CN111978421B - 一种桑树桑黄多糖及其制备和用途 - Google Patents

一种桑树桑黄多糖及其制备和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种桑树桑黄多糖及其制备和用途。该桑树桑黄胞内多糖由重量百分含量为99％以上的多糖组成；多糖的组成为葡萄糖和半乳糖，其中，葡萄糖和半乳糖的物质的量之比为80‑99:1。该桑树桑黄胞内多糖的制备方法，包括：通过液体发酵获得桑树桑黄菌丝体，水提醇沉提取桑树桑黄粗多糖，经酶‑Sevage结合法去蛋白、透析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析纯化，真空冷冻干燥分离纯化组分得到桑树桑黄胞内多糖。本发明对纯化后多糖进行组分分析、结构鉴定及降血糖研究，发现本发明桑树桑黄胞内多糖有明显的降血糖活性，可以作为降血糖功能品，也可用于制备降血糖功能品，可广泛用于食品、保健品、动物饲料、医药等领域。

Description

一种桑树桑黄多糖及其制备和用途
技术领域
本发明涉及多糖技术领域，具体涉及一种桑树桑黄多糖及其制备和用途。
背景技术
桑黄孔菌属是一类多年生大型药用真菌，在《本草纲目》和《神农本草经》等历代本草著作中均有桑黄及其药效的明确记载，是目前公认的抗癌效果较高的一种药用大型真菌，有“森林黄金”的美称。自2015年国际桑黄分类学界明确桑黄孔菌属的命名与分类以来，我国流通的多为杨树桑黄(Sanghuangporus vaninii)、鲍姆桑黄(Sanghuangporusbaumii)和桑树桑黄(Sanghuangporus sanghuang)，其中只有桑树桑黄(Sanghuangporussanghuang)才是正宗的桑黄。目前杨树桑黄和鲍姆桑黄已经能够人工规模化栽培，桑树桑黄人工栽培还处于起步阶段。利用生物发酵技术制备生物制品，是克服利用野生资源生物量受限的最佳途径和实现有用代谢产物开发利用的基础。
桑黄多糖是桑黄液体发酵产物中的主要有效成分之一，研究表明桑黄多糖具有降血糖、保肝、抗氧化等多种生物活性；而且它的免疫调节、降血糖等生物活性与其分子链构象及动力学性能紧密相关。由于受糖苷键连接方式、支化结构、分子内氢键、取代基团静电排斥及温度变化等因素的影响，多糖分子的微小变化会引起生物活性的改变。越来越多的研究表明多糖重要功能的发挥是由其结构特征决定的，其高级结构(二级及三级结构)更为密切，多糖的生物活性与其分子量、分子链构象(Conformation)紧密相关，了解该糖分子的构象更有助于阐明其生物活性作用机制。所以发现新的多糖组分及活性，对研究开发新食品保健品、新药等领域具有非常重要的科学意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种从桑树桑黄液体发酵菌丝体中分离确定出化学结构特征的桑树桑黄多糖。
本发明的另一目的是提供所述桑树桑黄多糖的制备方法，该方法具有操作简单、易于控制的优点，适于工业化大规模生产。
本发明还提供了所述桑树桑黄多糖的用途，其具有明显的降血糖活性，可以直接作为降血糖功能品，也可用于制备降血糖功能产品。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种桑树桑黄多糖，由重量百分含量为99％以上的多糖组成；所述多糖由葡萄糖和半乳糖组成，其中，葡萄糖和半乳糖的物质的量之比为80-99:1(优选为90.5-96.7:1)。
所述桑树桑黄多糖为胞内多糖。
为了达到更好的发明效果，优选：
所述半乳糖为β-半乳糖，优选为β-D-半乳糖；所述葡萄糖为α-葡萄糖，优选为α-D-葡萄糖。
所述多糖的结构单元中优选主链结构为(1→4)连接的α-D-葡萄糖(α-D-Glcp)残基，在主链上连续的二个α-D-葡萄糖残基的O-6位上分别被二条支链取代；支链一是(1→4)连接的α-D-葡萄糖(α-D-Glcp)残基和端基α-D-葡萄糖(α-D-Glcp)；支链二是(1→4)连接的α-D-葡萄糖(α-D-Glcp)残基和(1→4)连接的β-D-半乳糖(β-D-Galp)残基以及端基α-D-葡萄糖(α-D-Glcp)。
本发明桑树桑黄多糖的支链有多种不同的变化组合，二条支链在主链上连续的二个α-D-葡萄糖残基的O-6位上可按任意顺序排列，例如可具有如式Ⅰ所示的结构单元(式Ⅰ仅作为二条支链一种排列顺序的示例，并不用于限制二条支链的排列顺序)：
Figure GDA0002737270450000021
式Ⅰ中，Galp为吡喃型半乳糖，Glcp为吡喃型葡萄糖。式Ⅰ所示结构为一个重复单元，具体重复单元的数量依据桑树桑黄多糖的重均分子量来确定。
作为优选，支链二中所述端基α-D-葡萄糖(α-D-Glcp)连接在(1→4)连接的β-D-半乳糖(β-D-Galp)残基的O-4位上。
所述桑树桑黄多糖的重均分子量优选为10KDa-90KDa，进一步优选为11KDa-80KDa，最优选25.3KDa-29.8KDa。
所述桑树桑黄多糖可采用胞内多糖的制备方法从桑树桑黄中制备得到，优选由桑树桑黄液体发酵菌丝体经热水浸提分离得到。具体技术方案如下：
所述桑树桑黄多糖的制备方法，包括步骤：
(1)桑树桑黄的液体发酵：将活化后的桑树桑黄菌种接种于液体种子培养基进行桑黄液体发酵培养，培养10天-12天后，将发酵液离心，得到液体发酵菌丝体，菌丝体经干燥、粉碎，得到桑树桑黄菌丝体粉末；
(2)提取：将步骤(1)中的桑树桑黄菌丝体粉末与水混合形成料液，70℃-95℃提取、离心，所得水提液浓缩，得到浓缩液，在浓缩液中加入乙醇水溶液或乙醇，搅拌混匀，沉淀过夜，离心所得沉淀为一次桑树桑黄粗多糖；
(3)去蛋白：将步骤(2)中一次桑树桑黄粗多糖的水溶液用蛋白酶酶解，灭酶并离心除去变性蛋白和酶，离心所得上清液再用有机溶剂离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用有机溶剂离心的步骤直至无白色沉淀产生，得到提取液；
(4)透析：步骤(3)所得的提取液用孔径为2000Da-6000Da的透析袋在去离子水中透析，收集透析后的提取液，真空冷冻干燥得二次桑树桑黄粗多糖；
(5)纯化：将步骤(4)得到的二次桑树桑黄粗多糖用水溶解得到二次桑树桑黄粗多糖水溶液，经二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖(DEAE纤维素-Sepharose)离子交换层析柱层析，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，收集第一洗脱峰的洗脱液经凝胶过滤层析，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，收集富含多糖的洗脱液，经浓缩、透析和冻干得到白色疏松絮状桑树桑黄多糖，即桑树桑黄胞内多糖，命名为SSIPS1。
为了达到更好的发明效果，优选：
步骤(1)中，所述干燥条件为：在50℃-60℃(最优选55℃)干燥2h-6h；干燥条件比较温和，能够最大程度的保持桑树桑黄中的营养物质。
所述桑树桑黄菌丝体粉末为过60目-120目筛的粉末，更利于充分提取多糖。
所述液体种子培养基以1000mL计由葡萄糖5g-20g、酵母粉4g、蛋白胨3g、KH2PO41g、MgSO4 0.5g和余量的水组成。所述液体种子培养基的配制方法为：葡萄糖5g-20g、酵母粉4g、蛋白胨3g、KH2PO4 1g和MgSO4 0.5g，用水定容至1000mL。
所述桑黄液体发酵培养的温度均为自然环境温度，优选为20℃-30℃，进一步优选为25℃。一般1L液体种子培养基中接入1cm2-4cm2大小活化后的桑树桑黄菌种菌块。
桑树桑黄菌种的活化方法为本领域常规的菌种活化方法，一般包括：将斜面保藏的菌种接种到PDA平板培养基上，在22℃-30℃活化培养3天-10天，得到活化后的菌种。
所述PDA平板培养基采用本领域种子培养常用的培养基，可采用市售产品。进一步优选，所述的PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g-20g，用水定容至1000mL。
本发明所用的培养基均需灭菌后使用，灭菌的条件采用本领域的常规条件，例如可在120℃-125℃下灭菌20min-30min。
本发明桑树桑黄菌种可采用任意一种桑树桑黄(Sanghuangporus sanghuang)菌种，均可达到本发明的效果；可采用市售产品。
步骤(2)中，所述乙醇水溶液或乙醇的用量优选为浓缩液体积的4倍-5倍。所述乙醇水溶液的体积百分浓度优选为大于等于90％。
所述沉淀过夜的温度优选为2℃-5℃。
所述料液中水的用量并没有特别的限制，可选用占桑树桑黄菌丝体粉末重量2倍量-5倍量的水。
步骤(3)中，所述蛋白酶选用木瓜蛋白酶。所述蛋白酶的重量为一次桑树桑黄粗多糖重量的1％-3％。
所述用蛋白酶酶解的条件优选为：50℃-55℃水浴2h-2.5h。
本发明灭酶的条件采用本领域的常规条件，例如可在100℃-105℃下灭酶15min-20min。
所述有机溶剂选用氯仿和正丁醇，其中氯仿和正丁醇的体积比为4:1。
步骤(4)中，在去离子水中透析的时间优选为80h-150h。
步骤(5)中，所述二次桑树桑黄粗多糖水溶液的浓度为10mg/mL-25mg/mL，进一步优选为10mg/mL-15mg/mL；流速1.0ml/min-2.0ml/min。
所述二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱层析的条件为：采用梯度洗脱，洗脱液为0.05mol/L-0.8mol/L的NaCl水溶液，流速1.0ml/min-2.0ml/min。
所述凝胶过滤层析的条件为：洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液和0.15mol/L的NaCl水溶液，其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2-3:1；流速0.5ml/min。
所述凝胶选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，例如市售的Sephacryl S系列(SephacrylS-100)等。
所述磷酸盐缓冲液的配制方法按照本领域通用的方法，例如可参照《中国药典》。
步骤(5)中所述透析选用孔径为3000Da-5000Da的透析袋。
本发明桑树桑黄胞内多糖SSIPS1具有降血糖的作用，SSIPS1在1.0mg/mL时对α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)和α-淀粉酶(α-amylase)活性的抑制率分别为54.21％和53.16％，可以有效抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性；其对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率略微低于药物阿卡波糖，表明其具有较好的降血糖效果。SSIPS1浓度为0.2mg/mL-1.0mg/mL时，SSIPS1的葡萄糖消耗量在2.45mM-5.08mM，在1.0mg/mL浓度下，桑树桑黄多糖SSIPS1的葡萄糖消耗为5.08mM(mmol/L)，表明SSIPS1对HepG2细胞葡萄糖代谢具有较好的改善作用。为了评价桑树桑黄多糖SSIPS1对葡萄糖代谢过程中两个关键苷酶的调节作用，测定了不同浓度SSIPS1处理的己糖激酶(HK)和丙酮酸激酶(PK)活性；与模型组相比，SSIPS1组中HK和PK活性明显升高(*表示p<0.05)。表明SSIPS1对糖代谢有较好的改善作用影响。以上表明本发明桑树桑黄多糖具有明显的降血糖活性，可以作为降血糖功能品，也可用于制备降血糖功能品，可广泛用于食品、保健品、动物饲料、医药等方面。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明通过对桑树桑黄提取分离首次获得一种具有生物活性的大分子桑树桑黄多糖SSIPS1，经检测其多糖重量百分含量在99％以上，经单糖组成鉴定发现该多糖是由葡萄糖和半乳糖组成，其中，葡萄糖和半乳糖的物质的量之比为80-99:1。FTIR证明SSIPS1是杂多糖类，含有α与β构型。激光光散射法证明它是单一组分且重均分子量在10KDa-90KDa。核磁共振图谱确定其糖苷键连接方式，多糖的结构单元中主链结构为(1→4)连接的α-D-葡萄糖残基，在主链上连续的二个α-D-葡萄糖残基的O-6位上分别被二条支链取代；支链一是(1→4)连接的α-D-葡萄糖残基和端基α-D-葡萄糖；支链二是(1→4)连接的α-D-葡萄糖残基和(1→4)连接的β-D-半乳糖残基以及端基α-D-葡萄糖。原子力显微镜观测出该多糖的单糖链高度为0.350nm-0.950nm。
本发明制备方法操作简便，易于控制，能够获得具有较高有序性、结构明确的大分子，为深入研究其高级结构与功能关系提供研究价值。利用本发明方法制备桑树桑黄胞内多糖，不影响其天然结构和活性，且该方法对设备要求较低、成本低，利于工业生产上大规模的推广、开发和使用。
本发明桑树桑黄胞内多糖SSIPS1具有降血糖的作用，SSIPS1在1.0mg/mL时对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的抑制率分别为54.21％和53.16％，可以有效抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性；其对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率略微低于药物阿卡波糖，表明其具有较好的降血糖效果。SSIPS1浓度为0.2mg/mL-1.0mg/mL时，SSIPS1的葡萄糖消耗量在2.45mM-5.08mM，在1.0mg/mL浓度下，桑树桑黄多糖SSIPS1的葡萄糖消耗为5.08mM(mmol/L)，表明SSIPS1对HepG2细胞葡萄糖代谢具有较好的改善作用。为了评价桑树桑黄多糖SSIPS1对葡萄糖代谢过程中两个关键苷酶的调节作用，测定了不同浓度SSIPS1处理的己糖激酶(HK)和丙酮酸激酶(PK)活性。与模型组相比，SSIPS1组中HK和PK活性明显升高(*表示p<0.05)。表明SSIPS1对糖代谢有较好的改善作用影响。以上表明本发明桑树桑黄多糖具有明显的降血糖活性，可以作为降血糖功能品，也可用于制备降血糖功能品，可广泛用于食品、保健品、动物饲料、医药等方面。
附图说明
图1A为二次桑树桑黄粗多糖水溶液经DEAE纤维素-琼脂糖离子交换层析收集的洗脱液在490nm的吸光度(Absorbance at 490nm，记作A490)曲线，Tube number为管数；图1B为经聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶Sephacryl S-100纯化后的洗脱液在490nm的吸光度(Absorbance at490nm)曲线，Tube number为管数；
图2为实施例5中多糖水解物的乙酰化产物的GC-MS图谱；A为样品图谱，B为对照图谱；其中，纵坐标Relative Abundance为响应值，横坐标为保留时间：分钟(min)，Man为甘露糖，Rham为鼠李糖，Glc为葡萄糖，Gal为半乳糖，Xyl为木糖，Ara为阿拉伯糖，Fuc为岩藻糖；
图3为SSIPS1的红外光谱图；其中，纵坐标Transmittance为透光率，横坐标Wavenumbers为波数；
图4为实施例7中部分甲基化阿尔迪醇乙酸酯衍生物的GC-MS图；纵坐标RelativeAbundance为响应值，横坐标为保留时间：分钟(min)；
图5为SSIPS1的激光光散射图；其中，纵坐标Relative Scale为相对比例，横坐标time(min)为时间(分钟)；
图6A为SSIPS1的1H-NMR图谱，图6B为SSIPS1的13C-NMR图谱，图6C为SSIPS1的HSQC图谱，图6D为SSIPS1的1H-13C HMBC图谱；
图7为SSIPS1二维原子力显微镜测试图；
图8A为不同浓度的SSIPS1对α-葡萄糖苷酶活性抑制效果图；图8B为不同浓度的SSIPS1对α-淀粉酶活性抑制效果图；其中，纵坐标Inhibition activity为活性抑制率，横坐标Concentration为SSIPS1浓度；Acarbose为阿卡波糖；
图9为不同浓度的SSIPS1对IR-HepG2细胞葡萄糖吸收的影响图；中纵坐标Glucoseconsumption为葡萄糖消耗量，横坐标中Normal为正常组、Model为模型组、Control为阳性对照组、Concentration为SSIPS1浓度；
图10A和图10B为不同浓度的SSIPS1对IR-HepG2细胞内己糖激酶和丙酮酸激酶活性的影响图；图10A中纵坐标Hexokinase activity(U/g protein)为己糖激酶活性(U/g蛋白)，图10B中纵坐标Pyruvate kinase activity(U/g protein)为丙酮酸激酶活性(U/g蛋白)，横坐标中Normal为正常组、Model为模型组、Control为阳性对照组、Concentration为SSIPS1浓度。
具体实施方式
以下结合附图与实施例对本发明作进一步详细描述。
桑树桑黄(Sanghuangporus sanghuang)菌种购于北纳生物公司。
实施例1
PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g，用水定容至1000mL，自然pH，在121℃下灭菌20min。
将斜面保藏的桑树桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，在22℃活化培养10天，得到活化后的桑树桑黄菌种。
液体种子培养基：葡萄糖5g、酵母粉4g、蛋白胨3g、KH2PO4 1g和MgSO4 0.5g，用水定容至1000mL，自然pH，在121℃下灭菌20min。
(1)桑树桑黄的液体发酵：将2cm2大小活化后的桑树桑黄菌种接种于1L液体种子培养基在25℃进行桑黄液体发酵培养，培养10天后，将发酵液在4000rmp下离心，得到液体发酵菌丝体，将菌丝体在55℃干燥4h后粉碎，过60目筛得到桑树桑黄菌丝体粉末。
(2)提取：将步骤(1)中的桑树桑黄菌丝体粉末，加入占桑树桑黄菌丝体粉末重量2倍量的蒸馏水形成料液，95℃提取、离心，所得水提液浓缩，得到浓缩液，再加入占浓缩液体积4倍量、体积百分浓度95％乙醇水溶液，搅拌混匀，2℃沉淀过夜，离心，取离心所得沉淀得到一次桑树桑黄粗多糖。
(3)去蛋白：将步骤(2)所得的一次桑树桑黄粗多糖的水溶液用木瓜蛋白酶在55℃水浴2h进行酶解，木瓜蛋白酶的重量为一次桑树桑黄粗多糖重量的1.5％，在105℃下灭酶20min并离心除去变性蛋白和酶，离心所得上清液再用有机溶剂氯仿和正丁醇的混合液(其中氯仿和正丁醇的体积比为4:1)离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用有机溶剂离心的步骤直至无白色沉淀产生，得到提取液。
(4)透析：步骤(3)所得的提取液用孔径为2000Da的透析袋在去离子水中透析80h，收集透析后的提取液，真空冷冻干燥得二次桑树桑黄粗多糖。
(5)纯化：将步骤(4)得到的二次桑树桑黄粗多糖用去离子水溶解得到15mg/mL的二次桑树桑黄粗多糖水溶液；用去离子水平衡二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱(10cm×26cm)，将二次桑树桑黄粗多糖水溶液经二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱层析，上样量10ml，流速1.0ml/min；洗脱液为0.05mol/L-0.8mol/L NaCl水溶液梯度洗脱，洗脱液流速1.5ml/min，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测490nm多糖吸收峰(如图1A)，收集第一洗脱峰的洗脱液；
将收集的第一洗脱峰的洗脱液经聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶过滤层析(Sephacryl S-100)进一步纯化，层析柱的规格为2.6cm×100cm，上样量5ml；洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/L NaCl水溶液(其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2:1)，洗脱液流速0.5ml/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖峰(如图1B)，收集含多糖的洗脱液，经浓缩、孔径为3000Da的透析袋透析和冻干得到白色疏松絮状均一的桑树桑黄多糖，即桑树桑黄胞内多糖，命名为SSIPS1。
实施例2
PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂20g，用水定容至1000mL，自然pH，在120℃下灭菌30min。
将斜面保藏的桑树桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，在30℃活化培养3天，得到活化后的桑树桑黄菌种。
液体种子培养基：葡萄糖20g、酵母粉4g、蛋白胨3g、KH2PO4 1g和MgSO4 0.5g，用水定容至1000mL，自然pH，在120℃下灭菌30min。
(1)桑树桑黄的液体发酵：将1cm2大小活化后的桑树桑黄菌种接种于1L液体种子培养基在20℃进行桑黄液体发酵培养，培养12天后，将发酵液在4000rmp下离心，得到液体发酵菌丝体，将菌丝体在60℃干燥2h后粉碎，过120目筛得到桑树桑黄菌丝体粉末。
(2)提取：将步骤(1)中的桑树桑黄菌丝体粉末，加入占桑树桑黄菌丝体粉末重量5倍量的蒸馏水形成料液，70℃提取、离心，所得水提液浓缩，得到浓缩液，再加入占浓缩液体积4倍量、体积百分浓度96％乙醇水溶液，搅拌混匀，3℃沉淀过夜，离心，取离心所得沉淀得到一次桑树桑黄粗多糖。
(3)去蛋白：将步骤(2)所得的一次桑树桑黄粗多糖的水溶液用木瓜蛋白酶在50℃水浴2.5h进行酶解，木瓜蛋白酶的重量为一次桑树桑黄粗多糖重量的3％，在105℃下灭酶15min并离心除去变性蛋白和酶，离心所得上清液再用有机溶剂氯仿和正丁醇的混合液(其中氯仿和正丁醇的体积比为4:1)离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用有机溶剂离心的步骤直至无白色沉淀产生，得到提取液。
(4)透析：步骤(3)所得的提取液用孔径为5000Da的透析袋在去离子水中透析100h，收集透析后的提取液，真空冷冻干燥得二次桑树桑黄粗多糖。
(5)纯化：将步骤(4)得到的二次桑树桑黄粗多糖用去离子水溶解得到10mg/mL的二次桑树桑黄粗多糖水溶液；用去离子水平衡二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱(10cm×26cm)，将二次桑树桑黄粗多糖水溶液经二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱层析，上样量5ml，流速2.0ml/min；洗脱液为0.05mol/L-0.8mol/L NaCl水溶液梯度洗脱，洗脱液流速2.0ml/min，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测490nm多糖吸收峰(如图1A)，收集第一洗脱峰的洗脱液；
将收集的第一洗脱峰的洗脱液经聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶过滤层析(Sephacryl S-100)进一步纯化，层析柱的规格为2.6cm×100cm，上样量5ml；洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/LNaCl水溶液(其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2:1)，洗脱液流速0.5ml/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖峰(如图1B)，收集含多糖的洗脱液，经浓缩、孔径为5000Da的透析袋透析和冻干得到白色疏松絮状均一的桑树桑黄多糖，即桑树桑黄胞内多糖，命名为SSIPS1。
实施例3
PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g，用水定容至1000mL，自然pH，在125℃下灭菌20min。
将斜面保藏的桑树桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，在25℃活化培养7天，得到活化后的桑树桑黄菌种。
液体种子培养基：葡萄糖12g、酵母粉4g、蛋白胨3g、KH2PO4 1g和MgSO4 0.5g，用水定容至1000mL，自然pH，在125℃下灭菌20min。
(1)桑树桑黄的液体发酵：将4cm2大小活化后的桑树桑黄菌种接种于1L液体种子培养基在30℃进行桑黄液体发酵培养，培养10天后，将发酵液在4000rmp下离心，得到液体发酵菌丝体，将菌丝体在50℃干燥6h后粉碎，过100目筛得到桑树桑黄菌丝体粉末。
(2)提取：将步骤(1)中的桑树桑黄菌丝体粉末，加入占桑树桑黄菌丝体粉末重量3倍量的蒸馏水形成料液，85℃提取、离心，所得水提液浓缩，得到浓缩液，再加入占浓缩液体积5倍量、体积百分浓度90％乙醇水溶液，搅拌混匀，5℃沉淀过夜，离心，取离心所得沉淀得到一次桑树桑黄粗多糖。
(3)去蛋白：将步骤(2)所得的一次桑树桑黄粗多糖的水溶液用木瓜蛋白酶在55℃水浴2h进行酶解，木瓜蛋白酶的重量为一次桑树桑黄粗多糖重量的1％，在100℃下灭酶20min并离心除去变性蛋白和酶，离心所得上清液再用有机溶剂氯仿和正丁醇的混合液(其中氯仿和正丁醇的体积比为4:1)离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用有机溶剂离心的步骤直至无白色沉淀产生，得到提取液。
(4)透析：步骤(3)所得的提取液用孔径为4000Da的透析袋在去离子水中透析150h，收集透析后的提取液，真空冷冻干燥得二次桑树桑黄粗多糖。
(5)纯化：将步骤(4)得到的二次桑树桑黄粗多糖用去离子水溶解得到12mg/mL的二次桑树桑黄粗多糖水溶液；用去离子水平衡二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱(10cm×26cm)，将二次桑树桑黄粗多糖水溶液经二乙氨基乙基纤维素-琼脂糖离子交换层析柱层析，上样量8ml，流速1.5ml/min；洗脱液为0.05mol/L-0.8mol/L NaCl水溶液梯度洗脱，洗脱液流速1ml/min，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测490nm多糖吸收峰(如图1A)，收集第一洗脱峰的洗脱液；
将收集的第一洗脱峰的洗脱液经聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶过滤层析(Sephacryl S-100)进一步纯化，层析柱的规格为2.6cm×100cm，上样量5ml，洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)+0.15mol/LNaCl水溶液(其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为3:1)，流速0.5ml/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖峰(如图1B)，收集含多糖的洗脱液，经浓缩、孔径为4000Da的透析袋透析和冻干得到白色疏松絮状均一的桑树桑黄多糖，即桑树桑黄胞内多糖，命名为SSIPS1。
下面是对SSIPS1结构鉴定或性能分析的实施例：
实施例4：理化性质组分及分子量检测
将实施例1制得的桑树桑黄多糖即桑树桑黄胞内多糖SSIPS1，用苯酚-硫酸法检测总多糖重量百分含量为99.5％。从图5看出，检测到90°光散射LS信号、示差检测器检RI信号和粘度检测器VIS的信号峰具有相似的峰形，几乎完全重叠，这表明两种检测器间的延迟已被准确地校正。很显然，样品SSIPS1的保留时间主要分布在30min-45min，RI信号显示多糖呈单一对称的峰形，表明SSIPS1是均一的多糖。此外，分子量分布由Mw/Mn表示，即样品的分散度，分子量分布越宽，分散度就越大。该桑树桑黄胞内多糖Mw/Mn的比值为1.235，比较接近1，表明SSIPS1是一个相对较窄分布的多糖组分，其分子量Mw＝2.98×104Da。
将实施例2制得的桑树桑黄多糖即桑树桑黄胞内多糖SSIPS1，用苯酚-硫酸法检测总多糖重量百分含量为99.5％。其激光光散射图与图5相同，检测到90°光散射LS信号、示差检测器检RI信号和粘度检测器VIS的信号峰具有相似的峰形，几乎完全重叠，这表明两种检测器间的延迟已被准确地校正。很显然，样品SSIPS1的保留时间主要分布在30min-45min，RI信号显示多糖呈单一对称的峰形，表明SSIPS1是均一的多糖。此外，分子量分布由Mw/Mn表示，即样品的分散度，分子量分布越宽，分散度就越大。该桑树桑黄胞内多糖Mw/Mn的比值为1.165，比较接近1，表明SSIPS1是一个相对较窄分布的多糖组分，其分子量Mw＝2.53×104Da。
将实施例3制得的桑树桑黄多糖即桑树桑黄胞内多糖SSIPS1，用苯酚-硫酸法检测总多糖重量百分含量为99.5％。其激光光散射图与图5相同，检测到90°光散射LS信号、示差检测器检RI信号和粘度检测器VIS的信号峰具有相似的峰形，几乎完全重叠，这表明两种检测器间的延迟已被准确地校正。很显然，样品SSIPS1的保留时间主要分布在30min-45min，RI信号显示多糖呈单一对称的峰形，表明SSIPS1是均一的多糖。此外，分子量分布由Mw/Mn表示，即样品的分散度，分子量分布越宽，分散度就越大。该桑树桑黄胞内多糖Mw/Mn的比值为1.138，比较接近1，表明SSIPS1是一个相对较窄分布的多糖组分，其分子量Mw＝2.96×104Da。
实施例5：单糖组成
取实施例1、实施例2或者实施例3制得的桑树桑黄多糖即桑树桑黄胞内多糖3mg，放入薄壁长试管中，加入2.0mol·L-1三氟乙酸4.0mL，封管，在110℃水解2h。水解后，试管中溶液低于40℃减压蒸干，然后加入甲醇蒸干，“加入甲醇蒸干”的步骤重复操作4-5次，以完全除去三氟乙酸，得到完全酸水解的样品。
将各种单糖标准品和完全酸水解的样品分别溶于3mL蒸馏水中，加入30mg硼氢化钠，密塞，于室温下还原3h，然后用冰醋酸中和过量的硼氢化钠，加入少量甲醇，减压浓缩蒸干，重复“加入少量甲醇，减压浓缩蒸干”步骤4-5次。再加入醋酐(乙酸酐)4mL，100℃反应1h，然后加入3mL甲苯，减压浓缩蒸干，得到乙酰化后的产物。将乙酰化后的产物用3mL氯仿溶解后转移至分液漏斗，加入等量的蒸馏水充分混匀，待静置后，除去上层水溶液，如此重复3-4次。氯仿层以适量的无水硫酸钠干燥、过滤，用氯仿定容至10mL，即得多糖水解物的乙酰化产物，待GC-MS分析。
GC-MS条件:采用DB-5毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)，程序升温(初始柱温为120℃，以10℃·min-1升温至240℃，保持6.5min)，接口温度250℃，离子源温度250℃，进样量2.0μL，以氦气做载气，流速1.0mL·min-1。
多糖水解物的乙酰化产物的GC-MS图谱如图2，对应单糖标准品，实施例1中SSIPS1多糖部分的单糖组成为由葡萄糖和半乳糖组成，其中，葡萄糖和半乳糖的物质的量之比为93.6:1。说明SSIPS1主要是葡萄糖为主，并含有少量半乳糖的多糖。
对应单糖标准品，实施例2中SSIPS1多糖部分的单糖组成为由葡萄糖和半乳糖组成，其中，葡萄糖和半乳糖的物质的量之比为90.5:1。说明SSIPS1主要是葡萄糖为主，并含有少量半乳糖的多糖。
对应单糖标准品，实施例3中SSIPS1多糖部分的单糖组成为由葡萄糖和半乳糖组成，其中，葡萄糖和半乳糖的物质的量之比为96.7:1。说明SSIPS1主要是葡萄糖为主，并含有少量半乳糖的多糖。
实施例6：FTIR
取5mg实施例1、实施例2或者实施例3制得的桑树桑黄多糖SSIPS1，用KBr压片，美国Nicolet5700红外光谱仪4000-600cm-1红外扫描。
如图3，IR谱图在3402cm-1，出现一强宽吸收峰，为多糖上O-H伸缩振动的强吸收峰，表明多糖的分子内和分子间均存在氢键。2930cm-1为C-H伸缩振动，1420m-1处的吸收峰为C-H的变形振动。1650cm-1和1420cm-1为-CH2的变形振动吸收峰。此外，在1024cm-1存在多糖结构中吡喃环的特征吸收峰，即糖苷键C-O-C的非对称振动吸收峰。在1080cm-1的吸收峰为吡喃型糖苷环骨架C-O变角振动吸收峰；结果显示854cm-1处存在吸收峰表明SSIPS1的结构中含有α-型糖苷键。
实施例7：甲基化分析
取2mg实施例1、实施例2或者实施例3制得的桑树桑黄多糖SSIPS1样品溶于1ml二甲基亚砜(DMSO)中，通氮气密封，超声片刻助溶，然后按照Ciucanu,et al.方法进行甲基化制备(Ciucanu,L.,&Kerek,F..A simple and repid method for permethylationofcarbohydrates.Carbohydrate Research,131,209-217)。
SSIPS1经过三次甲基化后，再经酸水解、还原，乙酰化制备成部分甲基化阿尔迪醇乙酸酯衍生物，进行GC-MS分析(见图4和表1)。由表1可知：该多糖含有4种残基，分别是2,3,4,6-4-O-甲基葡萄糖，2,3,6-3-O-甲基半乳糖，2,3,6-3-O-甲基葡萄糖，2,3-2-O-甲基葡萄糖。上述结果表明SSIPS1由D-Glcp-(1→，→4)-D-Galp-(1→，→4)-D-Glcp-(1→，→1)-D-Glcp-(4,6→组成，摩尔比为1.20:0.46:6.25:1。
通过比较SSIPS1的甲基化结果发现，多糖中(1→4)糖苷键连接的葡萄糖含量最高，而(1→4)糖苷键连接的半乳糖含量较少，另外还有少量的葡萄糖的端基。
表1 SSIPS1甲基化分析
Figure GDA0002737270450000151
实施例8：核磁共振
取60mg实施例1、实施例2或者实施例3制得的桑树桑黄多糖SSIPS1溶于0.5ml氘水中，瑞士Bruker-AVIII500M进行600MHz NMR扫描。
根据SSIPS1的1H-NMR(见图6A)、13C-NMR(见图6B)结合HSQC谱(见图6C)，检测到8个峰较为显著可用于分析。在1H-NMR谱中，于化学位移δ4.56-5.32ppm之间显示了SSIPS1的主要的5个异头质子信号，按低场到高场分别为δ5.32,δ5.32,δ5.28,δ4.90和δ4.56ppm，分别命名为糖残基A、B、C、D、E；13C-NMR谱中也有5个异头碳信号(图6B)，δ105.96,δ101.37,δ101.28,δ101.28和δ100.19ppm分别逐一对应。为了进一步阐明其化学结构，糖残基A-H的1H-NMR、13C-NMR谱化学位移经进一步结合1H-1H COSY、1H-1H TCOSY、1H-13C HSQC和1H-13CHMBC等二维核磁共振谱得到归属，归属结果见表2。
各残基的化学位移见表2，分析推断所有残基的氢、碳化学位移，耦合常数与标准残基对照发现，A、B、C、D归属于Glc糖残基，E归属于Gal糖残基。一般通过各个糖残基异头氢的化学位移可以判断异头碳的构型，δ>5.00ppm为α-型，δ<5.00ppm为β-型，从核磁解析结果可以发现Glc异头氢的化学位移处于相对低场(δ>5.00ppm)，为α-构型，Gal的异头氢的化学位移均处于相对高场(δ<5.00ppm)，为β-构型。一般来说可以通过“苷化位移”来判断多糖中单糖之间的连接位置，糖残基的各个碳都得到归属后，通过与已知单糖的碳的化学位移相对照，确定糖链的连接位置。残基A的C-4位、4位与未发生取代的糖残基的化学位移向低场分别移动，所以残基A的连接位置在4位，为→4)-α-Glcp-(1→残基。残基B的各个氢和碳的化学位移几乎与标准单糖的化学位移一致，属于末端残基，为(1→)-α-D-Glcp。残基D的C-4化学位移向低场移动，表明连接位置为4位，表明D为→4)-α-Glcp-(1→残基。同理分析残基C的连接位置分别在C-4、C-6位，E残基的连接位置为C-4，残基C、E分别是→4,6)-α-Glcp-(1→残基和→4)-β-Galp-(1→。以上分析结果和甲基化分析结果相一致。
表2 SSIPS1糖残基的化学位移全归属
Figure GDA0002737270450000161
通过HMBC谱可以推断出多糖SSIPS1糖残基之间的连接方式。在HMBC谱中，残基E的C-4(δ79.24ppm)与残基A的H-1(δ5.32ppm)存在交叉峰，表明残基A连接在残基E的O-4位。残基C的H-1(δ5.28ppm)与残基A的C-4(δ78.35ppm)存在交叉峰，表明残基C连接在残基A的O-4位上。残基E的H-1(δ4.56ppm)与残基D的C-4(δ78.35ppm)存在交叉峰，表明残基E连接在残基D的O-4位上。残基D的H-1(δ4.90ppm)与残基C的C-6(δ69.37ppm)存在交叉峰，表明残基D连接在残基C的O-6位上。交叉峰δ5.32/78.35和δ5.28/79.24分别表明残基A的H-1连接在残基A的O-4位，残基C的H-1连接在残基C的O-4位。同理，交叉峰δ5.32/79.24和δ5.32/78.35分别表明残基B连接在残基E的O-4位和残基B连接在残基D的O-4位。
上述结果与甲基化分析的结果相符。
实施例9：原子力显微镜测试
将质量百分浓度为5％-10％的实施例1、实施例2或者实施例3制得的桑树桑黄多糖SSIPS1水溶液涂抹在云母片上测试，获得该多糖的原子力图，如图7中的二维原子力形貌图，从结果中可以看出样品呈现出为伸展的柔顺链，单糖链高度为0.350nm-0.950nm。
本发明建立了桑树桑黄多糖提取纯化的方法，获得均一多糖，并初步研究其一级结构，对进一步进行生物活性及构效关系的探讨有重要的意义。
综合实施例4-实施例9的分析结果，证实了SSIPS1由重量百分含量为99％以上的多糖组成；经单糖组成鉴定发现该多糖是由葡萄糖和半乳糖组成，其中，葡萄糖和半乳糖的物质的量之比为80-99:1。FTIR证明SSIPS1是杂多糖类，含有α与β构型。激光光散射法证明它是单一组分且重均分子量为10KDa-90KDa。核磁共振图谱确定其糖苷键连接方式，多糖的结构单元中主链结构为(1→4)连接的α-D-葡萄糖(α-D-Glcp)残基，在主链上连续的二个α-D-葡萄糖残基的O-6位上分别被二条支链取代；支链一是(1→4)连接的α-D-葡萄糖(α-D-Glcp)残基和端基α-D-葡萄糖(α-D-Glcp)；支链二是(1→4)连接的α-D-葡萄糖(α-D-Glcp)残基和(1→4)连接的β-D-半乳糖(β-D-Galp)残基以及端基α-D-葡萄糖(α-D-Glcp)。支链二中端基α-D-葡萄糖(α-D-Glcp)连接在(1→4)连接的β-D-半乳糖(β-D-Galp)残基的O-4位上。具体结构单元可以是结构式Ⅰ所示的一种结构单元，也可以是二条支链按其它排列顺序排列的结构单元。
实施例10：不同浓度的SSIPS1对IR-HepG2细胞葡萄糖吸收的影响
参照Chen等的方法(S.Chen,H.Chen,J.Tian,Y.Wang,L.Xing,J.Wang,Chemicalmodification,antioxidant andα-amylase inhibitory activities of corn silkpolysaccharides,Carbohydr.Polym.98(2013)428-437.)，本发明检测了实施例1、实施例2或者实施例3制得的桑树桑黄多糖SSIPS1对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性抑制率，结果见图8A和图8B，1.0mg/mL桑树桑黄多糖SSIPS1对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的抑制率分别为54.21％和53.16％，可以有效抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性；其对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的抑制率略微低于药物阿卡波糖，表明其具有较好的降血糖效果。
参考Cao方法(L.Cao,B.Zhang,C.Li,Q.Huang,X.Fu,R.H.Liu,Structure and invitro hypoglycemic activity of a homogenous polysaccharide purified fromSargassum pallidum,Food Funct.10(2019)2828-2838.)建立HepG2细胞胰岛素抵抗模型(IR-HepG2)作为模型组。分别设置低糖培养组和高糖培养组，低糖培养基包括10％(重量百分比)胎牛血清，50单位/mL青霉素，50单位/mL链霉素的DEME低糖培养基(5mM葡萄糖)，高糖培养基包括10％(重量百分比)胎牛血清，50单位/mL青霉素，50单位/mL链霉素的DEME高糖培养基(25mM葡萄糖)。取对数生长期的HepG2细胞，调整细胞浓度按照3×104个的密度接种于96孔细胞培养板中，置于37℃、5％(体积百分比)CO2的培养箱中培养12h。待细胞贴壁后，吸去培养基，用PBS缓冲液洗细胞两次，加入100μL未加胎牛血清的培养基，分别设置空白组为未加细胞的培养基(高糖培养基)，正常组(Normal)为低糖培养基，多糖处理组为模型组加不同浓度的桑树桑黄多糖SSIPS1，二甲双胍(Metformin，10mM)为阳性对照组。继续在培养箱中培养24h后，用葡萄糖试剂盒(南京建成，F006)测量细胞培养基中葡萄糖浓度。不同处理组细胞的存活率采用MTT法。
取对数生长期的细胞，按照106个/孔的密度接种于6孔细胞培养板中，按照上述方法设置IR-HepG2细胞模型作为模型组，同时以给药二甲双胍的IR-HepG2细胞作为阳性对照物，以不给药的IR-HepG2细胞作为阴性对照组，给予不同浓度的桑树桑黄多糖溶液(200μg/mL、400μg/mL、80μg/mL、1000μg/mL)作为SSIPS1组，培养24h。弃去培养基，PBS缓冲液洗涤2次，用浓度为10μM2-NBDG(2-脱氧-2-[(7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑-4-基)氨基]-D-葡萄糖)、37℃避光孵育1h后，离心弃去上清液，用PBS缓冲液洗涤2次，收集细胞重悬于0.5mL的PBS缓冲液中，立即用流式细胞仪进行检测，设定激发波长为485nm，发射波长为530nm。用软件FlowJo 7.6.1处理得到实验结果。
通过建立IR HepG2细胞模型来测定SSIPS1的降糖活性，结果如图9所示。由图9可以发现模型组(2.15mM)的葡萄糖消耗量远低于正常组(5.64mM)，说明模型成功。与模型组相比，经SSIPS1处理的IR-HepG2细胞的葡萄糖消耗随着SSIPS1浓度的增加而显著增加。浓度为0.2mg/mL-1.0mg/mL时，SSIPS1的葡萄糖消耗量在2.45mM-5.08mM，当浓度为1.0mg/mL时，SSIPS1的葡萄糖吸收可上升至5.08mM，说明SSIPS1可以提高IR-HepG2细胞的葡萄糖吸收能力，对HepG2细胞的葡萄糖代谢有较好的改善作用。
实施例11：不同浓度的SSIPS1对IR-HepG2细胞内己糖激酶和丙酮酸激酶活性的影响
本发明检测了实施例1、实施例2或者实施例3制得的桑树桑黄多糖SSIPS1在不同浓度时对IR-HepG2细胞内己糖激酶和丙酮酸激酶活性的影响
按照实施例10中方法分别设立正常组、模型组、阳性对照组以及桑树桑黄多糖SSIPS1处理组，孵育24h后，胰酶消化细胞。用PBS缓冲液洗涤细胞，1000rpm离心10min，此步骤重复两次，然后用PBS缓冲液重悬细胞使浓度达到1×106个/mL。冰水浴条件下超声破碎，以使细胞破坏并释放出细胞内成分，采用BCA法测破碎液中的总蛋白含量。然后用己糖激酶试剂盒(南京建成，A077-1)和丙酮酸激酶试剂盒(南京建成，A076-1)测定IR-HepG2细胞培养基中HK和PK活性。检测结果见图10。
由图10A和图10B可以看出，与模型组相比，SSIPS1处理组HK、PK活性显著提高(*表示p<0.05)，尤其是SSIPS1浓度大于等于0.6mg/mL时HK、PK活性显著提高(*表示p<0.05)。当SSIPS1浓度达到1.0mg/mL时，HK、PK活性与二甲双胍(2mM)处理的阳性对照组接近。综上所述，SSIPS1通过调节关键相关酶的活性，可以提升IR-HepG2细胞内PK与HK的活性，对葡萄糖代谢具有相当大的积极影响。
上述研究表明本发明桑树桑黄胞内多糖具有较强的降血糖活性，可以作为降血糖添加剂、食品和/或保健品等降血糖功能品，也可用于制备具有降血糖功能的食品、保健品、动物饲料和/或药品等。
本发明中桑树桑黄多糖为胞内多糖，由重量百分含量为99％以上的多糖组成，多糖由葡萄糖和半乳糖组成，葡萄糖和半乳糖的物质的量之比为80-99:1(优选为90.5-96.7:1)，该组成的多糖具有较强的降血糖活性，可以提升细胞内PK与HK的活性。本发明制备方法中参数的变化并不影响桑树桑黄胞内多糖的制备，因此本发明制备方法中任意参数的组合均可实现桑树桑黄胞内多糖的制备。在此不再赘述。

Claims (5)

1.一种桑树桑黄多糖，其特征在于，由重量百分含量为99%以上的多糖组成；所述多糖由葡萄糖和半乳糖组成，其中，葡萄糖和半乳糖的物质的量之比为80-99:1；
所述半乳糖为β-半乳糖，所述葡萄糖为α-葡萄糖；
所述β-半乳糖为β-D-半乳糖，所述α-葡萄糖为α-D-葡萄糖；
所述多糖的结构单元中主链结构为(1→4)连接的α-D-葡萄糖残基，在主链上连续的二个α-D-葡萄糖残基的O-6位上分别被二条支链取代；支链一是(1→4)连接的α-D-葡萄糖残基和端基α-D-葡萄糖；支链二是(1→4)连接的α-D-葡萄糖残基和(1→4)连接的β-D-半乳糖残基以及端基α-D-葡萄糖；
支链二中所述端基α-D-葡萄糖连接在(1→4)连接的β-D-半乳糖残基的O-4位上；
所述桑树桑黄多糖的重均分子量为10KDa-90KDa。
2.根据权利要求1所述的桑树桑黄多糖，其特征在于，二条支链的排列顺序为任意顺序。
3.根据权利要求1-2任一项所述的桑树桑黄多糖的制备方法，其特征在于，所述桑树桑黄多糖由桑树桑黄Sanghuangporus sanghuang的液体发酵菌丝体经热水浸提分离得到。
4.根据权利要求1-2任一项所述的桑树桑黄多糖在制备食品或保健品中的应用。
5.根据权利要求1-2任一项所述的桑树桑黄多糖在制备具有降血糖功能的添加剂、动物饲料或药品中的应用。
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