转录cDNA作为反应模板，GAPDH作为内参，而后进行RT-qPCR，且每组实验设置3个平行对照组。
Figure SMS_20
(6.2)RT-qPCR过程两步法进行
Figure SMS_21
Figure SMS_22
注：各引物的退火温度分别为：β-actin(55℃)、G-CSF(56.5℃)、GM-CSF(57℃)。
(6.3)数据分析
RT-qPCR实验的基因表达值直接按照以下公式计算：
ΔCt＝Ct待测基因-Ct参照基因
基因的相对表达值＝2-ΔCt
实验结果显示：
VTP1对运动性疲劳小鼠骨骼肌中线粒体的超微结构变化情况为；
根据2万及5万倍透射电镜下小鼠骨骼肌线粒体结构结果电镜照片，可见(见图2)：
1.正常组肌细胞整体轻度水肿，细胞基质分布均匀，肌原纤维束结构清晰，排列整齐。 线粒体(M)整齐、连续分布肌原纤维束间，数量略显增多，局部中度肿胀，变大、基质变淡，线粒体嵴排列紊乱；肌质网(SpR)数量丰富，未见明显扩张：Z线(Z)结构清晰、排列整齐；H带(H)结构清晰、连续。
2.模型组肌细胞整体轻微水肿，细胞基质分布比较均匀，肌原纤维束结构清晰，排列整 齐、连续。线粒体(M)数量少，大面积线粒体消失，线粒体功能性阻碍，大多线粒体融合或分裂障碍形成巨线粒体；肌质网(SpR)数量丰富，明显扩张；Z线(Z)结构清晰、排列整齐；H带(H)结构清晰、连续，自噬小体(AP)数量明显增多。
3.阳性组肌细胞整体中度水肿，细胞基质分布均匀，肌原纤维束结构清晰，极少区域不 连续。线粒体(M)数量较少，未见明显聚集，呈中度肿胀，变大、基质变淡，线粒体局部嵴断裂、减少；肌质网(SpR)数量丰富，未见明显扩张；Z线(Z)结构清晰、整齐；H带 (H)结构清晰、连续。
4.VTP1高剂量组肌细胞整体轻微水肿，细胞基质分布均匀，肌原纤维束结构清晰，局部 断裂(▲)。线粒体(M)数量丰富，局部轻度聚集，呈轻微度肿胀，膜完整，嵴结构正常；肌质网(SpR)数量丰富，未见明显扩张；Z线(Z)结构清晰、局部断裂；H带(H)结构清 晰、不连续。
5.VTP1中剂量组肌细胞整体轻微水肿，细胞基质分布均匀，肌原纤维束结构清晰，排列 整齐。线粒体(M)数量丰富，局部轻度聚集，呈轻微度肿胀、变大，膜完整，嵴结构正常；肌质网(SpR)数量丰富，未见明显扩张；Z线(Z)结构清晰、排列整齐；H带(H)结构清 晰、连续。
6.VTP1低剂量组肌细胞整体重度水肿，细胞基质稀疏，肌原纤维束结构清晰，局部断裂、 溶解(▲)。线粒体(M)数量较少，呈重度肿胀，明显变大、基质溶解，线粒体嵴断裂、消失，空泡变：肌质网(SpR)数量丰富，明显扩张；Z线(Z)结构清晰、排列整齐；H带 (H)结构清晰、连续。
采用定量扩增和溶解曲线分析及扩增产物的鉴定
内参和目的基因扩增的阈值样，Ct值时各样品达到阈值后所反应的循环数，可以通过2-ΔCt分析出各样本得相对表达量。溶解曲线是对反应引物特异性鉴定。从溶解曲线可知，内 参基因与目的基因扩增片段的溶解温度只出现一个峰，说明mtDNA引物的扩增产物确定是 唯一的，且扩增的特异性强，可进行RT-qPCR的结果分析。
骨骼肌mtDNA的表达变化情况为：
和正常组比较，模型组疲劳小鼠的mtDNA表达显著下降(P＜0.01)，说明运动疲劳会导 致骨骼肌组织中mtDNA表达显著下降。mtDNA的表达中，和模型组比较，VTP1的3个剂量组与阳性对照组的表达均上调，且具有显著性差异(P＜0.01)。其中VTP1-H组的表达优于VTP1-M(P＜0.05)，提示：VTP1能提高由疲劳所导致的mtDNA表达下调。
表9 VTP1对疲劳小鼠骨骼肌中mtDNA的影响
Figure SMS_23
Figure SMS_24
注：和正常组比较#P＜0.05，##P＜0.01；和模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.01；和VTP1-H剂量组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
机体骨骼肌线粒体的功能主要是依靠其糖代谢能力。线粒体广泛地分布于心脏、脑和骨 骼肌等组织中，主要经过氧化磷酸化反应产生ATP。线粒体结构变化与其生物合成效率有密 切相关，可直接反应线粒体功能。从透射电子显微镜超微结构中，可直观线粒体形态及线粒体排列分布以及线粒体损伤程度。本实验中，模型组图片所示线粒体功能性损伤，线粒体数 量明显减少，大多线粒体融合或分裂障碍形成巨线粒体。其它治疗组所示线粒体存在不同程 度肿胀，阳性组、正常组图片所示线粒体数量增多，呈中度肿胀，变大、基质变淡，线粒体 嵴断裂、减少。VTP1-M和VTP1-H组线粒体局部轻度聚集、肿胀，部分线粒体变大、膜完 整，嵴结构正常。VTP1-L组图片所示线粒体数量增多，局部聚集，肿胀最严重，明显变大、基质溶解，线粒体嵴断裂、消失，空泡变。提示：VTP1能改善骨骼肌线粒体功能性损伤程度。
mtDNA由多种线粒体的蛋白编码而成，是机体线粒体特有基因。机体线粒体生物的合成 过程由诱导因子先发出信号，相关蛋白进而翻译，再调节编码基因及蛋白，从而调节线粒体 质和量。总的来说，线粒体的生物合成主要包括mtDNA复制、转录和表达，nDNA编码蛋白 转运等。mtDNA表达量的降低和突变反应出其损伤程度。本实验中，小鼠疲劳模型组mtDNA 表达量和正常组比较显著降低。各给药组明显提高骨骼肌mtDNA表达量，表明疲劳小鼠骨 骼肌线粒体的生物合成效率增加。
线粒体生物合成作为线粒体功能损伤后恢复的重要途经，在运动疲劳后线粒体形态破坏 及mtDNA的受损过程中，起到核心保护和恢复作用。本课题实验研究中，模型组骨骼肌线 粒体出现形态和功能改变。而VTP1治疗组均可缓减骨骼肌线粒体形态损伤，且上调骨骼肌 mtDNA含量，明显恢复造模导致的线粒体形态和功能损伤。表明VTP1可通过增加骨骼肌mtDNA转录和复制，促进骨骼肌线粒体生物合成，并改善小鼠骨骼肌线粒体功能和形态。
说明VTP1可通过减轻骨骼肌线粒体功能性损伤程度，上调骨骼肌mtDNA的表达，有效 改善运动性疲劳。
VTP1对疲劳小鼠骨骼肌SIRT1-PGC-1α-NRF1通路调控的影响研究
采用免疫组化的方法进行研究
(1)将组织切片
①切片机于-20℃预冷1h，切片厚度设置为10μm。
②将小鼠右侧骨骼肌取出，放置载物台上，待组织冰冻固定后，装好后调位置，随后 平整贴于载物片，编号。
(2)染色
①加过氧化氢溶液，PBS溶液漂洗3次，5min/次.
②滴加5％山羊血清封闭30min，随后去掉血清。
③滴加一抗，4℃孵育过夜。
④37℃温浴45min，用PBS漂洗3次，5min/次。
⑤加二抗，于37℃孵育1h，用PBS漂洗3次，5min/次。
⑥加显色剂，观察显色的状态，用水洗终止。
(3)封片
用乙醇不同梯度脱水，再用二甲苯进行透明，最后中性树胶进行封片。
(4)拍照及分析处理
采用Olympus型显微镜拍照。图像用Image-pronplus6.0软件分析，用阳性反应物的光密 度(IOD)除总面积(Area)的光密度(MOD)来计算目标蛋白表达量。
采用RT-qPCR法检测骨骼肌中SIRT1、PGC-1α和NRF1mRNA的表达水平
(1)引物设计与合成：引物设计与合成
用软件设计GAPDH、SIRT1、PGC-1α和NRF1 mRNA的引物，由南京金斯瑞生物科技 有限公司合成引物：
表10 GAPDH、SIRT1、PGC-1α和NRF1mRNA的引物序列
Figure SMS_25
采用Western blot法检测小鼠骨骼肌中相关蛋白表达
(1)骨骼肌组织总蛋白提取
取100mg骨骼肌组织，并加RIPA裂解液，将细胞充分裂解。4℃离心30min，12000 r/min，取上清为总蛋白的溶解液。
(2)BCA检测蛋白浓度
①按照BCA试剂盒的说明书，先配置0.5mg/mL蛋白标准品，再将标准品的浓度稀释为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL，测定其OD值绘制标准曲线。
②制BCA溶液，试剂A及试剂B以50∶1比例混合，备用。
③样品中加BCA溶液，37℃放置20min。
④用酶标仪进行测定OD值，计算蛋白的浓度。
(3)制取SDS-PAGE凝胶电泳
①制胶：
按分子量的大小去选择不同分离胶浓度，先制备5mL分离胶，沿玻璃板一侧缓慢的加入 到夹层中，尽量避免气泡产生。向玻璃板中加无水乙醇(目的压胶)，待凝固，弃无水乙醇层， 加浓缩胶，插梳子，待凝固，拔梳子。按下表的配比制备不同分离胶与浓缩胶。
表11不同浓度配比的分离胶和浓缩胶
Figure SMS_26
②SDS-PAGE电泳：
取20μL样品，按4∶1比例，加上样缓冲液。于100℃加热煮沸5min，离心(12000r/min)。 将样品和Maker加到上样孔中(样品上样的量为50μg)，用80V恒压电泳将样品和Maker 压成一条线，再调电压至120V。电泳结束后取出胶片。
③转膜
电泳完成后，根据Marker条带，剪切下需胶的部分，根据胶大小剪下同样大的PVDF与滤纸用甲醇活化，再用转膜缓冲液浸泡；然后组装在蝴蝶夹上，按照负极-滤纸-胶块-膜-滤纸-正极的顺序放置，此过程在装好的转膜缓冲液中操作，彻底排净各层之间气泡。排好后将转膜装置全部放于冰浴中，转膜时间由蛋白量大小决定。
④丽春红染色
丽春红染液中放转膜后的PVDF膜，摇床摇匀，蒸馏水漂洗，看条带状况，以确定转膜 的效果。
⑤封闭
5％的脱脂奶粉中放入染色完的PVDF膜，室温进行封闭2h。
⑥一抗孵育
将一抗稀释，孵育盒加一抗，放膜，4℃孵育过夜。
⑦洗膜
取出PVDF膜，TBST清洗3次，10min/次。
⑧二抗孵育
将二抗稀释，孵育盒中加二抗，放膜，室温孵育2h。
⑨洗膜
取PVDF膜，用TBST溶液清洗3次，10min/次。
⑩显影
将ECL试剂滴在PVDF膜上，避光显影5min，成像拍照。
(4)数据分析
用Image-Pro-Plus 6.0软件分析蛋白条带灰度值，选取各平均灰度值，按以下公式计算蛋 白含量，目的蛋白相对含量＝目的蛋白的密度/内参蛋白的密度。
实验结果：
免疫组化阳性物的表达变化
由图3可知，和正常组比较，模型组SIRT1表达光密度值降低，且具有显著性差异(P＜0.01)；和模型组比较，VTP1-H组阳性物表达明显升高(P＜0.01)，VTP1-M组阳性物SIRT1表达光密度值升高，但无显著性差异(P＞0.05)；西藏凹乳芹各剂量组间比较，VTP1-H组比其他两个剂量组提高了SIRT1表达(P＜0.05或P＜0.01)。提示：VTP1有增强阳性物SIRT1 表达能力的作用，且高剂量组增强阳性物SIRT1表达能力优于其他剂量组。
由下表可知，和正常组比较，模型组PGC-1α表达水平显示出降低趋势，且具有显著性 差异(P＜0.01)；和模型组比较，VTP1-H和VTP1-M均提高PGC-1α免疫阳性物表达(P＜0.05 或P＜0.01)；VTP1各剂量之间PGC-1α阳性物表达量无显著差异。
由下表可知，和正常组比较，模型组NRF1表达水平显示出降低趋势，且具有统计学差 异(P＜0.05)；和模型组比较，各治疗组均提高小鼠骨骼肌中NRF1免疫阳性物表达(P＜0.05)； VTP1-M和VTP1-LNRF1阳性物表达无显著性差异(P＞0.05)。
表12 VTP1对疲劳小鼠骨骼肌SIRT1、PGC-1α和NRF1的影响
Figure SMS_27
Figure SMS_28
注：和正常组比较#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.01；与VTP1-H 剂量组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
基因表达变化
SIRT1是一种NAD+依赖的脱乙酰化酶，广泛表达于哺乳动物细胞中，通过组蛋白和非组 蛋白去乙酰作用，主要参与细胞生物学功能。从表13和图3中可以看出，和正常组比较，模 型组细胞中SIRT1mRNA表达水平低(P＜0.01)；和模型组比较，各药物治疗作用后SIRT1mRNA表达水平趋势上调，但无统计学差异(P＞0.05)。
PGC-1α是线粒体功能、呼吸和生产的主要调节因子，即核转录辅助激活因子。和正常组 比较，模型组疲劳小鼠骨骼肌细胞中PGC-1αmRNA表达水平呈低状态(P＜0.01)，说明通过 运动诱导疲劳会使小鼠骨骼肌线粒体生物合成中PGC-1α表达降低；和模型组比较，VTP1-H、 VTP1-M及阳性对照组疲劳小鼠骨骼肌中PGC-1α基因表达水平显著上调(P＜0.01或 P＜0.05)。两两比较，西藏凹乳芹各剂量组间无显著性差异。
NRF1是一个由核基因编码调控线粒体呼吸链功能的转录因子，在生物体内广泛表达， 在线粒体生物合成和线粒体功能中发挥重要的调节作用。实验结果显示，和正常组比较，模 型组骨骼肌细胞中NRF1 mRNA呈低表达状态，具有显著性差异(P＜0.01)；和模型组比较， 阳性对照组和VTP1-H对疲劳小鼠骨骼肌细胞中NRF1有上调作用(P＜0.01)；两两比较，VTP1-H的上调作用优于中、低剂量组(P＜0.01)。
表13 VTP1对疲劳小鼠骨骼肌中相关基因的影响
Figure SMS_29
Figure SMS_30
注：和正常组比较#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.01；与VTP1-H剂量组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
蛋白表达变化
由表14和图3可知，和正常组比较，模型组SIRT1蛋白表达水平明显下降(P＜0.01)， 说明负重游泳至力竭会导致骨骼肌组织中SIRT1蛋白表达显著下降。和模型组比较，VTP1-H、 VTP-M骨骼肌中SIRT1蛋白表达显著上调(P＜0.01)，VTP1-L疲劳小鼠骨骼肌中SIRT1蛋白 表达量有上调趋势，但无统计学差异(P＞0.05)。
和正常组比较，模型组小鼠骨骼肌中PGC-1α蛋白表达水平明显下调，且具有显著性差 异(P＜0.01)；和模型组比较，各给药组均能提高疲劳小鼠骨骼肌中PGC-1α蛋白表达水平， 其中VTP1-H上调效果更明显(P＜0.01)。两两比较，VTP1各剂量组间无显著性差异。
和正常组比较，模型组疲劳小鼠骨骼肌中NRF1蛋白表达显著降低(P＜0.01)；和模型 组比较，各治疗组均提高疲劳小鼠骨骼肌中NRF1蛋白的表达(P＜0.01或(P＜0.05)；两两比较，VTP1-HNRF1蛋白表达水平优于VTP-L，且具有显著性差异(P＜0.01)。
表14 VTP1对疲劳小鼠骨骼肌相关蛋白的影响
Figure SMS_31
Figure SMS_32
注：和正常组比较#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.01；与VTP1-H剂量组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
线粒体工作效率直接影响到骨骼肌的能量代谢和氧化功能，机体受到压力及疲劳时，线 粒体的形态、结构和功能会发生改变。机体骨骼肌线粒体生物合成功能由多个因子的调节和 控制，其中SIRT1-PGC-1α-NRF1通路是最为核心的主要调控通路。去乙酰酶抑制剂-沉默信 息调节蛋白(SIRT1)，可以激活过氧化物酶增值激活受体α辅助因子1(PGC-1α)。PGC-1α 是PGC转录激活因子成员之一。PGC-1α和SIRT1被称为了线粒体的生物合成“核心调节器”， 其激活调控线粒体蛋白转录因子受体。核呼吸因子(NRF1)为PGC-1α和SIRT1的下游影响因子，主要是通过激活氧化磷酸化反应相关酶影响线粒体核糖蛋白的表达。线粒体的生物合 成是由SIRT1激动发生，触发PGC-1α的激活，PGC-1α再作用于NRF1，以此循坏反复影响 控制线粒体生物合成进程。因此，PGC-1α、SIRT1和NRF-1为线粒体中生物合成的主要生物 标记物和核心调控因子。在骨骼肌中，PGC-1α是线粒体呼吸、生产和功能的关键调节因子，它共激活因子能力取决于对PGC-1α调节能力，尤其是参与调节编码线粒体的核基因。PGC-1α 在骨骼肌中影响着线粒体含量稳态，转录激活因子对运动引发细胞器的生物合成密切相关。 本研究结果表明，模型组小鼠骨骼肌中SIRT1，NRF1和PGC-1αmRNA及相应蛋白均降低。 而VTP1各剂量组均上调了PGC-1α、SIRT1和NRF1 mRNA及相应蛋白表达，增强了疲劳小 鼠线粒体的生物合成效率，缓减运动疲劳后骨骼肌线粒体的功能损伤。研究中，选取的阳性 药辅酶Q10是线粒体呼吸链上的重要组分，有增强线粒体功能作用。研究结果显示：VTP1 各剂量组和阳性组改善了疲劳小鼠的各项指标。进一步证实，VTP1和阳性药对SIRT1-PGC-1α-NRF1调控通路作用机制呈一致性，两者均可以通过上调其 SIRT1-PGC-1α-NRF1通路中mRNA和相应蛋白的表达，提高骨骼肌线粒体功能，改善运动 疲劳。
结果表明：
VTP1有抗疲劳作用，其机制为上调SIRT1、PGC-1α和NRF1 mRNA和相应蛋白的表达，从而提高骨骼肌线粒体的生物合成能力和效率。
本发明制备得到的具有抗疲劳作用的西藏凹乳芹多糖在制备抗疲劳保健品或药品中的应 用。
可将本发明提供的西藏凹乳芹多糖和药学上可接受的载体制备成颗粒剂、片剂、胶囊剂、 丸剂或口服液等制剂。
有益效果：
本发明通过大量实验筛选出西藏凹乳多糖精制多糖的制备工艺，本发明制备得到的西藏 凹乳多糖具有很好的抗疲劳活性。
附图说明
图1、西藏凹乳芹多糖红外光谱图：(A)粗多糖；(B)VTP1；(C)VTP2。
(A)是西藏凹乳芹粗多糖红外光谱图，(B)是VTP1红外光谱图，(C)是VTP2红外 光谱图。
图2、2万倍和5万倍电镜下小鼠骨骼肌线粒体超微结果电镜照片
NG——正常组，MG——模型组，CoQ10——阳性组，VTP1-H——VTP1高剂量组，VTP1-M——VTP1中剂量组，VTP1-L——VTP1低剂量组。
图3、VTP1对疲劳小鼠骨骼肌中相关蛋白的影响
具体实施例：
根据下述实施例，帮助本领域的技术人员更好地理解本发明。实施例所描述的具体的物 料配比、工艺条件及其结果，不应当对权利要求书中所主张保护的内容形成限制。
一种具有抗疲劳作用的西藏凹乳芹多糖的制备方法，根据发明内容中技术方案，取干燥 的西藏凹乳芹20kg，制备西藏凹乳芹多糖。
并采用HPLC法测定VTP1和VTP2的单糖组成
①混合单糖标样的衍生化：分别精密称定单糖标准品Rha、Man、Rib、Glu、GlcA、Gal、Ara配制成3mg/mL标准品，取各标准单糖20μL混合均匀，即为单糖标准品的混合溶 液。取100μL混合液在5mL具塞试管中，再加100μL 0.3mol/L的NaOH，200μL 0.5mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)的甲醇溶液，混匀；70℃恒温箱45min，放置冷却至室温； 再加100μL 0.3mol/L HCl中和；加氯仿500μL，漩涡混匀，弃氯仿相，重复萃取5次。水层 用0.22μm微孔膜进行过滤，备用。
②样品水解：分别称取14mg的VTP1和VTP2置于安瓿瓶，加2mL 4mol/L三氟乙酸，在120℃封管水解8h，加少量甲醇，干燥，重复操作3-5次，把三氟乙酸蒸干，加水溶解得 样品水解液。
③样品的衍生化：取100μL的水解好的样品溶液，按以上方法来进行衍生。用微孔膜 进行过滤后备用。
④高效色谱条件：即色谱柱：Waters C18柱(250×4.6mm，i.d.5μm)；流动相：0.1mol/L磷酸盐 (pH＝6.7)缓冲液∶乙腈(体积比为83∶17)；柱温：35℃；检测波长：250nm；流速：0.8mL/min； 进样体积：20μL。
对VTP1和VTP2均一性及分子量分布进行测定
用0.2M NaCl溶液将VTP1和VTP2配成5mg/mL的溶液，过滤，取20μL多糖溶液用高效渗透 凝胶色谱(HPGPC)法检测分析。色谱条件：Size-exclusion chromatography；流动相：0.1mol/L蒸馏水； 柱温：35℃；检测波长为250nm；流速为0.4mL/min；进样体积：20μL。
进行FT-IR分析
称取2mg干燥好的VTP1和VTP2样品，用KBr压片，用红外光谱仪于400～4000cm-1吸收波长 范围进行扫描，记录红外光谱图。
实验结果表明：
西藏凹乳芹多糖的提取率为：
所得的西藏凹乳芹粗多糖为浅褐色固体，经过计算的西藏凹乳芹粗多糖收率28.6％ (W/W)。西藏凹乳芹粗多糖经脱色脱蛋白后，所得的西藏凹乳芹多糖(VTP)为白色粉末。 脱蛋白的次数增多西藏凹乳芹多糖损失增大，收率减少，西藏凹乳芹粗多糖用Sevage试剂脱 蛋白7次所对应的西藏凹乳芹多糖的得率分别为37.2％，30％，22.1％，15.2％，11.6％，9.4％， 7.5％(W/W)，所以西藏凹乳芹粗多糖除尽蛋白后最终西藏凹乳芹多糖(VTP)得率为7.5％ (W/W)。
西藏凹乳芹多糖蛋白去除率为：
(1)脱蛋白
①牛血清蛋白标准曲线
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，用牛血清蛋白的浓度作为横坐标，在595nm处测定吸光 度值作为纵坐标，得标准曲线，回归方程为：y＝0.0055x+0.0344(R2＝0.9934)。
②西藏凹乳芹多糖脱蛋白率
根据以上标准曲线，算出西藏凹乳芹粗多糖的蛋白含量为19.3％(W/W)，用Sevag法除 西藏凹乳芹粗多糖蛋白，西藏凹乳芹粗多糖用Sevage试剂(三氯甲烷-正丁醇＝5∶1)重复除 7次后无变性蛋白层出现，吸光度趋于零，表明蛋白已除尽，计算得出蛋白脱除率为89.5％ (W/W)。
多糖的含量为：
苯酚-硫酸法检测西藏凹乳芹多糖总糖含量，葡萄糖作为标准品，得葡萄糖的标准曲线， 葡萄糖标准曲线的回归方程为y＝0.0099x+0.0546(R2＝0.9979)，表明于10～60μg/mL的浓 度范围内，其吸收度值与葡萄糖的含量线性关系良好。所制得的西藏凹乳芹粗多糖的总糖含 量为36.1％，脱蛋白后的西藏凹乳芹多糖的总糖含量为60.5％。
多糖的分离纯化结果为：
①多糖的分离
脱蛋白后西藏凹乳芹多糖用(D101型)大孔吸附树脂和DEAE-琼脂糖凝胶FF柱色谱脱 色和分离，得到四个组分VTP1、VTP2、VTP3和VTP4，在所述多糖中的质量百分比分别为：90.03％、3.82％、0.78％、0.21％。其中VTP-1是由纯水洗脱得到，为白色，易溶于水；VTP2、VTP3和VTP4分别是由0.1、0.2与0.3mol/L氯化钠洗脱得到。四个组分经过脱盐浓缩干燥后，均为白色粉末，易溶于水。其中VTP1和VTP2回收率较高，经透析，冷冻干燥后，经 葡聚糖凝胶层析柱进行了纯化。
②多糖的纯化
VTP1和VTP2经葡聚糖糖凝胶G-100纯化后为一个峰，初步判定VTP1和VTP2为均一多糖，经过计算回收率分别为86％和89.5％，总糖含量分别为90％和93.2％。
VTP1和VTP2的单糖组成情况为：
用高效液相色谱法测定VTP1和VTP2的单糖组成，其结果表明VTP1中含有甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，各单糖的摩尔比为1.14∶1.12∶0.48∶2.83∶6.12∶2.56∶1.20。VTP2含有甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半 乳糖和阿拉伯糖，各单糖的摩尔比为1.16∶1.10∶0.68∶3.83∶6.19∶2.76∶1.27。
VTP1和VTP2高效凝胶渗透色谱分析结果为：
VTP1和VTP2均为单一尖锐对称峰形，说明其为高纯度均一多糖，且VTP1的平均分子量 为1.53×106Da和VTP2的平均分子量为1.45×106Da。
VTP1和VTP2红外光谱分析结果为：
多糖红外光谱如图1，(A)是西藏凹乳芹粗多糖红外光谱图，(B)是VTP1红外光谱图， (C)是VTP2红外光谱图。从图(A)(B)(C)分别于3363.65cm-1、3386.88cm-1、3385.01 cm-1处有很强的吸收峰，为分子中-OH的伸缩振动峰；在2929.29cm-1、2927.13cm-1、2928.60 cm-1处有较弱的吸收峰，为CH2伸缩振动峰；1417.64cm-1、1413.21cm-1、1419.54cm-1处 有吸收峰，为C-H的振动吸收峰，为多糖特征吸收峰。1021.59cm-1、1022.29cm-1、1024.69 cm-1处是醚键(C-O-C)伸缩振动峰，为β型的吡喃糖特征峰。且从图-10中可看出西藏凹 乳芹粗多糖、VTP1和VTP2有相似的吸收峰，有相似官能团。初步判断，VTP1和VTP2含 有β型吡喃糖。
采用Sevag法除西藏凹乳芹多糖蛋白，反复除了7次才能除尽，除蛋白前后的西藏凹乳芹 多糖损失率为29.7％，蛋白去除率89.5％，说明Sevag法除蛋白的效率高，但随脱除次数增 多，多糖的损失率增高。在进行DEAE-琼脂糖凝胶FF柱色谱脱色和分离过程中，采用去离 子水洗脱出来的组分占多糖总含量90.03％，说明西藏凹乳芹多糖中性糖占的比例大。
西藏凹乳芹多糖提取分离后得到VTP1、VTP2、VTP3和VTP4四个组分，其中VTP1和VTP2组分回收率高，是西藏凹乳芹多糖的主要组分，VTP1和VTP2总糖含量分别为90％和93.2％；VTP1和VTP2都含有甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖；VTP1和VTP2平均分子量分别为1.53×106Da和1.45×106Da：VTP1和VTP2均有β-吡喃糖环结构。

Claims (7)

1.一种具有抗疲劳作用的西藏凹乳芹多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(一)西藏凹乳芹粗多糖的制备及初步纯化
(1)西藏凹乳芹粗多糖的制备：
取干燥的西藏凹乳芹，经粉碎后用10倍量的85％乙醇在室温下浸提3次，乙醇提取后的西藏凹乳芹，经过干燥后，按照料液比为1∶10加入蒸馏水，85℃加热提取3次，1h/次，在4500r/min条件下离心20min，收集上清液，60℃减压浓缩至浸膏，在搅拌条件下，将浸膏加入10倍浸膏重量体积的95％乙醇中，室温静置48h，在10000r/min条件下离心10min，沉淀用水溶解，浓缩，冷冻干燥得西藏凹乳芹粗多糖；
(2)西藏凹乳芹多糖的纯化：
多糖纯度直接影响到多糖质量和作用效果，因此对西藏凹乳芹多糖进一步纯化，具体过程如下：
a、采用D101型大孔吸附树脂对以上粗多糖进行脱色，将大孔吸附树脂用95％的乙醇浸泡24h后，倒入10cm×90cm的层析柱，用蒸馏水洗脱平衡12h，将粗多糖溶于水，上样后吸附过夜，用蒸馏水洗脱，减压浓缩洗脱液，冷冻干燥后，得到脱色后的粗多糖；
b、脱蛋白：取脱色后的粗多糖，溶于蒸馏水中，置于分液漏斗，加入糖液的1/2体积试剂配比为三氯甲烷∶正丁醇＝5∶1的Sevag试剂，然后剧烈震荡5min后，静置分层，3000r/min条件下离心，收集上清液，重复操作至无变性蛋白层出现，减压浓缩，加入10倍量95％乙醇，4℃静置过夜，离心，冷冻干燥，得脱蛋白的西藏凹乳芹多糖，命名为VTP(Vicatiathibertica de Boiss Polysaccharide，VTP)；
c、蛋白去除率的计算：蛋白去除率＝(去除蛋白前蛋白的含量-去除蛋白后蛋白的含量)/去除蛋白前蛋白的含量*100％；
(二)对上述西藏凹乳芹多糖含量进行测定
(1)试剂配制
a、苯酚溶液配制：取精制的苯酚加蒸馏水，配制成6％苯酚溶液，备用；
b、标准溶液配制：精密称取0.5000g葡萄糖，于100mL容量瓶中定容，从中取出1mL溶液加水定容到50mL，得到100μg/mL的标准溶液；
(2)标准曲线的制作
用微量移液器分别取100μg/mL的标准溶液0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL定容于50mL的容量瓶中，分别取1mL于试管中，各加入6％苯酚1mL，浓硫酸5mL，摇晃试管，混合，静置，用722型分紫外光度计于490nm处测吸光度值，求算回归方程；
(3)西藏凹乳芹多糖中总糖含量测定
将检测样品配成200μg/mL溶液，然后取样1mL，其他步骤和标准曲线制作一致，检测结束后，计算西藏凹乳芹多糖总糖含量；
(4)3，5-二硝基水杨酸法测所制备西藏凹乳芹多糖中还原糖的含量：
试剂的配置：
a、间羟基联苯的配制：称取间羟基联苯用5mg/mL NaOH溶液配成质量浓度为1.5mg/mL，4℃避光保存；
b、四硼酸钠硫酸溶液配制：取四硼酸钠用浓硫酸配成0.125mol/L，室温保存；
c、葡萄糖醛酸标准溶液的配制：准确称取0.5000g葡萄糖醛酸，用蒸馏水配成100μg/mL的标准溶液；
葡萄糖醛酸标准曲线的制作：
用微量移液器分别取100μg/mL的标准溶液0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL到试管中，加蒸馏水补到1mL，冰浴，加四硼酸钠硫酸溶液5mL，沸水浴，加间羟基联苯溶液100μL，37℃恒温水浴10min，用722型分光光度计于525nm处测吸光度值，求算回归方程，
多糖糖醛酸含量测定：
将检测样品配制成为200μg/mL溶液后，取1mL于试管中，其他步骤和标准曲线制作一致，测量完毕后，计算西藏凹乳芹糖醛酸含量，
多糖得率计算公式：
西藏凹乳芹多糖得率Y(％)＝(WE×(CT-CR))/WP×100
WE为纯化后多糖的重量，WP为每次实验中使用的西藏凹乳芹预处理样品重量，CT和CR分别为纯化后多糖中总糖及还原糖的含量；
(三)对西藏凹乳芹多糖进一步分离纯化
(1)采用DEAE-琼脂糖凝胶FF柱色谱进一步分离纯化，将一定量的DEAE-琼脂糖凝胶FF倒入到2.6cm×20cm的层析柱中，用蒸馏水持续洗涤DEAE柱至pH值为7.0，并用玻璃棒搅拌凝胶排除空气，将西藏凹乳芹多糖配成20mg/mL溶液，上样，自动接样器接样，用去离子水和0.1、0.2、0.3mol/L氯化钠洗脱，用苯酚-硫酸法在490nm跟踪检测西藏凹乳芹多糖吸光度值，绘制洗脱分布曲线图，分段收集，合并洗脱液，透析，浓缩，冷冻干燥48h，得到白色有光泽的4种西藏凹乳芹均一多糖，根据西藏凹乳芹的拉丁名命名为：VTP1、VTP2、VTP3和VTP4分别对应“去离子水”和0.1、0.2、0.3mol/L氯化钠洗脱的成分，在所述多糖中的质量百分比分别为90.03％、3.82％、0.78％、0.21％；
(2)取一定量的葡聚糖凝胶G-100加水溶胀后，100℃煮沸1h，冷却至室温，倒入到固定好的2.6cm×20cm的层析柱中，接上自动接样器，用蒸馏水洗脱平衡24h，将VTP1和VTP2用水溶解，上样，水洗脱，用苯酚-硫酸法于490nm跟踪检测西藏凹乳芹多糖的吸光度值，绘制洗脱分布曲线图，分段收集，合并洗脱液，冷冻干燥，得到更纯的均一多糖，VTP1的平均分子量为1.53×106Da，VTP2的平均分子量为1.45×106Da。
2.根据权利要求1所述制备方法制备得到的具有抗疲劳作用的西藏凹乳芹多糖，其特征在于，VTP1和VTP2都含有甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖，VTP1中各单糖的摩尔比为1.14∶1.12∶0.48∶2.83∶6.12∶2.56∶1.20；VTP2中各单糖的摩尔比为1.16∶1.10∶0.68∶3.83∶6.19∶2.76∶1.27。
3.根据权利要求1所述制备方法制备得到的具有抗疲劳作用的西藏凹乳芹多糖，其特征在于，VTP1和VTP2中都有β-吡喃糖环结构。
4.根据权利要求1所述制备方法制备得到的具有抗疲劳作用的西藏凹乳芹多糖，其特征在于，将西藏凹乳芹多糖VTP1应用于制备通过提高SOD活性，降低MDA含量，从而增强机体的抗氧化应激作用的抗疲劳保健品、药品或食品方面的应用。
5.根据权利要求1所述制备方法制备得到的具有抗疲劳作用的西藏凹乳芹多糖，其特征在于，将西藏凹乳芹多糖VTP1应用于制备通过增加骨骼肌mtDNA转录和复制，促进骨骼肌线粒体生物合成，并改善骨骼肌线粒体功能和形态的抗疲劳保健品、药品或食品方面的应用。
6.根据权利要求1所述制备方法制备得到的具有抗疲劳作用的西藏凹乳芹多糖，其特征在于，将西藏凹乳芹多糖VTP1应用于制备通过上调SIRT1-PGC-1α-NRF1通路中mRNA和相应蛋白的表达，从而提高骨骼肌线粒体功能的抗疲劳保健品、药品或食品方面的应用。
7.根据权利要求1所述制备方法制备得到的具有抗疲劳作用的西藏凹乳芹多糖在制备抗疲劳保健品或药品中的应用。
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