CN112851829B

CN112851829B - 一种具有降血脂作用的枸杞多糖

Info

Publication number: CN112851829B
Application number: CN202110057829.5A
Authority: CN
Inventors: 邸多隆; 刘建飞
Original assignee: Lanzhou Institute of Chemical Physics LICP of CAS
Current assignee: Lanzhou Institute of Chemical Physics LICP of CAS
Priority date: 2021-01-15
Filing date: 2021-01-15
Publication date: 2021-09-24
Anticipated expiration: 2041-01-15
Also published as: CN112851829A

Abstract

本发明提供一种具有良好降血脂作用的枸杞均一性多糖，是将枸杞的水提液分别依次经过分子量为30、10、5kDa的膜进行分离，最后将透过10kDa的膜组件，并被5kDa的膜组件截留的枸杞水提液组分冷冻干燥后，溶于蒸馏水中，脱除蛋白后，脱除色素，再进行透析；将纯化后的产物进行柱层析，使用氯化钠溶液洗脱，收集组分，1000Da的透析袋进行透析，透析产物冷冻干燥后再次溶于蒸馏水中，用葡聚糖凝胶进一步分离，收集组分后冷冻干燥，即可完成制备。所提供的枸杞多糖具有降血脂功效，能够用于制备功能食品、保健食品、特殊医学用途食品或新药。

Description

一种具有降血脂作用的枸杞多糖

技术领域

本发明属于药学化学技术领域，具体涉及一种具有降血脂作用的枸杞多糖。

背景技术

高脂血症是指血浆中一种或多种脂质异常升高，主要是由于血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)或低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)水平升高，以及脂质代谢或运输异常。随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变，高脂血症患者的数量正在迅速增加，年龄分布正在提前。中青年高脂血症患者人数明显增加。高脂血症的发生是一个漫长的过程，对人体的直接负面影响很小，但可引起各种并发症，包括动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、脑梗死、心脑血管梗死和视力受损，严重危害人们的健康乃至生命。目前临床上应用最广泛、最有效的降血脂药物包括他汀类药物、纤维蛋白类药物和烟酸。由于高脂血症的治疗需要长期用药，其副作用如肝损伤等不容忽视。因此，科学研究的主要方向之一是开发更安全和更有效的药物治疗高脂血症，且无毒副作用。此外，增加植物性功能食品的消费为治疗慢性代谢性疾病，包括高脂血症提供了一个有趣的方法。

枸杞子由于其良好的营养和医疗价值而日益受到欢迎。枸杞子具有多种生物活性，如抗氧化、抗衰老、抗癌、抗病毒、降血糖、降血脂和免疫增强作用。现代药理学和天然药物化学研究表明，多糖是枸杞的主要活性成分之一。已有文献报告枸杞粗多糖具有降血脂作用。但是，枸杞多糖的分子量分布很宽，具有降血脂多糖的物质基础和结构仍不清楚。

发明内容

本发明提供一种具有良好降血脂作用的枸杞均一性多糖，该枸杞多糖具有降血脂功效，能够用于制备功能食品、保健食品、特殊医学用途食品或新药。

本发明所提供的枸杞多糖LBP009-2-1，其结构式如下所示：

本发明所提供的枸杞多糖LBP009-2-1，采用多角度激光光散射仪与尺寸排阻色谱法联用(SEC-MALLs)测定的分子量为1.35×10⁴g/mol。

枸杞多糖LBP009-2-1中阿拉伯糖和半乳糖的摩尔比为1.27:1，还含有半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸。

本发明所提供的枸杞多糖LBP009-2-1的制备方法，包括如下的步骤：

将枸杞的水提液分别依次经过分子量为30、10、5kDa的膜进行分离，最后将透过10kDa的膜组件，并被5kDa的膜组件截留的枸杞水提液组分冷冻干燥后，溶于蒸馏水中，脱除蛋白后，脱除色素，再进行透析；将纯化后的产物进行柱层析，使用氯化钠溶液洗脱，收集组分，1000Da的透析袋进行透析，透析产物冷冻干燥后再次溶于蒸馏水中，用葡聚糖凝胶进一步分离，收集组分后冷冻干燥，即可完成制备。

所述的脱除蛋白，是使用氯仿和正丁醇混合溶液脱除蛋白；

所述的脱除色素，是使用30％的过氧化氢脱除色素；

所述的透析，是使用分子量为1000Da的透析袋进行透析；

所述的柱层析，是使用DEAE-52层析柱和Sephadex G-50层析柱。

所述的氯化钠溶液，其浓度为0.2Mol。

本发明所提供的枸杞多糖LBP009-2-1用于制备降血脂的制品；

所述的制品，为功能食品、保健食品、特殊医学用途食品或新药。

附图说明

图1：枸杞中分离纯化均一多糖LBP009-2-1的流程图。

图2：(A)在DEAE-52纤维素柱上分离纯化LBP009-1和LBP009-2；(B)在Sephadex-G50柱上分离纯化LBP009-2-1；(C)LBP009-2-1的色谱图；(D)单糖标准品的离子色谱图(1:Fuc；2:Rha；3:Ara；4:Gal；5:Glc；6:Xyl；7:Man；8:Fru；9:Rib；10:Galua；11:Glcua；12:Manua)；(e)LBP009-2-1的离子色谱图。

图3：(A)LBP009-2-1的SEC-MALLs分析图谱；(B)LBP009-2-1的红外光谱图；(C)LBP009-2-1的XRD谱图；(D)LBP009-2-1的热重分析谱图。

图4：LBP009-2-1的原子力显微镜图；

图5：LBP009-2-1的核磁图谱；

图6：LBP009-2-1的二维核磁谱图。

具体实施方式

本发明采用基于高效液相色谱法测定胆酸盐结合试验，发现了一种具有良好降血脂作用的新型的、结构均一的枸杞多糖。

以下对本发明技术方案的具体实施方式详细描述，但本发明并不限于以下描述内容：

实施例1：制备具有降血脂作用的枸杞均一多糖LBP009-2-1

1、枸杞均一多糖LBP009-2-1的制备方法

1.1仪器、试剂与材料

DEAE-52纤维素、Sephadex G-50、标准单糖(阿拉伯糖、核糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、鼠李糖、半乳糖酸、葡萄糖醛酸和甘露糖酸)。所有其他化学物质都至少达到分析级别。高效液相色谱的溶剂为色谱纯度。

1.2枸杞粗多糖的制备

图1是从枸杞中分离纯化获得枸杞均一性多糖LBP009-2-1的流程图。

100g枸杞加入1L的蒸馏水，用高速剪切分散乳化机辅助提取，转速为15000转/分钟，提取温度60℃，提取30分钟。8000转/分钟离心15min，除去残渣。收集含有粗多糖的上清液。然后用分子量为30、10、5、2kDa的膜分离设备截留分离，膜分离过程为:将上述离心后得到的枸杞粗多糖上清液通过蠕动泵泵入截留分子量为30kDa的膜组件，流速为150mL·min-1，膜面积100×100mm。经分离后分为截流液和透过液两部分，最终截留体积35mL时分离完毕，得到截留液LBP007，和透过液LBP007a。将透过液LBP007a通过蠕动泵泵入截留分子量为10kDa的膜组件，流速为150mL·min-1，膜面积100×100mm。经分离后分为截流液和透过液两部分，最终截留体积35mL时分离完毕，得到截留液LBP008和透过液LBP008a：将透过液LBP008a通过蠕动泵泵入截留分子量为5kDa的膜组件，流速为150mL·min-1，膜面积100×100mm。经分离后分为截流液和透过液两部分，最终截留体积35mL时分离完毕，得到截留液LBP009和透过液LBP009a；将透过液LBP009a通过蠕动泵泵入截留分子量为2kDa的膜组件，流速为150mL·min-1，膜面积100×100mm。经分离后分为截流液和透过液两部分，最终截留体积35mL时分离完毕，得到截留液LBP010和透过液LBP010a。将LBP007、LBP008、LBP009、LBP010放入真空冷冻干燥机中，冷肼温度-60℃，样品温度-55℃，真空度10Pa。

将5克LBP009溶于100mL蒸馏水中，用氯仿:正丁醇5:1脱除蛋白，重复5次直至蛋白除去完全。然后加入20mL30％的过氧化氢对其进行搅拌脱色，搅拌转速为120转/分钟，温度为60℃。再用分子量1000Da的透析袋透析3天。冷冻干燥得纯化多糖。

将1000mg纯化后的上述枸杞多糖溶于20mL蒸馏水，用蠕动泵泵入事先处理好的DEAE-52层析柱，分别用蒸馏水和0.2，0.4，0.6和0.8摩尔氯化钠溶液分步洗脱，流速为2ml/min，每管收集8mL。采用苯酚-硫酸法对洗脱部分进行了监测。然后将0.2摩尔的氯化钠洗脱得到的组分收集，用1000Da透析袋透析2天，冷冻干燥得到LBP009-2组分。将500mg上述LBP009-2组分用10mL蒸馏水溶解，用蠕动泵泵入Sephadex G-50层析柱，用水洗脱。流速为2ml/min，每管收集8mL。采用苯酚-硫酸法对洗脱部分进行了监测。收集34管～48罐。用旋转蒸发仪浓缩至10mL，冷冻干燥得LBP009-2-1。

2、枸杞均一多糖LBP009-2-1结构解析

2.1分子量测定

采用多角度激光光散射仪与尺寸排阻色谱法联用(SEC-MALLs)来测定多糖的分子量。结果表明LBP009-2-1的分子量为1.35×10⁴g/mol，LBP009-2-1具有较宽的分布模式，是一种多分散杂多糖。

2.2单糖组成分析

单糖组成分析是质量控制和获取多糖基本信息的重要手段。利用离子色谱法对LBP009-2-1的组成和比例进行了分析。如图2D和图2E所示，根据标准单糖的保留时间可知，LBP009-2-1中阿拉伯糖和半乳糖的摩尔比为1.27:1，还有少量的半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸。LBP009-2-1的组成和比例与先前报道的多糖明显不同。因此，LBP009-2-1是一种新型杂多糖。

2.3傅里叶变换红外光谱分析

傅里叶变换红外光谱分析通常用于部分揭示多糖的特征官能团的存在。如图3B所示，LBP009-2-1在3413.3cm^-1处出现一个宽而强的拉伸峰，表明多糖链之间存在强烈的分子间和分子内相互作用。2929.2cm^-1处的弱吸收带是由于C-H的不对称伸缩振动引起的，1625.5cm^-1处的强吸收峰是由于C＝O或COOH的不对称伸缩振动引起的，表明多糖中存在糖醛酸，这与单糖组成分析结果一致。在1407.0cm^-1处的吸收峰被指定为C-H键的可变角振动。在1000-1200cm^-1范围内的吸收峰被分配给C-O基团的弯曲或拉伸振动。

2.4X射线衍射分析

X射线衍射分析被广泛用于检测物质的结晶程度，能够充分反映多糖的结晶或非结晶性质。如图3C所示，X射线衍射图谱显示了LBP009-2-1的特征衍射曲线。在19.5°和42.8°有两个主要的反射波。这两个衍射峰都呈拱形，表明LBP009-2-1包含两个主要晶体成分。从这些结果中看出，LBP009-2-1被鉴定为半结晶聚合物。

2.5热重分析

通过热重分析法考察了多糖的热稳定性。如图3D所示，在LBP009-2-1的热分解过程中发生了三个主要过程。第一阶段在255℃以下失重15％，主要是由于多糖孔隙中吸附水或结合水的损失所致，说明LBP009-2-1在较低的温度下是稳定的。第二阶段主要失重峰出现在255℃，随着温度的升高，LBP009-2-1的重量急剧下降，失重率约为初始重量的45％，在这个阶段LBP009-2-1经历了强烈的热裂化反应，骨架开始断裂。与第一阶段相似，第三阶段是一个缓慢的失重过程，在这个过程中多糖被完全分解。LBP009-2-1的重量下降较慢，相应的重量下降约12％。

2.6原子力显微镜分析

原子力显微镜是表征多糖形态结构的有效方法。图4显示了密度为5μg/mL的LBP009-2-1的原子力显微镜图像。LBP009-2-1的高度约为1.8nm，分子的直径约为14.5nm。分子间的高度和直径相似，说明LBP009-2-1具有较好的同质性。同时，多糖具有均匀的柱状聚集体结构，排列紧密。

2.7甲基化分析

通过甲基化分析了LBP009-2-1的连接方式，结果见表1和图2。从见表1和图2可知，阿拉伯糖残基存在于复合糖基连接中，包括T-连接Araf(24.9％)、1,2-连接Araf(8.6％)和1,5-连接Araf(18.9％)。半乳糖残基包括1,4-连接的Galp(26.6％)、1,3-连接的Galp(8.4％)和1,3,6-连接的Galp(12.7％)。其中，主要端基残基为T-连接的Araf，三取代残基为1,3,6-连接的Galp。甲基化分析结果表明，LBP009-2-1具有不同单糖组成和连接类型的复杂结构。

表1：LBP009-2-1的甲基化分析表

LBP009-2-1氢谱信号主要集中在3.0～5.5ppm之间。δ3.2-4.0ppm为糖环质子信号，主要端基质子峰δ5.17、5.08、5.07、5.01、4.57、4.56、4.43的信号峰集中分布在4.3～5.5ppm区域内。

LBP009-2-1核磁碳谱信号主要集中在60-120ppm之间。通过观察碳谱，可以看到主要异头碳信号峰δ110.62、108.76、108.69、108.69、105.8、105.22、104.69异头碳区域主要在δ93～105之间。而δ88.8、85.48、85.22、85.12、83.16、83.1、83.07、82.62、82.34、82.34、81.5、78.14、77.97、77.93、77.05、76.6、76.34、74.84、74.81、73.76、71.37、71.3170.76、69.82、69.71、67.61、64.34、64.32、62.64、62.37主要信号峰分布在60～85ppm区域。

LBP009-2-1的Dept135图谱中，62.64、70.76、67.61、64.34、62.1、64.32、62.37存在倒峰，表明为C6的信号峰。根据类似规律并结合HMBC和NOESY，对所有糖苷键信号进行归属，如下表2：二维图谱中，根据核磁一维二维图谱，我们对多糖的糖苷键信号进行归属；

表2：LBP009-2-1的核磁特征峰归属表

主链分析：

→4)-β-D-Galp-(1→异头氢与其→3,6)-β-D-Galp-(1→的C6有相关峰，表明存在→4)-β-D-Galp-(1→3,6)-β-D-Galp-(1→。

→3,6)-β-D-Galp-(1→的异头氢与其自身的C6有相关峰，表明存在→3,6)-β-D-Galp-(1→3,6)-β-D-Galp-(1→。

支链分析：

糖苷键α-L-Araf-(1→的异头氢与→3,6)-β-D-Galp-(1→的C3有相关信号峰；表明存在α-L-Araf-(1→3,6)-β-D-Galp-(1→的链接方式。

糖苷键α-L-Araf-(1→的异头碳与→5)-α-L-Araf-(1→的H5有相关信号峰；表明存在α-L-Araf-(1→5)-α-L-Araf-(1→的链接方式。

糖苷键→5)-α-L-Araf-(1→的异头碳与→3)-β-D-Galp-(1→的H3有相关信号峰；表明存在→5)-α-L-Araf-(1→3)-β-D-Galp-(1→的链接方式。

综上可得：存在α-L-Araf-(1→5)-α-L-Araf-(1→5)-α-L-Araf-(1→3)-β-D-Galp-(1→糖苷键→3)-β-D-Galp-(1→的异头碳与→3,6)-β-D-Galp-(1→的H3有相关信号峰；表明存在→3)-β-D-Galp-(1→3,6)-β-D-Galp-(1→的链接方式。

糖苷键α-L-Araf-(1→的异头碳与→2)-α-L-Araf-(1→的H2有相关信号峰；表明存在α-L-Araf-(1→2)-α-L-Araf-(1→的链接方式。

糖苷键→2)-α-L-Araf-(1→的异头碳与→3)-β-D-Galp-(1→的H3有相关信号峰；表明存在→2)-α-L-Araf-(1→3)-β-D-Galp-(1→的链接方式。

→3)-β-D-Galp-(1→异头碳与其→3,6)-β-D-Galp-(1→的H3有相关峰，含有部分半乳糖醛酸，葡萄糖，木糖。最终确定所筛选的多糖的主链连接方式为→4)-β-D-Galp-(1→6)-β-D-Galp-(1→的糖苷键，而端基支链通过→3,6)-β-D-Galp-(1→O-3键连接在主链上；结构式如下所示：

3、降血脂活性测试

固醇代谢成胆汁酸，以维持正常的消化吸收，减少胆固醇积累，降低血液中胆固醇水平。因此，将胆固醇转化为胆汁酸的过程对于维持体内脂质平衡很重要。在人体内，胆汁酸通常以钠盐或钾盐的形式存在，这种盐被称为胆酸盐。具有胆酸盐结合能力的物质吸收胆酸盐并从体内排出，从而减少胆酸盐在肠肝循环中的积聚，阻碍胆汁酸的再吸收，促进胆固醇的降解和代谢以降低胆固醇水平，以此发挥降血脂作用。表3结果表明，从LBP009-1分离得到的均一多糖LBP009-2-1具有较好的胆酸盐结合能力。

表3：LBPs对牛磺胆酸钠和甘氨酸钠结合率的影响表

注：与LBP009-2-1组比较，*表示差异有显著性(p<0.05)，**表示差异有显著性(p<0.01)。

结果表明LBP009-2-1与牛磺胆酸钠和甘氨酸钠的结合率分别为38.45％和23.45％；相比于其他枸杞多糖具有显著的差异，表明枸杞多糖LBP009-2-1具有良好的降血脂作用。

Claims

1.一种枸杞多糖，其特征在于，所述的枸杞多糖的制备方法如下：将枸杞的水提液分别依次经过分子量为30、10、5kDa的膜进行分离，最后将透过10 kDa的膜组件，并被5 kDa的膜组件截留的枸杞水提液组分冷冻干燥后，溶于蒸馏水中，脱除蛋白后，脱除色素，再进行透析；将纯化后的产物使用DEAE-52层析柱进行柱层析，使用浓度为0.2Mol的氯化钠溶液洗脱，流速为2ml/min，每管收集8 mL；收集的组分用1000Da的透析袋进行透析，透析产物冷冻干燥后再次溶于蒸馏水中，用葡聚糖凝胶Sephadex G-50层析柱进一步分离，用水洗脱，流速为2ml/min，每管收集8 mL，收集34管~48管；收集的组分冷冻干燥完成制备；

其中枸杞的水提液的提取温度60℃，提取30分钟。

2.如权利要求1所述的枸杞多糖，其特征在于，所述的脱除蛋白，是使用氯仿和正丁醇混合溶液脱除蛋白。

3.如权利要求1所述的枸杞多糖，其特征在于，所述的脱除色素，是使用30%的过氧化氢脱除色素。

4.权利要求1所述的枸杞多糖在制备降血脂的药品中的应用。