CN116425901B - 苦笋多糖及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及苦笋多糖及其制备方法和用途，属于药物和保健品领域。本发明提供了一种苦笋多糖，它是由原料苦笋提取苦笋粗多糖，再经分离纯化得苦笋多糖BSP‑1、BSP‑2、BSP‑3。本发明还提供了该多糖的制备方法以及在制备具有免疫调节作用的药物或保健品中的用途。本发明苦笋多糖纯度高、多糖结构明确，以巨噬细胞RAW264.7为细胞模型，对纯化后苦笋多糖进行免疫活性评价，具有较好的免疫调节活性，为苦笋多糖在食品和医药领域的开发应用提供理论依据，有利于实现苦笋资源的高值化利用。
Description
技术领域
本发明涉及苦笋多糖及其制备方法和用途，属于药物和保健品领域。
背景技术
苦笋为禾本科苦竹PleioblastusamarusKeng f.的嫩芽，广泛分布于长江以南，资源丰富。苦笋富含多种营养成分，具有高蛋白、高膳食纤维，低脂肪、低胆固醇的特点，是广泛应用的食材。同时，苦笋具有悠久药用历史，始载于唐代《本草拾遗》，现代研究表明苦笋富含多酚、黄酮、生物碱和多糖等多种活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、降血糖等药理作用，是一种兼顾食用与功能性的、经济价值高的生物资源。然而，目前苦笋除直接食用与简单加工进入食品市场外，鲜有其它用途，产品附加值低，严重制约苦笋资源的深度利用与产业发展。虽然苦笋因其资源丰富与自身富含多糖，是天然多糖的理想原料，但是目前有关苦笋多糖的制备与结构特征的研究极少，结构表征以及构效关系尚不明确，直接影响苦笋多糖的深入研发。
目前，国内外对竹笋多糖的研究主要集中在毛竹笋、方竹笋、雷竹笋、大叶麻竹笋、刚竹笋，包括竹笋多糖的提取分离、结构以及活性等方面。竹笋多糖的提取方法主要有热水提取，超声波辅助提取、酶法辅助提取等方法，为加速多糖的溶出，提高多糖提取率，常采用多种方法联用。陈灿辉等人采用微波和超声波联用提取毛竹笋笋头多糖进行提取，Guang-jing Chen等采用分级醇沉法对方竹笋多糖进分离，以70%、75%和80%的乙醇对方竹笋多糖进行醇沉得到了CPS70、CPS75和CPS80三种不同多糖组分。竹笋资源丰富，种类繁多，研究表明，对于不同来源的竹笋多糖，其分子量、单糖组成、糖苷键类型以及连接方式等结构特征差异较大。Azmi等人对毛竹笋多糖进行提取并运用凝胶色谱法测得竹笋粗多糖的分子量约为7.49 × 103 Da，采用阴离子交换色谱纯化的五个不同组分(F1~F5 )，分子量分别约为1.55、1.47、1.68、1.69和1.55 kDa，FT-IR表明其含有β-葡聚糖。Jinsong Wu等人采用DEAE纤维素-52和Sephadex G-50对麻竹笋多糖进行分离纯化，得到3种多糖BSP1A、BSP2A和BSP3B，其分子量分别为10.2、17.0和20.0 kDa，不同组分具有不同的单糖组成及摩尔比，三种多糖均存在O-糖肽键，BSP2A和BSP3B均含有β-d-吡喃糖环，BSP1A同时存在β-d-吡喃糖和α-d-吡喃糖糖环，且三种多糖的连接方式不同。
多糖具有多种生物活性，包括免疫活性、抗肿瘤、降血糖、抗氧化、抗病毒、抗辐射、抗衰老等活性，因其具有安全、副作用小、可生物降解性、可再生、环境友好以及低成本等优点，被广泛应用于医药、食品、纺织、化妆品等行业，是天然产物研究的热点。多糖的获取与结构表征是其生物活性研究的基础，结构分析是糖化学的核心所在。
免疫调节活性是天然多糖最突出的作用之一，大多数植物多糖通过提高机体巨噬细胞及淋巴细胞达到免疫效果，而目前苦笋多糖主要集中在体外抗氧化活性方面，免疫活性研究尚属空白。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种苦笋多糖，本发明还提供了该苦笋多糖的制备方法和用途。
本发明提供了一种苦笋多糖，它是由原料苦笋提取苦笋粗多糖，再经分离纯化得苦笋多糖BSP-1、BSP-2、BSP-3，其中：
BSP-1、BSP-2和BSP-3的总糖分别为： 97.12±4.43%， 94.50±3.89%， 87.65±1.77%；
BSP-1、BSP-2和BSP-3的糖醛酸含量分别为： 4.81±0.11%，10.65±0.29%，33.85±0.11%；
BSP-1、BSP-2和BSP-3的重量平均分子量分别为12.36±0.45 kDa，19.14±0.32kDa，20.96±0.58 kDa；
BSP-1和BSP-2主要由八种单糖组成，其中BSP-1的葡萄糖含量为75.99±0.07%；BSP-2的半乳糖和阿拉伯糖分别为35.20±0.08%和27.43±0.05%；BSP-3主要由十种单糖组成，其中半乳糖含量为39.53±0.10%。
进一步优选地，所述的BSP-1、BSP-2和BSP-3的总糖分别为：97.12%，94.50%，87.65%；
BSP-1、BSP-2和BSP-3的糖醛酸含量分别为：4.81%，10.65%，33.85%；
BSP-1、BSP-2和BSP-3的重量平均分子量分别为12.36 kDa，19.14 kDa，20.96kDa；
BSP-1和BSP-2主要由八种单糖组成，其中BSP-1的葡萄糖含量为75.99%；BSP-2的半乳糖和阿拉伯糖分别为35.20%和27.43%；BSP-3主要由十种单糖组成，其中半乳糖含量为39.53%。
其中，所述的
BSP-1主要含T-Linked Araf、3-Linked Glcp、4-Linked Glcp、6-Linked Glcp四种糖苷键；
BSP-2主要含T-Linked Araf、3,5-Linked Araf、3,6-Linked Galp三种糖苷键；
BSP-3主要含T-Linked Araf、3,5-Linked Araf、3-Linked Galp、3,6-LinkedGalp、2,3,4- Linked Xylp五种糖苷键；
BSP-1、BSP-2和BSP-3同时存在α和β构型，且同时存在呋喃糖和吡喃糖；
BSP-2含有a-L-Rhap，BSP-3含有a-L-Rhap以及糖醛酸结构。
所述的BSP-1由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖组成，摩尔比为0.26:0.09:0.06:0.14:33.63:3.32:2.24:4.51；
BSP-2由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖组成，摩尔比为0.31:0.10:0.68:1.54:4.10:10.13:4.03:7.90；
BSP-3由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖组成，摩尔比为0.48:0.21:2.00:2.32:1.12:1.79:9.62:2.53:3.55:0.72。
本发明还提供了所述的苦笋多糖的制备方法，它包括如下步骤：
a、取苦笋粉末，95%乙醇浸泡，残渣于55℃烘箱烘干；
b、加水，于55-90℃下浸提60-180min，苦笋与水的料液比为：1:10-50 g/mL，过滤，滤液浓缩，加入95%乙醇沉淀，过液，离心得多糖沉淀，冷冻干燥，即得苦笋粗多糖；
c、脱蛋白、脱色素：
d、分离、纯化：采用DEAE-52纤维素柱层析对多糖进行分离，再用Sephadex G-100凝胶柱进行纯化，即得多糖。
其中，步骤b的提取条件为：88℃下浸提150 min，苦笋与水的料液比为：1:41 g/mL；
步骤c所述的脱蛋白方法为：采用seveg法除蛋白，加入氯仿-正丁醇（4:1），振摇，离心，重复上述操作，直至无明显蛋白层，将残留有机溶剂去除后，冷冻干燥得到脱蛋白的苦笋粗多糖；
步骤c所述的脱色素方法为：将苦笋粗多糖配制成10 mg/mL的溶液，氨水调节pH8~9，加入30% H2O2，加量每100 mL溶液中不超过 30 mL H2O2，温度40℃，时间4 h，将脱色后的多糖溶液进行透析、浓缩、冷冻干燥得到脱色的苦笋粗多糖；
步骤d所述的分离方法为：取DEAE-52纤维素加水浸泡，抽干，0.5 mol/L盐酸浸泡，去离子水洗至中性，抽干，0.5mol/L氢氧化钠浸泡，去离子水洗净至中性，抽干，去离子水浸泡，装柱；用纯水冲洗2个柱体积，然后用2.0 mol/L的NaCl溶液冲洗2个柱体积，再用纯水冲洗2个柱体积；取除蛋白和色素后的多糖样品上样，采用纯水和0.1 mol/L、0.3 mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L的NaCl溶液洗脱，分别收集洗脱液，绘制洗脱曲线，合并，透析，冷冻干燥；
步骤d所述的纯化方法为：取Sephadex G-100加入超纯水浸泡，充分溶胀，除去漂浮物，抽干，用0.1mol/L NaOH浸泡，抽滤，超纯水洗至中性，装柱；用纯水冲洗2个柱体积，然后用0.1mol/L的NaCl溶液冲洗2个柱体积，再用纯水冲洗2个柱体积；取经DEAE-52 纤维素柱分离后的苦笋多糖上样，采用纯水进行洗脱，收集洗脱液，绘制洗脱曲线，合并，冻干后得纯化多糖组分。
本发明还提供了苦笋多糖在制备具有免疫调节作用的药物或保健品中的用途。
进一步优选地，所述的药物或保健品是促进细胞增殖的药物或保健品。
进一步优选地，所述的药物或保健品是提高巨噬细胞的吞噬能力的药物或保健品。
本发明苦笋多糖纯度高、多糖结构明确，以巨噬细胞RAW264.7为细胞模型，对纯化后苦笋多糖进行免疫活性评价，具有较好的免疫调节活性，为苦笋多糖在食品和医药领域的开发应用提供理论依据，有利于实现苦笋资源的高值化利用。
附图说明
图1料液比对多糖提取率的影响图；
图2提取时间对多糖提取率的影响图；
图3提取温度对多糖提取率的影响图；
图4 DEAE-52纤维素柱洗脱曲线图；
图5 BSP-1(A)、BSP-2（B）和BSP-3（C）的Sephadex G-100 凝胶柱洗脱曲线图；
图6牛血清蛋白标准曲线图；
图7半乳糖醛酸标准曲线图；
图8 苦笋多糖纯化组分的紫外光谱图；
图9 苦笋多糖纯化组分的HPGPC色谱图；
图10苦笋多糖纯化组分单糖组成的HPLC色谱图；
图11苦笋多糖纯化组分的红外光谱图；
图12 BSP-1的1H-NMR谱（A）和13C-NMR谱（B）图；
图13 BSP-2的1H-NMR谱（A）和13C-NMR谱（B）图；
图14 BSP-3的1H-NMR谱（A）和13C-NMR谱（B）图；
图15 苦笋多糖纯化组分的刚果红三螺旋构象图；
图16 苦笋多糖纯化组分的扫描电镜图（A1：BSP-1放大400倍; A2：BSP-1放大10000倍; A3：BSP-1放大50000倍; B1：BSP-2放大400倍; B2：BSP-2放大10000倍; B3：BSP-2放大50000倍; C1：BSP-3放大400倍; C2：BSP-3放大10000倍; C3：BSP-3放大50000倍）；
图17苦笋多糖纯化组分对巨噬细胞RAW264.7细胞增殖能力的影响图；与对照组相比，a) P＜0.05, b) P＜0.01, c) P＜0.001；
图18 苦笋多糖纯化组分对巨噬细胞RAW264.7细胞吞噬活性的影响图；与对照组相比，a) P＜0.05, b) P＜0.01, c) P＜0.001；
图19 苦笋多糖纯化组分对巨噬细胞RAW264.7细胞分泌ROS的影响图；与对照组相比，a) P＜0.05, b) P＜0.01, c) P＜0.001；
图20苦笋多糖纯化组分对巨噬细胞RAW264.7细胞释放NO的影响图；与对照组相比，a) P＜0.05, b) P＜0.01, c) P＜0.001；
图21 苦笋多糖纯化组分对巨噬细胞RAW264.7细胞分泌细胞因子的影响图：A：IL-1β；B：IL-6；C：TNF-α；与对照组相比，a) P＜0.05, b) P＜0.01, c) P＜0.001。
具体实施方式
试验例1本发明苦笋多糖的提取工艺优化
1、试验材料
苦笋样品采自四川省峨眉山市寨子村，经西南民族大学任艳副教授鉴定为禾本科苦竹（PleioblastusamarusKeng f.）的嫩芽，采集后清洗、剥壳、焯水1 min后烘干、打粉、过4号筛，于干燥器中保存备用。
实验方法
2.1苦笋多糖含量测定
采用苯酚-硫酸法测定笋多糖含量。配制1.0 mg/mL的葡萄糖标准溶液，取标准溶液稀释成0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1 mg/mL的葡萄糖溶液，分别取1 mL 0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1 mg/mL的葡萄糖溶液，依次加入5%的苯酚溶液，浓硫酸，混合均匀后，100℃水浴15 min后，检测吸光度（λ490 nm）并建立葡萄糖标准曲线：y=4.5732x - 0.0135，R²= 0.9982，其中y为吸光度，x为葡萄糖浓度(mg/mL)。根据葡萄糖标准曲线计算苦笋多糖质量浓度。
式中，c为多糖提取液的质量浓度，mg/mL；V为加入样品液体积，mL；D为稀释倍数；m为样品质量，mg。
2.2 苦笋粗多糖提取工艺
2.2.1 苦笋样品预处理
取苦笋粉末，使用95%乙醇浸泡24 h以去除色素和小分子物质，残渣于55℃烘箱烘干后，于干燥器保存备用。
2.2.2 苦笋粗多糖提取
称取1.0 g苦笋粉末，按料液比1:30 g/mL加入超纯水，在80℃下浸提120min，过滤，滤液浓缩至适当体积，加入 4倍量95%乙醇沉淀，4℃箱内过夜，离心得多糖沉淀，冷冻干燥，得到粗多糖cBSP。
2.2.3 单因素实验
参照上述操作，固定因素水平为料液比1:30 g/mL、提取温度80℃、提取时间120min，分别考察的不同料液比（1:10 g/mL、1:20 g/mL、1:30 g/mL、1:40g/mL、1:50 g/mL）、不同的提取温度（55℃、65℃、75℃、85℃、95℃）以及不同的提取时间（60 min、90 min、120min、150min、180 min）对苦笋多糖提取率的影响。
2.2.4响应面实验设计
在单因素实验结果基础上，采用Box-Behnken进行实验设计，以料液比（A）、提取时间（B）和提取温度（C）进行编码，以苦笋多糖提取率作为响应值，进行三因素三水平的响应面试验分析，得到苦笋多糖提取的适宜工艺参数。试验因素与编码水平设计见表1。
表1响应面因素及水平设计
2.2.5数据处理与分析
每组试验均重复3次，测定数据以平均值±标准差表示。采用 Design-Expert.V8.0.6.1 和 SPSS 17.0 软件对试验数据进行分析，p<0.05 则认为样品间具有显著性差异，所得结果进一步用 Excel 2016 作图。
3结果与讨论
3.1单因素实验
3.1.1 料液比对多糖提取率的影响
由图1可知，苦笋多糖的提取率随着料液比呈先增大后减小的趋势。适当的液料比可以提高多糖的溶出率，低料液过低时，多糖浓度较高，黏度较大，多糖的扩展速度慢会阻止多糖的有效溶出，提取不完全，溶剂量越大，在溶解时可形成较大的浓度差，利于多糖溶解，但当料液比过高时，原料被过度稀释使多糖更易被水解，从而导致多糖提取率下降，因此，最佳料液比确定为1:40 g/mL。
3.1.2提取时间对多糖提取率的影响
由图2可知，苦笋多糖提取率随着提取时间的延长先增加后减小。其原因可能是随着时间的延长，多糖溶出较充分，但随着提取时间过长，会导致部分多糖水解，从而导致多糖提取率降低。因此，最佳提取时间确定为120 min。
3.1.3提取温度对多糖得率的影响
由图3可知，苦笋多糖提取率随着提取温度的升高而逐渐增大。其原因可能是随着温度升高，分子运动加快，多糖的溶出和分散增加，多糖的提取率增大，但温度过高可能会破坏多糖结构，导致多糖的提取率下降。因此，最佳提取度确定为85℃。
3.2响应面分析及优化
试验方案设计及结果见表2。
表2响应面试验设计及结果
利用Design-Expert.V8.0.6.1软件，建立料液比、提取时间及提取温度三因子数学回归模型为：提取率=4.12+0.20*A+0.085*B+0.048*C-0.11*A*B-0.055*A*C+0.12*B*C-0.29*A2-0.046*B2-0.24*C2。
表3回归模型的方差分析
由表3可知，此模型P<0.0001，拟合检验极显著，失拟项P=0.6564>0.05，不显著，校正模型的相关系数R2值为0.9952，决定系数R2adj值为0.9890，说明选用的模型与实际情况拟合较好、误差小，能较好反映出各因素与苦笋多糖提取率之间关系。一次项中，料液比、提取时间和提取温度均影响极显著 (P<0.01)苦笋多糖提取率，二次项中，A2、C2影响均极显著 (P<0.0001)，B2影响显著（P<0.05），AB、BC影响极显著（P<0.01），AC影响显著(P<0.05)。根据F值的大小可知，各因素对苦笋多糖的提取率影响大小依次为A>B>C，即料液比>提取时间>提取温度。
3.3各因素交互作用分析
响应面曲线的陡峭程度反应各因素交互作用的显著性，响应面曲线越陡峭，越显著。苦笋多糖的提取率呈现先增加后降低的趋势，料液比和提取时间、料液比和提取温度、提取时间和提取温度对多糖提取率的影响曲线较陡，说明其影响作用较为显著，和表3中的显著性检验结果一致。各因素交互作用对于苦笋多糖提取率影响顺序依次为：BC＞AB＞AC。
3.4回归模型的验证
通过回归模型的分析，以苦笋多糖提取率为评价指标，苦笋多糖最佳的提取工艺为：料液比为1:41.26 g/mL、提取时间150 min、提取温度88.34℃，在此条件下，模型预测苦笋多糖提取率为4.20%。考虑到在试验过程的可操作性，将苦笋多糖提取的最佳工艺调整为料液比1:41g/mL、提取时间150 min、提取温度88℃。按照最佳工艺条件进行试验，用以验证模型的准确度，共设置3次平行试验，苦笋多糖平均提取率为4.18±0.09%，与预测值基本相符，表明方法可行。
实施例2 本发明苦笋多糖分离纯化
1 苦笋多糖的提取
称取2.5 kg苦笋壳粉末，使用95%乙醇浸泡24 h以去除色素和小分子物质，残渣于55℃烘箱烘干后，按2.4.4下条件提取，冷冻干燥，得到苦笋粗多糖cBSP。
2 苦笋多糖脱蛋白
将苦笋粗多糖样品溶于一定量的纯水中，配置成每100 mg/mL的多糖溶液，采用seveg法除蛋白，加入1/4体积的氯仿-正丁醇（4:1），振摇30 min，离心（3000 r/min，10min），重复上述操作，直至无明显蛋白层，将残留有机溶剂去除后，冷冻干燥得到脱蛋白的苦笋粗多糖。
3 苦笋多糖脱色素
3.1 多糖中有色物质波长确定
称取苦笋粗多糖配制成10 mg/mL，通过在可见光区进行全波长扫描，确定多糖中有色物质的波长。根据吸收波长曲线选取450 nm为色素检测波长。
3.2 多糖脱色率和多糖损失率的计算
将苦笋粗多糖配制成10 mg/mL，多糖脱色前测量吸光度A1，经过脱色处理再次测量吸光度A2。多糖脱色率（%）=（A1-A2）/A1*100。
将多糖配制成10 mg/mL的多糖溶液，按“2.3.1”测量脱色前测定多糖含量m1，脱色后再次测定其含量m2。多糖损失率（%）=（m1-m2）/m1*100。
3.3 多糖脱色素工艺
（1）H2O2脱色采用赵浩晨等人的方法稍作修改，将苦笋粗多糖配制成10 mg/mL的溶液，氨水调节pH8~9，30% H2O2加量每100 mL溶液中不超过 30 mL H2O2为宜，温度40℃，时间4h，将脱色后的多糖溶液进行透析、浓缩、冷冻干燥得到脱色的苦笋粗多糖。
（3）大孔树脂脱色采用何余堂, 宫照杰. 玉米花丝多糖脱色方法的研究[J]. 食品科学, 2009, 30(18): 50-53的方法稍作修改，取2.5g处理好的大孔树脂，加入5mL多糖溶液于锥形瓶中，恒温水浴（40℃）振荡2 h。过滤，滤液调节pH为中性，计算多糖脱色率和多糖损失率。
（4）阴离子树脂脱色同大孔树脂脱色。
（5）阳离子树脂脱色同大孔树脂脱色。
3.4 苦笋多糖纯化
3.4.1 DEAE-52纤维素柱
为了进一步研究苦笋多糖的结构特征，采用DEAE-52纤维素柱层析对多糖进行分离。取DEAE-52纤维素加水浸泡2 h，抽干，0.5 mol/L盐酸浸泡2 h，去离子水洗至中性，抽干，0.5mol/L氢氧化钠浸泡2 h，去离子水洗净至中性，抽干，去离子水浸泡，装柱。用纯水冲洗2个柱体积，然后用2.0 mol/L的NaCl溶液冲洗2个柱体积，再用纯水冲洗2个柱体积。取除蛋白和色素的多糖样品上样。采用纯水和0.1mol/L、0.3 mol/L、0.5 mol/L、1.0 mol/L的NaCl溶液洗脱，收集洗脱液，绘制洗脱曲线，合并，透析72 h，冷冻干燥，再用SephadexG-100凝胶柱进行纯化。
3.4.2 Sephadex G-100 凝胶柱
取Sephadex G-100加入过量超纯水浸泡24 h，充分溶胀，除去漂浮物，抽干，用0.1mol/LNaOH浸泡2 h，抽滤，超纯水洗至中性，装柱。用纯水冲洗2个柱体积，然后用0.1mol/L的NaCl溶液冲洗2个柱体积，再用纯水冲洗2个柱体积。取经DEAE-52 纤维素柱分离后的苦笋多糖上样，采用纯水进行洗脱，收集洗脱液，绘制洗脱曲线，合并，冻干后得纯化多糖组分。
3.5 苦笋多糖理化性质测定
3.5.1 总糖含量测定
测定苦笋多糖组分中总糖含量。
3.5.2 蛋白含量测定
采用考马斯亮蓝法检测蛋白含量。配制1.0 mg/mL的牛血清蛋白标准溶液。取标准溶液稀释成0.01，0.02，0.04，0.06，0.08 mg/mL的标准溶液。分别取1 mL 0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1 mg/mL标准溶液，加入5 mL考马斯亮蓝溶液，混匀并避光放置10 min，检测吸光度（λ595nm）并绘制标准曲线。精密称取纯化后的苦笋多糖样品，配制成1.0 mg/mL的多糖溶液，取样1 mL，按上述方法测定吸光度，并根据牛血清蛋白标准曲线计算苦笋多糖中蛋白质含量。
3.5.3 糖醛酸含量测定
采用间羟基联苯法测定糖醛酸的含量。配制0.1 mg/mL的半乳糖醛酸标准溶液。取标准溶液稀释成0.01，0.02，0.04，0.06，0.08 mg/mL的半乳糖标准溶液。分别取1 mL 0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1 mg/mL的半乳糖醛酸标准溶液于冰水浴中，加入5 mL四硼酸钠/硫酸溶液，混匀后煮沸5 min，冷却，加入100 μL 1.5 mg/mL的间羟基联苯溶液，混匀放置15min，检测吸光度（λ526nm）并绘制标准曲线。精密称取纯化后的多糖样品，配制成0.1 mg/mL的多糖溶液，按上述方法测定吸光度，根据半乳糖醛酸标准曲线计算苦笋多糖中糖醛酸的质量浓度。
3.6 数据处理与分析
每组试验均重复3次，测定数据以平均值±标准差表示。采用 Design-Expert.V8.0.6.1 和 SPSS 17.0 软件对试验数据进行分析，P<0.05则认为样品间具有显著性差异，所得结果进一步用 Excel 2016 作图。
4结果与讨论
4.1 苦笋多糖脱蛋白
采用Sevage法对苦笋粗多糖除蛋白，重复操作7次后，苦笋粗多糖溶液无明显蛋白层。
4.2苦笋多糖脱色
分别检测不同方法脱色前后的多糖脱色率和多糖损失率，结果见表4，苦笋多糖脱色率结果如下：大孔树脂（89.76%）＞H2O2（85.54%）＞阴离子树脂（38.85%）＞阳离子树脂（11.31%）。多糖损失率为：大孔树脂（52.76%）＞阴离子树脂（38.33%）＞H2O2（32.10%）＞阳离子树脂（23.02%）。采用H2O2脱色的多糖脱色率高，多糖损失率低。但该方法操作条件苛刻，H2O2可能破坏多糖结构，需严格控制反应条件。
表4多糖脱色率和损失率
4.3苦笋多糖分离纯化
4.3.1 DEAE-52纤维素柱层析
采用DEAE-52纤维素柱对苦笋多糖进行分离，依次以纯水、0.1 mol/L、0.3 mol/L、0.5mol/L、1.0 mol/LNaCl溶液为洗脱液进行洗脱，各个组分的洗脱曲线如图4所示。苦笋多糖经纯水、0.1 mol/L、0.3 mol/L、0.5mol/LNaCl依次洗脱得到四个苦笋多糖组分，分别命名为BSP1，BSP2，BSP3，BSP4，由于BSP4 组分多糖在收集后得到的少，因此就不做研究，而BSP1，BSP2，BSP3冷冻干燥后，进一步用Sephadex G-100凝胶柱纯化。
4.3.2 Sephadex G-100 凝胶柱层析
BSP1、BSP2和BSP3经过Sephadex G-100 凝胶柱层析进一步纯化，同样采用苯酚-硫酸法测定多糖含糖量绘制洗脱曲线，如图5所示。BSP1，BSP2，BSP3以水作为洗脱液进一步用Sephadex G-100凝胶柱纯化后，其峰型较对称，收集对应管数洗脱液，减缩，冷冻干燥得到三个苦笋多糖组分，分别命名为BSP-1，BSP-2，BSP-3。
4.4苦笋多糖理化性质测定
4.4.1 总糖含量测定
根据2.3.1所述方法测定多糖含量，带入2.3.1标准曲线y=4.5732x - 0.0135，R²= 0.9982，计算BSP-1，BSP-2，BSP-3的多糖含量分别为：97.12%，94.50%，87.65%。
4.4.2 蛋白含量测定
根据3.3.5.2所述方法建立标准曲线如图6所示：y=4.0525x+0.2509，R2=0.997。BSP-1未检测到蛋白，BSP-2和BSP-3蛋白含量分别为0.26%和0.98%。
4.4.3 糖醛酸含量测定
所述方法建立标准曲线如图7所示：y=5.3503x-0.0123，R2=0.9974。BSP-1、BSP-2和BSP-3的糖醛酸含量分别为：4.81%，10.65%，33.85%。
5小结
本发明采用Sevage法对苦笋粗多糖除蛋白，该法是应用蛋白质在氯仿等有机溶剂中会变性析出沉淀的原理来去除蛋白质，该方法条件温和，适用性广，对多糖结构友好。通过考察，采用Sevage法对苦笋粗多糖脱蛋白重复操作7次后，苦笋粗多糖溶液无明显蛋白层，达到去除杂蛋白效果。
H2O2脱色为植物多糖常用的脱色方法，该方法的脱色效果好，多糖损失率低。实验最终确定30% H2O2对苦笋粗多糖脱色，多糖脱色效果好，脱色率85.54%，多糖损失率为相对较低，仍有32.10%，推测可能由于该方法操作条件相对苛刻，H2O2可能破坏多糖结构，因此需严格控制反应条件。
柱层析是多糖分离纯化最通用方法，其中DEAE 纤维柱的离子交换基团排列疏松呈弱碱性，具有较大表面积，多糖能自由进入并迅速进行扩散，对大分子吸附能力较弱，一定浓度的盐溶液就可将其洗脱。本发明采用DEAE纤维素柱联合Sephadex凝胶柱进行多糖的分离纯化。使用 DEAE 纤维素柱对苦笋多糖进行分离，由于中性糖不能够被吸附，因此首先采用超纯水将中性糖洗脱下来，再依次用不同浓度NaCl溶液对酸性多糖行等梯度洗脱，得到四个多糖组分BSP1，BSP2，BSP3，BSP4。其中BSP1，BSP2，BSP3进一步用Sephadex G-100凝胶柱纯化，纯化后的多糖峰型较对称，纯度较高得到BSP-1，BSP-2，BSP-3。多糖分离纯化过程中，由于使用氯化钠溶液进行洗脱，透析过程除盐不彻底、以及容易吸湿等因素，容易测定值可能低于真实含量。本研究采用苯酚-硫酸法进行含量测定，结果表明BSP-1、BSP-2和BSP-3的多糖含量分别为：97.12%，94.50%，87.65%，总糖含量较高，说明所制备的多糖纯度较高。BSP-1中未检测到蛋白存在，BSP-2和BSP-3蛋白含量分别为0.26%和0.98%，结果表明在前期经过Sevage法除蛋白，柱层析分离纯化后，BSP-1、BSP-2和BSP-3的蛋白质含量都极低，说明蛋白质去除的较为彻底。BSP-1、BSP-2和BSP-3的糖醛酸含量分别为：4.81%，10.65%，33.85%，均属于酸性多糖。
实施例3 本发明苦笋多糖的结构表征
1 苦笋多糖的纯度鉴定
采用Xin Gao等人的方法分析苦笋多糖（BSP-1，BSP-2，BSP-3）是否有蛋白质及核酸残留。
2 苦笋多糖的相对分子量测定
采用HPGPC法测定苦笋多糖（BSP-1，BSP-2，BSP-3）的相对分子量。将苦笋多糖样品（BSP-1，BSP-2，BSP-3）分别配成 2 mg/mL 的水溶液，将不同相对分子质量的窄分布普鲁兰多糖（642000、334000、49400、22000、6300）配成 2 mg/mL 的水溶液作为标准溶液，用0.45μm微孔滤膜过滤后进样，测定样品的保留时间。色谱条件：采用HPLC-RID仪器，色谱柱为TSKgel GMPWXL凝胶色谱柱（300 mm×7.8 mm，13 μm），流动相为 0.1 mol/L NaNO3溶液，流速为0.6 mL/min，进样量20 μL，柱温35℃。
3 苦笋多糖的单糖组成
用HPLC法测定了苦笋多糖（BSP-1，BSP-2，BSP-3）的单糖组成。称取苦笋多糖（BSP-1，BSP-2，BSP-3）样品各10.0 mg，用2 mL的2MTFA在121℃下水解2 h，后加入等体积甲醇，减压浓缩至干燥去除TFA，重复3次。加入1 mL纯水溶解，取水解液0.5 mL与0.2 mL 0.5M PMP甲醇溶液和0.2 mL 0.3 M NaOH混合，在70℃下反应30min。反应结束后用0.3 M HCl中和（pH6~7）停止反应，再用等体积氯仿萃取三次。上层水层用0.22 μm的微孔滤膜过滤后，经HPLC测定分析。将混标样品配置成1.0 mg/mL，取0.5 mL混标溶液与0.2 mL 0.5 M PMP甲醇溶液和0.2 mL 0.3 M NaOH混合，在70℃下反应30 min。反应结束后用0.3 M HCl中和（pH6~7）停止反应，再用等体积氯仿萃取三次。上层水层用0.22 μm的微孔滤膜过滤后，经HPLC测定分析。
色谱条件：采用COSMOSIL 5C18-MS-II色谱柱（4.6 mm I.D.×250 mm），流动相为0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.7）和乙腈（84:16，v/v），流速为1.0 mL/min，紫外检测波长250nm，柱温35℃。
4 苦笋多糖的红外光谱分析
采用Zheng Zhang等人的方法对苦笋多糖（BSP-1，BSP-2，BSP-3）进行红外光谱分析。
5 苦笋多糖的甲基化分析
采用Needs法进行多糖甲基化分析。
5.1 碳化二亚胺还原
采用碳化二亚胺法将苦笋多糖（BSP-1，BSP-2，BSP-3）中的羧基还原。称取10 mg苦笋多糖（BSP-1，BSP-2，BSP-3），加1 mL水溶解，加入1 mL 100 mg/mL的碳二亚胺溶液，用HCl调节pH4.76(4.0~6.0)后反应2 h。反应结束后加入2 mL 30 mg/mL的NaBH4还原2 h，再加入HCl调节pH7，继续稳定2 h，然后将反应液透析48 h，透析完成后将样品冷冻干燥，再进行甲基化处理。
5.2 甲基化反应
取还原后的多糖溶于5 mL DMSO中，磁力搅拌，直至完全溶解。加入40 mg氢氧化钠粉，超声作用30分钟。然后在液氮冰浴中加入1 mL碘甲烷，冰浴中超声作用15 min，第二次加1 mL碘甲烷，冰浴中超声作用15 min，第三次加1 mL碘甲烷，然后在冰浴中超声作用30min。甲基化反应结束后，加6 mL去离子水终止反应，向反应液中加入氯仿萃取（至少3次），有机相结合，再加入去离子水萃取有机相。在有机相中加入1.0 g无水硫酸钠粉末以去除水分。取三氯甲烷层，进行红外光谱检测，确定甲基化程度，若3600-3200 cm-1区间的羟基峰完全消失，说明甲基化完全。将氯仿层减压浓缩即为完全甲基化的样品。
5.3 水解反应
将甲基化样品溶于3 mL甲酸在100℃下水解3 h进行解聚，后加入等体积甲醇，减压浓缩至干燥去除过量甲酸，重复4次。然后在121℃下用3 mL 2 MTFA水解2 h。待水解结束后，后加入等体积甲醇，减压浓缩至干燥去除过量TFA，重复3次。
5.4 还原反应
水解后的样品加入2 mL超纯水使样品溶解，加入20 mg NaBH4，40℃水浴40 min进行还原。加入100 μL冰醋酸终止反应，减压旋蒸至干燥，加入2 mL甲醇旋蒸至干燥，重复3次。
5.5 乙酰化反应
还原后的样品加入2 mL吡啶和2 mL乙酸酐在95℃油浴2 h进行乙酰化反应，反应结束后减压旋蒸至干燥，再加入2 mL甲醇继续旋蒸至干燥，重复3次，加入三氯甲烷进行萃取PMAAs，取有机相上机检测，进行GC-MS分析。
5.6 质谱条件
采用电子轰击离子源（EI），电子能量 70 eV，分析物在全扫描（SCAN）模式下进行检测，质量扫描范围（m/z）: 30~600；QP-2010石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），体积流量 1 mL/min；升温程序为柱温箱的初始温度为140℃保持2.0 min，以3℃/min程序升温至230℃，保持3 min；进样量为1 μL。
6 苦笋多糖的核磁分析
取50 mg苦笋多糖（BSP-1，BSP-2，BSP-3）样品，用0.5 mL D2O溶解后冷冻干燥，重复三次。后用0.5 mL D2O溶解并转入核磁管中，在25℃下，经Bruker AVANCE III 850MHzNMR光谱仪，测定其1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、1H-1H NOSY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC光谱。
7 苦笋多糖的刚果红实验
根据Qiaoying Song方法，取苦笋多糖（BSP-1，BSP-2，BSP-3）样品配制成1 mg/mL的多糖样品溶液。取1 mg/mL多糖溶液1.0 mL，加入3.0 mL不同浓度（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L）的NaOH溶液，并加入0.5 mL超纯水和1.5 mL 80 μmol/L刚果红溶液，充分混匀，静置1 h后在400~600 nm处进行波谱扫描，记录不同浓度NaOH下反应体系的最大吸收波长，以超纯水替代多糖溶液作为空白对照组。
8 苦笋多糖的扫描电镜分析
取适量苦笋多糖（BSP-1，BSP-2，BSP-3）样品，粘附在扫描电子显微镜样品盘上，用粉尘球吹走多余的样品，并喷上金来观察样品的表面结构。
9 数据处理与分析
每组试验均重复3次，测定数据以平均值±标准差表示。采用SPSS 17.0 软件对试验数据进行分析，P<0.05、P<0.01分别表示差异显著、极显著，利用Origin2021软件进行图形绘制。
10结果与讨论
10.1 苦笋多糖的纯度鉴定
蛋白质及核酸λ260 nm和λ280 nm下具有明显吸收峰。从图8可以看出，苦笋多糖的三个组分BSP-1、BSP-2和BSP-3在 260 nm和 280 nm 处均无明显的吸收峰，初步表明纯化多糖BSP-1、BSP-2和BSP-3几乎不含蛋白质与核酸，纯度较高。
10.2 苦笋多糖的相对分子量测定
分子量是多糖类大分子物质的重要结构指标，直接影响其理化性质和生物活性，因此获取分子量大小并了解其分布对认识多糖结构以及生物活性研究具有重要意义。采用HPGPC法测定BSP-1、BSP-2和BSP-3的相对分子质量，结果如图9所示，BSP-1、BSP-2和BSP-3是单一的较为对称的峰，表明其分子量分布均匀。绘制了不同葡聚糖标准品的对数分子量与保留时间的关系，从而获得lgM-RT回归方程y=−0.6944x+114.846，R2=0.9950。BSP-1的保留时间为15.68min，其峰分子质量（Mp）为9.06 kDa，重平均分子质量（Mw）为12.36 kDa，数值平均分子质量（Mn）为 6.13 kDa，多分散性指数（Mw/Mn）为 2.01。BSP-2的保留时间为15.51 min，其峰分子质量（Mp）为11.87 kDa，重平均分子质量（Mw）为19.14 kDa，数值平均分子质量（Mn）为7.35 kDa，多分散性指数（Mw/Mn）为2.602。BSP-3的保留时间为15.67 min，其峰分子质量（Mp）为9.20 kDa，重平均分子质量（Mw）为20.96 kDa，数值平均分子质量（Mn）为7.94 kDa，多分散性指数（Mw/Mn）为2.64。说明BSP-1、BSP-2和BSP-3的平均分子质量分布较集中，结合Sephadex G-100 凝胶柱层析结果以及紫外光谱扫描结果表明苦笋多糖的三个组分（BSP-1，BSP-2，BSP-3）纯度较高。
10.3 苦笋多糖的单糖组成
单糖组成分析对多糖结构鉴定分析至关重要，且多糖的生物活性与其单糖组成紧密相关。采用PMP 柱前衍生化和HPLC检测分析苦笋多糖（BSP-1，BSP-2，BSP-3）的单糖组成，结果如图10所示，BSP-1主要由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖组成，摩尔比为0.26:0.09:0.06:0.14:33.63:3.32:2.24:4.51，BSP-2主要由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖组成，摩尔比为0.31:0.10:0.68:1.54:4.10:10.13:4.03:7.90，BSP-3主要由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖组成，摩尔比为0.48:0.21:2.00:2.32:1.12:1.79:9.62:2.53:3.55:0.72。BSP-1、BSP-2和BSP-3均为异质多糖，其中BSP-1的葡萄糖含量占比较高为75.99%，BSP-2和BSP-3的半乳糖含量占比较高，分别为35.20%和39.52%。
10.4 苦笋多糖的红外光谱分析
FT-IR图用于结构分析时，对分子中官能团有高度特征性，谱带的频率、强度与分子结构密切相关，广泛应用于多糖的结构表征。如图11为苦笋多糖（BSP-1，BSP-2，BSP-3）的红外光谱。BSP-1、BSP-2和BSP-3三种多糖的红外光谱图相似。3400 cm-1附近的强吸收峰归因于O-H拉伸振动，2900 cm-1附近的弱吸收归因于C-H的不对称拉伸振动。1640 cm-1左右的峰值属于C=O拉伸振动，表明多糖中存在糖醛酸，这与单糖组成分析结构一致，1400 cm-1附近的吸收峰被分配给CH-弯曲振动。1050 cm-1附近的连续吸收波长归因于吡喃环中C-O-C拉伸振动，表明BSP-1、BSP-2和BSP-3中均存在吡喃糖单元。BSP-1、BSP-2、BSP-3具有多糖的典型特征吸收峰，是含有吡喃糖单元的多糖物质。
10.5 苦笋多糖的甲基化分析
甲基化分析法为分析多糖糖苷键连接方式的常用方法。通过GC-MS检测甲基化反应生成的PMAAs，其质谱碎片通过与CCRC数据库比对，并结合BSP-1、BSP-2和BSP-3的单糖组成结果，得到BSP-1、BSP-2和BSP-3的甲基化结果。结果如表5、表6和表7所示，BSP-1的糖苷键组成包括T-Linked Araf、4-Linked Arap、3,5-Linked Araf、3-Linked Glcp、4-LinkedGlcp、6-Linked Glcp、3,4-Linked Glcp、4,6-Linked Galp、3,6-Linked Glcp、3,6-LinkedGalp、2,3,4-Linked Xylp，其中T-Linked Araf、3-Linked Glcp、4-Linked Glcp、6-LinkedGlcp四种糖苷键含量较高，共占61.36%，结果显示该组分的葡萄糖含量较高，与BSP-1的单糖组成结果一致；BSP-2的糖苷键组成包括T-LinkedAraf、2-Linked Arap、4-Linked Arap、4-Linked Xylp、T-Linked Glcp、3,5-Linked Araf、3-Linked Galp、3,6-Linked Galp、2,3,4- Linked Xylp以及少量的T-Linked Galp、4-Linked GlcpA、6-Linked Glcp、3,4,6-Linked Galp，其中T-Linked Araf、3,5-Linked Araf以及3,6-Linked Galp三种糖苷键占比较高，分别为25.56%、15.47%、16.14%，该组分中含较多的阿拉伯糖和半乳糖，与BSP-2的单糖组成结果一致；BSP-3的糖苷键组成包括T-Linked Araf、2-Linked Arap、4-LinkedArap、4-Linked Xylp、3-Linked Fucp、T-Linked Galp、T-Linked Glcp、3,5-Linked Araf、6-Linked Galp、3-Linked Galp、3,6-Linked Galp、2,3,4- Linked Xylp，其中T-LinkedAraf、3,5-Linked Araf、3-Linked Galp、3,6-Linked Galp、2,3,4- Linked Xylp五种糖苷键含量较高，共占67.85%。PMAAs中未检测到糖醛酸的存在，可能是因为BSP-1、BSP-2和BSP-3甲基化过程中发生酰化反应后发生了β-消除导致。BSP-1、BSP-2和BSP-3的糖苷键类型与单糖组成直接相关，糖苷键类型差异较大，证明了BSP-1、BSP-2和BSP-3的结构特征差异，可为后续阐明其生物活性的构效关系提供理论依据。
表5 BSP-1甲基化分析结果
表6 BSP-2甲基化分析结果
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表7 BSP-2甲基化分析结果
10.6 苦笋多糖的核磁分析
通过核磁共振波谱研究，可深入了解了多糖纯化组分的结构。核磁共振波谱提供了多糖的详细结构信息，包括α-或β-异构构型、连接位点和连接顺序。一般来说，质子和碳信号分别来自δ3.0-5.50 ppm和δ60-110 ppm的区域，是典型的多糖化学位移。糖环中 C2到C6的质子信号化学位移在δ3.0-4.3 ppm范围内，由于该范围内的信号峰杂多，存在交叉叠加，难以准确归属。糖环中 C2到C6的碳信号化学位移在δ60.0-85.0 ppm，其中δ82-84 ppm之间为呋喃糖环的信号，而δ60-80 ppm为喃糖环C2-C6的信号， C2，C3和C4被取代的信号为δ75-80ppm，C6未取代和被取代的信号分别为δ57-65 ppm和δ65-70ppm。异头氢和异头碳信号较为易于归属，其中异头氢信号位于δ4.30-5.50 ppm，异头碳信号位于δ90-110 ppm，β构型的异头氢和异头碳通常位于δ4.3-4.8ppm和δ103-110 ppm，α构型的异头氢和异头碳δ4.9-5.4 ppm和δ90~102 ppm。
BSP-1的1H-NMR谱和13C-NMR谱如图12所示，可以看出，BSP-1具有典型的多糖结构，BSP-1的异头氢信号峰的化学位移分别为δ5.35 ppm、δ5.33 ppm、δ5.19ppm、δ5.18 ppm、δ5.04 ppm、δ4.93 ppm、δ4.73ppm、δ4.60 ppm、δ4.59 ppm、δ4.48 ppm，BSP-1的异头碳信号峰化学位移分别为δ109.24ppm、δ107.53ppm、δ107.44ppm、δ104.37ppm、δ102.57ppm、δ102.35ppm、δ99.57ppm、δ97.69ppm、δ95.91ppm、δ92.10ppm，BSP-1的异头氢区信号和异头碳区信号表明BSP-1同时存在α和β构型，是具有多个残基结构的高度支链多糖。此外，大部分非异头碳信号集中在δ60.0-85.0 ppm，表明BSP-2同时存在呋喃糖和吡喃糖。
BSP-2的1H-NMR谱和13C-NMR谱如图13所示，可以看出，BSP-2具有典型的多糖结构，BSP-2的异头氢信号峰的化学位移分别为δ5.32 ppm、δ5.17ppm、δ5.02ppm、δ4.96 ppm、δ4.89 ppm、δ4.60 ppm、δ4.41ppm、δ4.38 ppm，其中在BSP-2的异头碳信号峰化学位移分别为δ109.26 ppm、δ107.62 ppm、δ107.46 ppm、δ102.61ppm、δ101.60 ppm、δ101.24ppm、δ96.41ppm、δ95.68 ppm， BSP-2的异头氢区信号和异头碳区信号表明BSP-2同时存在α和β构型，是具有多个残基结构的高度支链多糖。此外，大部分非异头碳信号集中在δ60.0-85.0 ppm，表明BSP-2同时存在呋喃糖和吡喃糖，δ1.0 ppm为甲基五（六）碳糖的质子信号与δ16.0ppm附近的碳信号，结合单糖组成分析，表明BSP-2存在a-L-Rhap。
BSP-3的1H-NMR谱和13C-NMR谱如图14所示，可以看出，BSP-3具有典型的多糖结构，BSP-3的异头氢信号峰的化学位移分别为δ5.30 ppm、δ5.24 ppm、δ5.18ppm、δ5.15 ppm、δ5.02 ppm、δ4.50 ppm、δ4.44ppm、δ4.36 ppm，其中在BSP-3的异头碳信号峰化学位移分别为δ109.23 ppm、δ107.08 ppm、δ103.37 ppm、δ100.89ppm、δ98.99 ppm、δ96.72 ppm、δ95.58ppm、δ92.50ppm， BSP-3的异头氢区信号和异头碳区信号表明BSP-3同时存在α和β构型，是具有多个残基结构的高度支链多糖。大部分非异头碳信号集中在δ60.0-85.0 ppm，表明BSP-3同时存在呋喃糖和吡喃糖。此外，根据单糖组成，δ1.0 ppm为甲基五（六）碳糖的质子信号结合δ16.0 ppm附近的碳信号，表明BSP-3存在a-L-Rhap。δ1.89 ppm附近的信号为典型的乙酰基的质子信号，δ175.13 ppm附近的信号为糖醛酸C-6的羧基信号峰，表明BSP-3存在糖醛酸单元结构，这与单糖组成和红外光谱分析结果一致。
10.7 苦笋多糖的刚果红实验
三螺旋多糖具有许多生物活性，具有三螺旋结构的多糖可与刚果红形成复合物，与刚果红相比其最大吸收波长会发生红移。如图15所示，为苦笋多糖（BSP-1，BSP-2，BSP-3）的刚果红试验结果。随着NaOH溶液浓度（0-0.5 mol/L）的增加，刚果红-BSP-1、刚果红-BSP-2和刚果红-BSP-3配合物与刚果红相比均没有呈现明显红移。这表明BSP-1、BSP-2和BSP-3中不存在三螺旋结构。
10.8 苦笋多糖的扫描电镜分析
用SEM观察BSP-1、BSP-2和BSP-3的微观形貌。三种苦笋多糖在400×、10000×和50000×放大倍率下微观结构如图16所示。当放大到400倍时，从图 A1可以看出，苦笋多糖组分BSP-1主要是由不规则块状组成，当放大到 10000 和50000倍时，如图A2与A3所示，可以看出BSP-1结构紧密，表面粗糙，具有部分凸起结构，以及不规则纹路，可能是由于多糖具有较多分支结构引起的。苦笋多糖组分BSP-2当放大到400倍时，从图B1可以看出，其整体呈片状，表面有圆形孔状结构，有较多碎片分支，当放大到 10000 和50000倍时，如图 B2与B3所示，可以看出BSP-2表面光滑，有圆形空腔，以及一些裂缝，这可能是由于多糖分子中的排斥力引起的。苦笋多糖组分BSP-3当放大到400倍时，从图 C1可以看出，BSP-3为不规则块状并带有粗糙碎片组成，当放大到10000 和50000倍时，如图C2与C3所示，可以看到BSP-3表面粗糙，有不规则纹路，结构松散类似海绵状。BSP-1、BSP-2和BSP-3表面形貌的差异可能是由于两种多糖组分中单糖组分和支化程度不同所致。
多糖的结构表征研究中，纯度是质量控制的重要环节，多糖纯品一般指的在相对分子质量范围的均一组分，不能用常见小分子化合物的纯度标准来衡量。多糖中如存在蛋白质、核酸等杂质，在紫外光谱扫描图谱280nm，260 nm处出现明显的吸收峰。本研究采用紫外可见吸收光谱法鉴定可知，BSP-1、BSP-2和BSP-3在 260 nm和 280 nm 处均无明显吸收峰，表明三种多糖组分几乎不含蛋白质与核酸，纯度较高。
多糖分子量是决定其化学性质的关键参数，同时与生物活性密切相关，分子量过高会影响多糖在体内的吸收以及运输，分子量过低会导致多糖不能形成有效的结构单元。研究表明，多糖的分子量在3 kDa～300 kDa范围内生物活性通常较高。本研究采用HPGPC测定BSP-1、BSP-2和BSP-3的重量平均分子量Mw分别为12.36 kDa，19.14 kDa，20.96 kDa。
多糖作为大分子化合物，结构复杂，包括一级结构与高级结构，一级结构主要阐明单糖组成、单糖残基类型以及单糖残基的连接方式等信息。分析单糖组成方法多样，但首要条件是均需水解多糖成单糖，再进行适当的衍生化处理后进行检测。本发明采用TFA水解BSP-1、BSP-2和BSP-3，水解后的单糖进行衍生化后，使用便捷的HPLC进行检测。结果表明BSP-1由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖组成，摩尔比为0.26:0.09:0.06:0.14:33.63:3.32:2.24:4.51，BSP-2由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖组成，摩尔比为0.31:0.10:0.68:1.54:4.10:10.13:4.03:7.90，BSP-3由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖组成，摩尔比为0.48:0.21:2.00:2.32:1.12:1.79:9.62:2.53:3.55:0.72。BSP-1、BSP-2和BSP-3均为异质多糖，其中BSP-1的葡萄糖含量占比较高为75.99%，BSP-2和BSP-3的半乳糖含量占比较高，分别为35.20%和39.52%。
甲基化分析法为分析多糖糖苷键连接方式的常用方法；本次采用GC-MS分析BSP-1、BSP-2和BSP-3的甲基化产物，结果表明BSP-1主要含T-Linked Araf、3-Linked Glcp、4-Linked Glcp、6-Linked Glcp四种糖苷键，占比61.36%;BSP-2主要含T-Linked Araf、3,5-Linked Araf、3,6-Linked Galp三种糖苷键，分别为25.56%、15.47%、16.14%，BSP-3主要含T-Linked Araf、3,5-Linked Araf、3-Linked Galp、3,6-Linked Galp、2,3,4- LinkedXylp五种糖苷键，共占67.85%。确定了三种多糖组分的糖苷键类型及糖苷键相对含量，可为后续阐明其生物活性的构效关系提供一定的理论依据。
甲基化分析结果可确定多糖中单糖残基的类型等类型，但各糖残基间的连接顺序仍无法确定。本研究通过1H-NMR、13C-NMR深入了解BSP-1、BSP-2和BSP-3的结构，结果表明，BSP-1、BSP-2和BSP-3同时存在α和β构型，且同时存在呋喃糖和吡喃糖；此外，BSP-2还存在a-L-Rhap，BSP-3存在a-L-Rhap以及糖醛酸结构，这与BSP-1、BSP-2和BSP-3的单糖组成分析、红外光谱分析、甲基化分析结果一致。但因组成单糖残基种类多，结构复杂，且有的单糖含量较低，检测其信号困难，未能确定其重复单元结构。
多糖的高级分析中，具有三股螺旋结构的多糖可与刚果红形成络合物，络合物的最大吸收波长跟刚果红相比会发生红移，可通过刚果红试验检测多糖的是否具有三股螺旋结构；扫描电子显微镜可观察大分子微观形貌，是进行高级结构分析的重要仪器，多糖的外貌形态通常采用扫描电子显微镜观察。本次对分离得到的BSP-1、BSP-2和BSP-3进行刚果红实验，结果显示三种多糖组分中均不存在三螺旋结构。采用扫描电镜进行观察，结果显示，BSP-1结构紧密，表面粗糙，具有部分凸起结构，以及不规则纹路；BSP-2表面光滑，有圆形空腔，以及一些裂缝；BSP-3表面粗糙，有不规则纹路，结构松散类似海绵状。可见，BSP-1、BSP-2和BSP-3的微观结构存在一定的差异，这可能是由于两种多糖组分中单糖组分和支化程度不同所致。
以下通过药效学试验证明本发明的有益效果。
试验例1 苦笋多糖的免疫活性研究
1 巨噬细胞RAW264.7细胞培养
将巨噬细胞RAW264.7细胞冻存管取出后，迅速在37℃水浴锅中解冻，细胞融化后尽快把细胞转入含有6 mL DMEM完全培养基（含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素（10000 U/mL））的无菌离心管中，轻柔地吹打混匀后离心（1000 rpm×3 min）。弃去上清液，加入适量的DMEM完全培养基重悬细胞，然后将细胞转移至细胞培养皿中，在37℃、5%（体积分数，下同）二氧化碳培养箱培养24 h后，弃去DMEM完全培养基，加2 mL PBS洗去未贴壁细胞后弃去PBS，加入4 mL完全培养基后轻柔地将贴壁细胞吹打下来，移至细胞培养皿中，在37℃、5%二氧化碳培养箱培养至细胞处于对数生长期进行下一步实验。
2 苦笋多糖对巨噬细胞RAW264.7的增殖作用
通过CCK-8测定苦笋多糖对巨噬细胞RAW264.7的细胞增殖率的影响。取对数生长期的细胞，将巨噬细胞RAW264.7以5×104的密度接种在96孔板上，二氧化碳培养箱孵育24h，然后用100 μL的苦笋多糖（0，50，100，200，400，600，800和1000 μg/mL）或LPS（5 μg/mL）处理。培养24 h后，加入10 μL CCK-8溶液，继续孵育2 h，应用酶标仪在λ450 nm处记录的每孔吸光度值。
3 苦笋多糖对巨噬细胞RAW264.7吞噬能力的影响
通过中性红摄取测定苦笋多糖对巨噬细胞RAW264.7细胞吞噬活性的影响。取对数生长期的细胞，将巨噬细胞RAW264.7以1×105（细胞/mL）接种在96孔板上，二氧化碳培养箱孵育24 h，然后用100 μL苦笋多糖（0，50，100，200，400，600，800和1000 μg/mL）或LPS（5μg/mL）处理，培养24 h后，将20 μL中性红加入孔中，继续在37℃、5%二氧化碳培养箱中孵育2h，除去上清液，并用PBS洗涤三次以除去沉淀的中性红染色液，加入200 μL细胞裂解物（乙醇和乙酸以1:1的比例混合），轻轻地振摇10mim，应用酶标仪在λ540nm处记录每孔吸光度值。
4 苦笋多糖对巨噬细胞RAW264.7产生ROS水平的影响
采用ROS试剂盒检测苦笋多糖对巨噬细胞RAW264.7释放ROS的影响。取对数生长期的细胞，将巨噬细胞RAW264.7以1×105（细胞/mL）接种在96孔板上，孵育24 h，然后用100 μL苦笋多糖（0，50，100，200，400，600，800和1000 μg/mL）或LPS（5μg/mL）处理，培养24 h后，吸取上清液，按试剂盒操作说明检测荧光强度。
5 苦笋多糖对巨噬细胞RAW264.7分泌NO的影响
采用NO试剂盒检测苦笋多糖对巨噬细胞RAW264.7 NO产生的影响。取对数生长期的细胞，将巨噬细胞RAW264.7以1×105（细胞/mL）接种在96孔板上，孵育24 h，然后用100 μL苦笋多糖（0，50，100，200，400，600，800和1000 μg/mL）或LPS（5μg/mL）处理，培养24 h后，收集细胞培养上清液。采用Griess试剂盒操作方法检测NO含量。
6 苦笋多糖对巨噬细胞RAW264.7分泌细胞因子的影响
采用ELISA试剂盒检测苦笋多糖对巨噬细胞RAW264.7 中IL-1β 、 IL-6和TNF-α产生的影响。取对数生长期的细胞，将巨噬细胞RAW264.7以1×105（细胞/mL）接种在96孔板上，孵育24 h，然后用100 μL苦笋多糖（0，50，100，200，400，600，800和1000 μg/mL）或LPS（5μg/mL）处理，培养24 h后，收集细胞培养上清液。采用ELISA试剂盒测定IL-1β 、 IL-6和TNF-α的含量。
7 数据处理与分析
每组试验均重复3次，测定数据以平均值±标准差表示。采用SPSS 17.0 软件对试验数据进行分析，P<0.05、P<0.01分别表示差异显著、极显著，所得结果进一步用 Excel2016 作图。
8 结果与讨论
8.1 苦笋多糖对巨噬细胞RAW264.7的增殖作用
采用CCK-8试剂盒测定3种苦笋多糖（BSP-1、BSP-2、BSP-3）干预后巨噬细胞RAW264.7的增殖率以分析苦笋多糖的毒性作用。结果如图17所示，与空白对照组实验相比，3种苦笋多糖组分在实验质量浓度范围内（50，100，200，400和600 μg/mL）且在实验质量浓度范围内巨噬细胞RAW264.7的增殖能力有所提高，表明3种苦笋多糖组分对巨噬细胞RAW264.7均无毒性作用。其中BSP-1随着浓度的增加，其增殖能力均显著增强（P＜0.05），当浓度为200 μg/mL时细胞存活率最高，继续增加BSP-1浓度，细胞存活率降低，但未表现出细胞毒性；BSP-2随着浓度的增加，其增殖能力均显著增强（P＜0.05），当浓度为400 μg/mL时细胞存活率最高，继续增加BSP-2浓度，细胞存活率降低；BSP-3在浓度（50 μg/mL）时，其增殖能力有所增强，当浓度大于100 μg/mL时，其增殖能力显著增强（P＜0.05）。多糖对巨噬细胞RAW264.7增值能力的影响在一定程度上可以反映其免疫功能，BSP-1、BSP-2和BSP-3具有较好增殖能力，表明BSP-1、BSP-2和BSP-3可通过增强巨噬细胞的增殖来提高免疫力。
8.2 苦笋多糖对巨噬细胞RAW264.7吞噬能力的影响
吞噬作用是巨噬细胞的一种独特功能，是免疫反应的第一步，可激活对外源性物质的适应性免疫反应，巨噬细胞的吞噬功能是免疫评价中的一个重要指标。用中性红摄取法检测3种苦笋多糖（BSP-1、BSP-2、BSP-3）对巨噬细胞RAW264.7吞噬能力的影响，结果如图18所示，3种苦笋多糖组分在实验质量浓度范围内（50，200和600 μg/mL）作用于巨噬细胞RAW264.7时，吞噬活性均呈现增强趋势，且随着浓度的增加而增强，与空白对照组实验相比，3种苦笋多糖的吞噬活性均增强（P＜0.05），表明BSP-1、BSP-2和BSP-3可通过提高巨噬细胞的吞噬能力增强免疫能力。
8.3 苦笋多糖对巨噬细胞RAW264.7 ROS水平的影响
ROS作为机体内活跃的信号分子，广泛参与机体免疫应答过程中的各个环节，是参与炎症细胞因子合成和分泌的关键介质。ROS通常被认为是NF-κB介导的免疫反应的关键介质，并经常被用于评估免疫活性。为确定3种苦笋多糖（BSP-1、BSP-2、BSP-3）对巨噬细胞RAW264.7细胞ROS水平的影响，通过荧光探针DCFH-DA处理后检测ROS水平。结果如图19所示，与空白对照组实验相比，3种苦笋多糖组分处理后，巨噬细胞RAW264.7内ROS的相对水平均显著增加（P＜0.05），且随着3种苦笋多糖的浓度（50，200和600 μg/mL）增加而增加。结果表明，在一定浓度范围内，3种苦笋多糖组分均能刺激巨噬细胞RAW264.7中ROS的产生，从而激活巨噬细胞RAW264.7，说明3种苦笋多糖均具有较强的免疫调节活性。
8.4 苦笋多糖对巨噬细胞RAW264.7分泌NO的影响
NO是由活化的巨噬细胞分泌的一种具有生物活性的信使细胞因子，NO的分泌和释放作用增强了巨噬细胞的吞噬作用和代谢作用，在机体免疫应答中发挥着重要作用，参与调节细胞凋亡和宿主对病原微生物的防御。因此，活化的巨噬细胞NO的分泌和释放，通常被用于评估化合物的免疫调节活性。为了评估3种苦笋多糖（BSP-1、BSP-2、BSP-3）的免疫调节活性，采用不同浓度（50， 200和600 μg/mL）的3种苦笋多糖刺激巨噬细胞RAW264.7，以LPS（5 μg/mL）为阳性对照组，检测上清液中NO的含量。结果如图20所示，与空白对照组实验相比，3种苦笋多糖组分均能显著刺激巨噬细胞RAW264.7分泌NO（P＜0.05）。BSP-1、BSP-2和BSP-3在50~200 μg/mL范围内以剂量依赖性方式诱导NO的产生，当浓度为200 μg/mL和600μg/mL时，其NO生成量与LPS组NO水平相当，表明3种苦笋多糖均具有较强的免疫刺激作用。
8.5 苦笋多糖对巨噬细胞RAW264.7分泌细胞因子的影响
当生物体被病原体入侵时，活化的巨噬细胞不仅吞噬病原体，还分泌细胞信使，包括调节免疫反应的细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α，它们在机体免疫调节中发挥重要作用。多糖作为潜在的免疫调节剂，可以诱导巨噬细胞RAW264.7分泌IL-1β、IL-6和TNF-α等细胞因子。为了检测3种苦笋多糖（BSP-1、BSP-2、BSP-3）的免疫调节活性，采用不同浓度（50， 200和600 μg/mL）的3种苦笋多糖刺激巨噬细胞RRAW264.7，以LPS（5 μg/mL）为阳性对照组，采用ELISA试剂盒检测IL-1β、IL-6和TNF-α等细胞因子的释放情况。结果如图21所示，与对照组相比，3种苦笋多糖在浓度范围（50， 200和600 μg/mL）内对巨噬细胞RAW264.7细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的释放均有显著影响，且BSP-1、BSP-2和BSP-3在浓度范围内其细胞因子生成量与LPS组细胞因子水平相当，表明3种苦笋多糖通过显著产生IL-1β、IL-6和TNF-α来激活巨噬细胞RAW264.7。
9小结
通过CCK-8检测细胞的增值能力以及中性红摄取实验检测细胞吞噬能力，结果表明从苦笋中获得的多糖组分BSP-1、BSP-2和BSP-3均可显著促进巨噬细胞RAW264.7的增殖，提示BSP-1、BSP-2和BSP-3可通过增强巨噬细胞的增殖来提高免疫力，以及BSP-1、BSP-2和BSP-3在实验质量浓度范围内（50， 200和600 μg/mL）均可显著增强巨噬细胞RAW264.7的吞噬活性，且呈剂量依赖性增强，说明BSP-1、BSP-2和BSP-3具有提高先天性免疫反应的能力。
本研究表明，苦笋多糖BSP-1、BSP-2和BSP-3处理的巨噬细胞RAW264.7后，均可显著促进细胞内ROS的相对水平P＜0.05，同时刺激其分泌NO及细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）来激活巨噬细胞RAW264.7，结果表明BSP-1、BSP-2和BSP-3具有良好的免疫调节活性。
Claims (7)
1.苦笋多糖，其特征在于：它是由原料苦笋提取苦笋粗多糖，再经分离纯化得苦笋多糖BSP-1、BSP-2、BSP-3，其中：
BSP-1、BSP-2和BSP-3的总糖分别为：97.12±4.43%，94.50±3.89%，87.65±1.77%；
BSP-1、BSP-2和BSP-3的糖醛酸含量分别为：4.81±0.11%，10.65±0.29%，33.85±0.11%；
BSP-1、BSP-2和BSP-3的重量平均分子量分别为12.36±0.45kDa，19.14±0.32kDa，20.96±0.58kDa；
BSP-1和BSP-2是由八种单糖组成，其中BSP-1的葡萄糖含量为75.99±0.07%；BSP-2的半乳糖和阿拉伯糖分别为35.20±0.08%和27.43±0.05%；BSP-3是由十种单糖组成，其中半乳糖含量为39.53±0.10%；
所述的
BSP-1含T-Linked Araf、3-Linked Glcp、4-Linked Glcp、6-Linked Glcp四种糖苷键；
BSP-2含T-Linked Araf、3,5-Linked Araf、3,6-Linked Galp三种糖苷键；
BSP-3含T-Linked Araf、3,5-Linked Araf、3-Linked Galp、3,6-Linked Galp、2,3,4-Linked Xylp五种糖苷键；
BSP-1、BSP-2和BSP-3同时存在α和β构型，且同时存在呋喃糖和吡喃糖；
BSP-2含有a-L-Rhap，BSP-3含有a-L-Rhap以及糖醛酸结构；
所述的BSP-1由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖组成，摩尔比为0.26:0.09:0.06:0.14:33.63:3.32:2.24:4.51；
BSP-2由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖组成，摩尔比为0.31:0.10:0.68:1.54:4.10:10.13:4.03:7.90；
BSP-3由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖组成，摩尔比为0.48:0.21:2.00:2.32:1.12:1.79:9.62:2.53:3.55:0.72。
2. 根据权利要求1所述的苦笋多糖，其特征在于：所述的BSP-1、BSP-2和BSP-3的总糖分别为：97.12%， 94.50%， 87.65%；
BSP-1、BSP-2和BSP-3的糖醛酸含量分别为：4.81%，10.65%，33.85%；
BSP-1、BSP-2和BSP-3的重量平均分子量分别为12.36 kDa，19.14 kDa，20.96 kDa；
BSP-1和BSP-2是由八种单糖组成，其中BSP-1的葡萄糖含量为75.99%；BSP-2的半乳糖和阿拉伯糖分别为35.20%和27.43%；BSP-3是由十种单糖组成，其中半乳糖含量为39.53%。
3.权利要求1或2所述的苦笋多糖的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
a、取苦笋粉末，95%乙醇浸泡，残渣于55℃烘箱烘干；
b、加水，于55-90℃下浸提60-180min，苦笋与水的料液比为：1:10-50 g/mL，过滤，滤液浓缩，加入95%乙醇沉淀，过液，离心得多糖沉淀，冷冻干燥，即得苦笋粗多糖；
c、脱蛋白、脱色素：
d、分离、纯化：采用DEAE-52纤维素柱层析对多糖进行分离，再用Sephadex G-100 凝胶柱进行纯化，即得多糖。
4.根据权利要求3所述的苦笋多糖的制备方法，其特征在于：步骤b的提取条件为：88℃下浸提150 min，苦笋与水的料液比为：1:41 g/mL；
步骤c所述的脱蛋白方法为：采用seveg法除蛋白，加入氯仿-正丁醇（4:1），振摇，离心，重复上述操作，直至无明显蛋白层，将残留有机溶剂去除后，冷冻干燥得到脱蛋白的苦笋粗多糖；
步骤c所述的脱色素方法为：将苦笋粗多糖配制成10 mg/mL的溶液，氨水调节pH值为8~9，加入30% H2O2，加量每100 mL溶液中不超过 30 mL H2O2，温度40℃，时间4 h，将脱色后的多糖溶液进行透析、浓缩、冷冻干燥得到脱色的苦笋粗多糖；
步骤d所述的分离方法为：取DEAE-52纤维素加水浸泡，抽干，0.5 mol/L盐酸浸泡，去离子水洗至中性，抽干，0.5mol/L氢氧化钠浸泡，去离子水洗净至中性，抽干，去离子水浸泡，装柱；用纯水冲洗2个柱体积，然后用2.0 mol/L的NaCl溶液冲洗2个柱体积，再用纯水冲洗2个柱体积；取除蛋白和色素后的多糖样品上样，采用纯水和0.1 mol/L、0.3 mol/L、0.5mol/L、1.0 mol/L的NaCl溶液洗脱，分别收集洗脱液，绘制洗脱曲线，合并，透析，冷冻干燥；
步骤d所述的纯化方法为：取Sephadex G-100加入超纯水浸泡，充分溶胀，除去漂浮物，抽干，用0.1mol/L NaOH浸泡，抽滤，超纯水洗至中性，装柱；用纯水冲洗2个柱体积，然后用0.1 mol/L的NaCl溶液冲洗2个柱体积，再用纯水冲洗2个柱体积；取经DEAE-52 纤维素柱分离后的苦笋多糖上样，采用纯水进行洗脱，收集洗脱液，绘制洗脱曲线，合并，冻干后得纯化多糖组分。
5.权利要求1或2所述的苦笋多糖在制备具有免疫调节作用的药物中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述的药物是促进细胞增殖的药物。
7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述的药物是提高巨噬细胞的吞噬能力的药物。
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