KR100491186B1 - 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양법에 의해 생성된이소플라본-베타디글루칸 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아가리쿠스 버섯균사체 액체 배양물을 이용하여 이소플라본-베타디글루칸을 제조하는 방법 및 그 방법에 의하여 제조된 항암 및 면역기능을 가지는 물질에 관한 것으로서, 특히 제조방법에 있어서 아가리쿠스 버섯균스체 자체의 자가분해효소를 이용하여 중ㆍ저분자 이소플라본-베타디글루칸을 제조하고, 제조된 중ㆍ저분자 이소플라본-베타디글루칸은 항암효과 뿐 아니라 면역증진효과를 동시에 갖는다.

Description

아가리쿠스 버섯균사체 액체배양법에 의해 생성된 이소플라본-베타디글루칸 및 그의 제조방법{ THE ISOFLAVONE-β-D-GLUCAN PRODUCED BY AGARICUS BLAZEI IN THE SUBMERGED LIQUID CULTUR AND THE PRODUCING METHOD THERE OF}

본 발명은 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양법에 의해 생성된 베타디글루칸(β-D-glucan)에 관한 것으로서, 특히 이소플라본(isoflavone)과 결합된 이소플라본-베타디글루칸(isoflavone-β-D-glucan)에 관한 것이다.

본 발명은 상기 이소플라본-베타디글루칸의 제조방법에 관한 것으로서, 특히 고분자 이소플라본- 베타디글루칸을 아가리쿠스 버섯균사체 배양물의 자가분해효소를 이용하여 중ㆍ저분자 이소플라본을- 베타디글루칸으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 상기 이소플라본-베타디글루칸의 용도에 관한 것으로서, 특히 항암효과와 면역증진효과에 관한 것이다.

암은 사망원인 1위로서 작년 국내 암환자는 25만명에 달하였는바, 항암은 끊임없는 관심사이다. 기존의 항암제는 암세포에 대한 선택성이 없이 독성이 매우 강하여 정상세포에까지 영향을 미치는 결과, 탈모, 면역력 저하, 간기능 저하 등의 여러가지 부작용을 가져오는 문제점이 있었다.

이에 부작용이 적은 각종 식품으로부터 천연 항암성 성분을 얻고자 하는 연구가 다양하게 진행되고 있으며 그 결과, 버섯균사체에서 얻을 수 있는 다당류인 베타디글루칸과, 대두 등에 함유되어 있는 이소플라본이 각각 항암효과가 있다는 사실이 밝혀졌다.

특히, 베타디글루칸은 버섯의 주요 생리활성물질로서, 버섯의 항암효과는 베타디글루칸이 면역세포를 활성화시켜 암의 진행을 늦추고 전이를 막는 기능을 수행하는 것에 기인하는 것으로 밝혀졌으며, 이러한 이유로 베타디글루칸을 항암치료와 병행하여 사용하면 그 약효가 우수함이 밝혀져 있다.

따라서, 선진 각국에서는 버섯균사체 배양물의 추출물인 베타디글루칸을 상품화하고 있다. 그 예로 최근 일본에서 수입되어 판매되고 있는 AHCC는 표고 등을 포함하는 7가지 버섯균사체 배양물의 추출물을 혼합하여 상품화한 것으로서 암 환자를 대상으로 병원 영업망을 통해 유통되고 있으며, 일본 뿐만 아니라 미국시장에서는 아라비녹실란(arabinoxylan)이 유통되고 있는데 이 또한 표고버섯균사체 배양물로부터의 추출물이다. 국내에서는 상황버섯의 균사체 추출물이 메시마-이엑스 (Mesima-EX 한국신약)라는 상품명으로 개발되었으며 지금 임상시험중에 있다.

그러나, 지금까지 상품화된 버섯균사체 배양물의 추출물은 그 추출과정에 고비용이 드는 문제상 일반인들에게 널리 보급되지 못하고 있다.

이는 버섯균사체 배양물의 추출물인 다당류의 추출량이 곧 버섯 배양기간과 균사생장속도에 좌우되는데, 표고버섯균사체, 상황버섯균사체, 영지버섯균사체 등은 배양기간이 길고 균사생장이 느리기 때문에 추출될 수 있는 양도 적을 수 밖에 없기 때문이다.

또한, 추출된 고분자 다당류가 체내에서 흡수가 용이하려면 분자량이 작아야 하기 때문에 이를 중ㆍ저분자 다당류로 가수분해하는 단계가 필요한데, 이 가수분해효소의 구입이 쉽지 않아 생산이 고비용이 될 수 밖에 없었고, 가수분해 후에 생성된 중ㆍ저분자 다당류를 분리ㆍ정제할 수 있는 추출기술이 부족하여 수율이 매우 낮은 실정이다.

상기한 이소플라본은 대두에 주로 함유되어 있는 물질로서, 유리형태 (aglycon)인 다이드자인 (daidizein), 게네스테인(genestein),글리시테인 (glycitein)과 배당체 형태인 다이드진(daidzin), 게니스틴(genistin),글리시틴(glycitin)과 이의 아세틸배당체 (acetylglucose)와 말로닐배당체 (malonylglucose) 각각 3가지씩으로써 대부분 배당체로 존재한다. 이소플라본은 항돌연변이성, 항암성을 가진 물질로 알려져 있는데, 이의 항암작용은 대부분 유리형태인 게네스테인에 의한 것이며, 다른 물질과 결합된 배당체 형태로 존재하는 경우에는 항암효과가 밝혀지지 않은 바이다.

상술한 바와 같이, 항암성 물질이면서도 정상세포에는 영향을 미치지 않으면서 동시에 면역세포활성화 기능을 겸하는 물질이 요구되며, 또한, 그러한 물질이 저비용이면서 다량 추출될 수 있는 방안이 요구되는 시점이다.

이에 본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위하여 항암효과를 갖는 천연성분인 이소플라본과 면역증진효과를 갖는 천연성분인 베타디글루칸의 배당체를 제조하여 항암효과와 면역효과를 동시에 갖는 물질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 종래 버섯균사체 배양물로부터 고분자 베타디글루칸을 추출한 다음, 버섯균사체 자체가 분비하는 자가분해효소를 이용하여 효율적으로 중ㆍ저분자 베타디글루칸으로 분해하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 아가리쿠스 버섯균사체의 액체배양물을 이용하여 생성된 이소플라본-베타디글루칸의 제조방법은, 이소플라본을 함유하는 배지에 아가리쿠스 버섯균사체를 액체배양하여 고분자 이소플라본- 베타디글루칸을 생성하는 단계 ; 상기 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물로부터 상기 고분자 이소플라본- 베타디글루칸을 분리하는 단계 ; 별개의 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물로부터 자가분해효소를 분리하는 단계 ; 상기 고분자 이소플라본- 베타디글루칸에 상기 자가분해효소를 반응시켜 중ㆍ저분자 이소플라본-베타디글루칸을 생성하는 단계 ; 및 상기 중ㆍ저분자 이소플라본- 베타디글루칸을 분리 정제하는 단계 ; 를 포함한다.

여기에서, 상기 고분자 이소플라본- 베타디글루칸을 분리하는 단계는 상기 아가리쿠스 버섯균사체 액체 배양물의 열수추출액의 농축용액에 에탄올을 처리하는 단계 ; 상기 농축용액에 에탄올을 처리한 용액을 침전시킨 후 원심분리하여 침전물을 분리하는 단계를 포함한다. 특히, 상기 에탄올은 80 %의 농도로 처리하는 것을 포함한다.

상기 자가분해효소를 분리하는 단계는 상기 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물을 감압여과하는 단계 ; 상기 감압여과한 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물에 트리클로로아세틱 액시드(trichloroacetic acid, 이하 'TCA'라 한다.)를 혼합하고 원심분리하는 단계 ; 상기 원심분리하여 생긴 침전물을 분리하는 단계 ; 를 포함한다.

상기 중ㆍ저분자 이소플라본- 베타디글루칸을 생성하는 단계는 상기 자가분해효소를 pH 4.5 ~ pH 5.5 에서 반응시키는 것을 포함한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 아가리쿠스 버섯균사체의 액체배양물을 이용하여 생성된 이소프라본-베타디글루칸의 또 하나의 제조방법은 , 이소플라본을 함유하는 배지에 아가리쿠스 버섯균사체를 액체배양하여 고분자 이소플라본-베타디글루칸을 생성하는 단계 ; 상기 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물의 자가분해효소를 활성화시켜 중ㆍ저분자 이소플라본-베타디글루칸을 생성하는 단계 ; 및 상기 중ㆍ저분자 이소플라본- 베타디글루칸을 분리 정제하는 단계 ; 를 포함한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 아가리쿠스 버섯균사체의 액체배양물을 이용하여 생성된 중ㆍ저분자 이소플라본-베타디글루칸은, 상기 제조방법에 의하여 제조된다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 아가리쿠스 버섯균사체의 액체배양물을 이용하여 생성된 중ㆍ저분자 이소플라본- 베타디글루칸은 항암 및 면역증진을 용도로 한다.

이하 본 발명의 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물을 이용하여 생성된 이소플라본-베타디글루칸의 제조방법을 보다 구체적으로 설명한다.

도1 은 본 발명인 아가리쿠스 버섯균사체 배양물을 이용하여 생성된 중ㆍ저분자 이소플라본- 베타디글루칸의 제조방법의 과정을 전체적으로 도시한 것이다.

도 1 에 도시된 바와 같이, 본 발명은 고분자 이소플라본- 베타디글루칸을 제조하는 단계(1)를 포함한다.

상기 이소플라본을 함유하는 배지에 액체배양하는 버섯균사체는 아가리쿠스 버섯균사체를 사용하는 것을 특징으로 한다. 이는 아가리쿠스, 느타리, 표고, 상황,영지버섯 균주 등을 액체배양하여 일정 조건하에 점도(비스코스티 viscosity) 변화를 측정하여 점도가 가장 많이 낮아지는 균주를 자가분해효소활성의 지표로 하였을 때, 아래와 같은 실험 결과, 자가분해효소활성이 가장 높은 균주로서 아가리쿠스가 선택되었다.

[실험예 1]

- 자가분해효소 생성 버섯균주의 선택 -

표 1은 아가리쿠스, 느타리(여름), 먹물, 표고, 상황, 영지버섯 균주 등을 3일간 액체배양한 다음 (배양조건: 25℃, 1 v/v/m airation), 그 배양액(10 ㎖)과 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물, 느타리 버섯균사체 배양물로부터 추출된 고분자다당체를 80 % 에탄올로 처리한 것(이하 '80EP'라 칭함)을 삼각플라스크(50 ㎖)에 넣고 예비실험에서 선발된 온도인 53 ℃와 63 ℃의 배양기(인큐베이터)에서 5시간 동안 반응시킨 다음 점도 변화를 측정한 결과이다.

자가분해효소 생성이 활발한 균주를 선발한 결과 아가리쿠스의 점도변화(△점도/시간)가 3,470 ml/sec로 가장 높았으며, 느타리가 120 ml/sec, 먹물이 104 ml/sec의 순으로 다른 버섯균에 비해 아가리쿠스 버섯균사체가 가장 우수한 자가분해능을 보였다.

	점도(viscosity)(ml/sec)
	0 hr	5hr	△vis/hr
아가리쿠스	18,850	1,500	3,470
느타리	1,250	650	120
먹물	1,310	790	104
표고	1,120	970	30
상황	1,570	1,100	90
영지	1,750	1,210	108

다음 과정으로, 아가리쿠스 버섯균사체를 이소플라본을 함유하는 배지에 액체배양한다.

버섯과 같은 담자균류로부터 항암성 다당류를 얻는 방법으로는 자실체 , 고체배양된 균사체, 액체배양된 균사체로부터 추출하는 방법이 있다.

고체배양의 경우는 배양기간이 길고 항암성 다당류의 추출공정이 복잡하며, 자실체로부터 항암성 다당체를 추출할 경우, 추출되는 다당체의 함량이 적어 수율이 낮은 문제점이 있어 대량생산이 어려운 실정이다.

반면에 액체배양법은 배양기간 짧고, 항상 일정한 조건에서 배양이 가능하여 다당체의 함량이 균일한 균사체를 대량으로 얻을 수 있고, 따라서, 고체배양보다 낮은 비용으로 생산할 수 있기 때문에, 본 발명은 액체배양법을 이용하며 특히 이소플라본을 함유하는 배지에 액체배양한다.

상기 이소플라본을 함유하는 배지는 대두, 대두박을 포함하는 천연식물성 소재가 될 수 있고, 이들로부터 분리된 이소플라본 또는 합성 이소플라본을 함유하는 배지를 모두 사용할 수 있다.

상기 이소플라본을 함유하는 배지는 탄소원으로 황백당과 무기염을 첨가하고 고압멸균하여 액체배지를 제조한다.

아가리쿠스 버섯균사체를 상기 이소플라본을 함유하는 액체배지에 접종한 다음, 진탕 또는 폭기하여 1~7 일동안 배양하면 액체배양물 내에 고분자 이소플라본-베타디글루칸을 생성시킬 수 있다. 여기서, 상기 고분자 이소플라본-베타디글루칸은 분자량 3 만 이상을 갖는다.

본 발명에 의한 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물을 이용하여 생성된 이소플라본-베타디글루칸의 제조방법은 도 1에 도시된 바와 같이, 상기 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물로부터 상기 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물로부터 상기 고분자 이소플라본-베타디글루콘을 분리하는 단계(2)를 포함한다.

먼저, 상기 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물을 열수추출한다. 상기 열수추출법은 균사체 배양물을 100 ℃에서 10시간 동안 가열추출한 다음, 121 ℃에서 1시간동안 고압멸균하는 방법으로 행한다.

상기 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물의 열수추출액을 에탄올(EtOH)농도를 10~ 80 % 별로 농도별로 분획하여 처리한 후 용액을 침전시킨다. 원심분리하여 상등액을 제거하고 침전물을 분리하면 이소플라본을 결합된 분자량 10 만 이상의 고분자 베타디글루칸을 함유하는 침전물을 분리할 수 있다.

상기 에탄올 처리는 80 % 에탄올로 처리하는 것을 특징으로 하는데 80 % 에탄올 처리인 경우에 그 함량이 가장 높았기 때문이다. 후술하는 자가분해효소의 처리는 < 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물에 80 % 에탄올로 처리하여 생성된 고분자 이소플라본-베타디글루칸> (이하 '80EP'라 칭함)에 처리하도록 한다.

[실험예 2]

- 가장 함량이 높은 분획의 채택 : 80EP -

(1)실험과정

상기 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물의 열수추출액을 에탄올 농도별로 분획하여 침전물을 분리하고, 각 분리된 침전물을 바이오셉 에스-2000 칼럼(Biosep S-2000 column)을 사용하여 분리하였다.

(2)실험결과

도 2는 가로축은 시간(min), 세로축은 길이(mAU)를 나타내며, 상단부터 차례로 40, 50, 60, 70, 80 %로 에탄올을 처리한 침전물을 바이오셉 에스-2000로 분리한 것을 각각 도시한 것이다. 최하단 오른쪽은 아가리쿠스버섯균사체 액체배양물 원액의 경우를 도시한 것이다.

도 2에 도시된 바와 같이, 70EP (70 % 에탄올로 처리하여 생성된 고분자 이소플라본-베타디글루칸. 이하 '70EP'라 칭함)와 80EP에서 거의 유사한 크로마토그램 패턴(RT 2.2 와 3)을 나타내었으나, 80EP에서 알티(RT:Rentention time, 이하 'RT'라 칭함) 3 피크가 RT 2.2 피크보다 컸었으나 70EP 에서는 두 피크가 거의 비슷하였다. 다른 농도의 경우에는 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물 원액에 함유되어 있는 것과 유사하였다.(RT 2.2, 3, 3.6 peak)

따라서, 80EP 에는 추출량의 함량이 다른 EP(에탄올로 처리하여 생성된 고분자 이소플라본-베타디글루칸(ethanol precipitate), 이하 'EP'라 한다.)에 비해 많음은 물론 불필요한 피크(RT 3.6,다른 EP에는 발견됨)를 무시할 수 있어 80EP 를 대상으로 할 때 궁극적으로 본 발명의 이소플라본-베타디글루칸의 수득률을 높일 수 있다.

본 발명에 의한 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물을 이용하여 생성된 이소플라본-베타디글루칸의 제조방법은, 도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명은 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물로부터 자가분해효소를 분리하는 단계(3)를 포함한다.

본 발명은 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물을 이용하여 추출되는 고분자 베타디글루칸을 체내 흡수가 용이하게 하기 위해 중ㆍ저분자 베타디글루칸으로 제조하는 것이 목적인데, 중ㆍ저분자 베타디글루칸으로 분해하는 가수분해효소를 아가리쿠스 버섯균사체 자체가 분비하는 자가분해효소로 하고, 특히 본 자가분해효소의 최적 활성조건에서 반응시키는 것을 특징으로 하는 바, 종래에 가수분해효소의 적절한 선택의 어려움을 해결한 것이다. 다양한 버섯균주 중 아가리쿠스 버섯균사체를 채택한 것은 바로 앞서본 바와 같이 아가리쿠스 자가분해효소 활성이 가장 높은 버섯균주이기 때문이다.

상기 자가분해효소의 분리는 상기 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물을 감압여과하여 여액에 최종농도가 10 %가 되도록 트라이클로로아세틱 액시드 (trichloroacetic acid, 이하 'TCA'라 한다.)를 혼합하여 4 ℃에서 24시간 방치한 다음, 원심분리(10,000 rpm, 15 min, 4 ℃)하여 침전물을 분리하여 수행할 수 있다.

[실험예 3]

-자가분해효소의 UV스펙트럼 측정-

도 3은 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물을 10 % TCA용액으로 침전시키고 그 침전물을 디에틸아미노에틸(diethylaminoethyl ,이하 'DEAE'라 한다.)칼럼 크로마토그래피로 분획하여 UV(280nm)스펙트럼이다.

도 3의 가로축은 각 분획물의 번호, 세로축은 각각의 분획물에 대하여 280nm에서의 흡광도를 나타낸 것이다.

분획물의 모니터링을 UV(280nm)에서 수행한 결과 8개의 피크를 얻었다. 두 번째 피크인 8번 분획물이 UV 280nm에서 가장 높은 흡광도를 나타내었는바, 상기 280nm 에서 최대흡광을 보이는 분획물(이하 '튜브 #8'이라 칭함)을 도 1의 (2)단계에서 분리한 80EP에 처리하여 후술하는 중ㆍ저분자 이소플라본 베타디글루칸을 생성하는데 사용한다.

도 4는 상기 튜브 #8 의 UV 스펙트럼(225∼445nm)을 도시한 것이다. 가로축은 파장, 세로축은 흡광도를 나타낸 것이며, 좌측칸에는 파장 대 흡광도를 구체적인 수치로 나타낸 것이다. 도 4에서 볼수 있듯이, 최고 흡광도는 270nm에서 나타났다.

[실험예 4]

-자가분해효소활성 확인-

자가분해효소의 활성을 확인하기 위하여 자가분해효소가 함유되어 있는 것으로 추정되는 DEAE 칼럼 크로마토그래피 분획물을 80EP에 처리한 다음, 티에스케이칼럼(이하 'TSK칼럼'으로 칭함)(이동상:H₂O), C18칼럼(이동상:메탄올(MeOH):1mM 암모늄 아세테이트(ammonium acetate 6:4))을 사용하여 고분자 베타디글루칸이 중ㆍ저분자 베타디글루칸으로 변하였음을 확인하였다. 이때, 유속은 모두 1ml/min이었으며, 피크의 검출은 이소플라본을 확인하기 위해서 UV 257mm, 267mm을 사용하였으며, 베타디글루칸을 확인하기 위해서 RI 검출기(detector)를 사용하였다.

[실험예 5]

- 자가분해효소의 분자량 측정 -

(1)실험내용

상기 튜브 #8 이 자가분해활성 시험에서 가장 높은 활성을 나타내었는바, 이하 여기에 함유된 프로틴(protein)의 분자량을 에스디에스-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,이하 'SDS-PAGE'라 칭함)으로 측정하였다.

(2)실험과정

자가분해효소가 함유되어 있는 DEAE 칼럼 크로마토그래피 분획물(튜브 #8)로부터 용매를 제거한 후 소량의 SDS-PAGE 샘플 버퍼로 녹인 후 램리(Laemmli)의 방법에 따라 12 % SDS-PAGE에서 전기영동하였다.

분자량표준단백질로는 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase) (175KDa), 파라묘신(Paramyosin)(83KDa),글루타민 디하이드로제나아제(Glutamic dehydrogenase) (62KDa),알도라아제(Aldolase)(48KDa),트리오제포스페이트 이소머라아제 (Triosephosphate isomerase)(33KDa), 베타-락토글로뷸린 에이( β-Lactoglobulin A) (25KDa), 리소자임( Lysozyme)(17KDa), 아프로디닌(Aprotinin)(7KDa)을 이용하였다.

(3)실험결과

도 5는 상기 튜브 #8과 #14의 SDS-PAGE 패턴을 도시한 것이다. 가로축의 SM(크기 표지,size marker,이하 'SM'이라 한다.)은 상기 분자량 표준 단백질의 분자량크기의 기준표지이며, 세로축은 분자량 크기를 나타낸다.

도 5 에 도시된 바와 같이, 튜브 #8의 분자량은 세로축 하단의 7KDa 에서 짙은 색을 나타내는바, 자가분해효소의 분자량은 대략 7KDa 임을 알 수 있다.

본 발명에 의한 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물을 이용하여 생성된 이소플라본-베타디글루칸의 제조방법은, 도 1 에 도시된 바와 같이, 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물로부터 분리한 자가분해효소를 상기 고분자 이소플라본-베타디글루칸에 반응시켜 중ㆍ저분자 이소플라본-베타디글루칸을 생성하는 단계(4)를 포함한다.

상기 80 % 에탄올로 처리한 고분자 이소플라본- 베타디글루칸(80EP)을 pH 5.5로 조정한 다음, 상기 DEAE 칼럼으로부터 분리된 자가분해효소를 10ml 가하여 53℃에서 1시간 반응시켜 가수분해시킴으로써 중ㆍ저분자 이소플라본-베타디글루칸을 생성한다. 여기서, 상기 중ㆍ저분자 이소플라본-베타디글루칸은 분자량 3만 미만의 분자량을 갖는다.

후술하는 자가분해효소의 최적 활성 조건은 pH 4.5 또는 5.5, 53℃, 3시간 반응으로 나타났지만, 점도의 변화는 3시간 반응이 최적이었으나, 고분자 중ㆍ저분자 생성에 미치는 효과는 1 시간과 3 시간 반응에 큰 차이가 없기 때문에 1시간 반응으로도 거의 동일한 결과를 얻을 수 있다.

[실험예 6]

- 자가분해효소의 활성화 최적조건 -

(1)실험과정

아가리쿠스 버섯균사체배양물 자체의 자가분해효소 활성화(activation) 최적조건을 구하기 위해 아가리쿠스 버섯균사체 배양물과 상기 80EP를 1, 3, 5, 15, 24시간의 반응시간별로 반응온도 53℃, 63℃의 반응온도에서 반응 pH 4.5, 5.5, 6.5, 7.5의 조건에서 배양하고 점도의 변화를 측정하였다.

(2)실험결과

표 2는 아가리쿠스 버섯균사체 배양물의 점도 변화결과이다.

실험 결과, 아가리쿠스 버섯균사체 배양물의 자가분해효소 활성은 배양물의 pH 4.5 ~5.5, 53℃에서 3시간 동안 반응하였을 때가 최적이었다.

표 2 에 나타나 있는 바와 같이, 동일한 조건에서 아가리쿠스버섯균사체 배양물은 3시간 반응 (pH 4.5, 53℃)으로 비스코스티를 18,750에서 1,500으로 12.5배 감소시켰다.

실험결과를 통하여 자가분해효소는 pH 4.5~ 5.5 , 53℃에서 3시간 반응할 때 가장 활성화되는 것을 알 수 있다.

반응시간 온도 pH	53℃								63℃
	4.5		5.5		6.5		7.5		4.5	5.5	6.5	7.5
0	18,750		18,850		19,300		19,750		18,750	18,850	19,300	19,750
1	16,250		16,950		17,700		16,500		17,250	15,750	18,250	16,650
3	1,500		1,500		12,500		2,300		7,750	15,500	16,000	16,500
5	1,500		1,650		6,000		2,050		1,550	3,650	4,300	4,200
15	1,650		1,500		1,650		1,550		1,550	1,500	1,900	1,700
24	1,650		1,650		1,500		1,600		1,500	1,750	1,750	1,750

상기와 같은 실험을 통하여 자가분해효소의 최적 활성 조건을 규명하였으며, 규명된 조건을 바탕으로 하여 전술한 분리된 자가분해효소(튜브 #8)를 고분자 이소플라본-베타디글루칸(80EP)에 반응시켜 중ㆍ저분자 이소플라본- 베타디글루칸을 생성시킬 수 있다.

이하, 상기 중ㆍ저분자 이소플라본-베타디글루칸이 생성되었는지 다음과 같은 실험을 통해 확인하였다.

[실험예 7]

-중ㆍ저분자 이소플라본- 베타디글루칸 생성 확인-

① 박층크로마토그래피(thin-layer chromatography ,이하 'TLC'라 칭함) 분리에 의한 확인

도 6은 자가분해효소를 80EP에 반응시킨 것에 대한 TLC 패턴을 도시한 것이다.

가로축의 DP7은 말토헵타오스(maltoheptaose), DP4은 말도테트라오스 (maltotetraose), DP3은 말토트리오스(maltotriose), DT 5,000은 덱스트란 5,000(dextran 5,000), DT 12,000은 덱스트란 12,000(dextran 12,000), DT 25,000은 덱스트란 25,000(dextran 25,000) , P + 80% 에탄올은 80EP에 자가분해효소 처리한 것,80% 에탄올은 자가분해효소 처리하지 않은 80EP를 나타낸다. 세로축은 알에프(Rf)로서 크로마토그램에서 물질의 분리를 나타내는 단위이다.

유리 당 또는 고분자 당은 UV 흡광도를 갖지 않는 물질이다. 따라서 TLC로 분리된 구역이 UV 흡광도만 갖는 물질인지, 당 화합물인지, 아니면 UV흡광도를 갖는 당화합물 (당과 UV를 흡수할 수 있는 물질의 복합물) 인지를 조사하기 위해, TLC로 분리된 밴드를 UV 램프로도 확인하였고, 디페닐아민 아리딘 포스페이트 (diphenylamine aridine phosphate,이하' DAP'이라 칭함)로 발색(당확인 발색물)하여 확인하였다.

도 6에서 보는 바와 같이 사용된 TLC system에서는 저분자 다당체 (DP 7이하)는 이동하였지만, 중분자 다당체 (MW가 5,000) 이상의 다당체는 이동을 하지 않았다. 그러나, 자가분해효소로 처리된 고분자 다당체에는 DAP로 발색되는 저분자 당 (DP 3 이하)과 DAP에 발색이 되면서 UV 흡광도를 갖는 물질이 혼합되어 있었다.

특히 전혀 이동을 하지 않았는 중분자 이상의 다당체도 UV 흡광도를 갖고 있었고, DP 7 정도의 당 화합물도 UV 흡광도를 갖고 있었다. 또한 여기에는 UV 흡광도만 갖는 물질도 함유되어 있었다.

이와 같은 결과는 자가분해에 의해 고분자다당체가 중저분자로 전환됨을 알 수 있었으며, 이들 분자에는 당 이외에 UV흡광도를 갖는 물질이 결합되어 있음을 의미한다.

② 고성능 액체 크로마토그래프법 ( high performance liquid chromatography ,이하 'HPLC'라 칭함)에 의한 분리

도 7a,도7b는 80EP에 HPLC (TSK column)로부터 분리한 분획 (자가분해효소)을 반응시켜 반응물에 함유되어 있는 분해물을 HPLC로 분석한 것을 도시한 것이다.

가로축은 시간(min), 세로축은 길이(mAU)를 나타내며, 좌측은 분획물 #2, #8, #14, #25, #35, #65, #83 에 80EP를 반응시킨 후의 HPLC 크로마토그램이며, 우측은 각 분획물 자체의 HPLC 크로마토그램이다.

최상단의 80EP의 크로마토그램을 보면 4개의 피크를 함유하고 있는 것을 볼 수 있다. 그러나 자가분해효소를 DEAE 크로마토그래피(도 3)로 분리한 각 분획물을 HPLC로 확인 한 다음 80EP와 반응시켰을 때, 튜브 #8 분획에 의해서는 원래의 80EP의 4개의 피크가 전혀 다른 양상으로 나타난 것으로 보아 새로운 물질이 생성된 것으로 볼 수 있다. 반면에 다른 분획에 의해서는 자가분해효소를 반응시키지 않은 80EP자체의 피크의 양상이 거의 그대로 유지된 것으로 보아 분해되지 않은 것을 알 수 있다.

즉, 80EP에 튜브 #8 분획을 반응시켰을때, 80EP에 함유된 고분자다당체가 중·저분자 다당체(분자량 약 30,000 ~ 9,000)로 분해되었음을 확인할 수 있다.

80EP에 자가분해효소(튜브 #8)를 처리한 분해물을 HPLC로 분리하면서 UV와 RI 검출기로 동시에 모니터링하였다.

도 8의 좌측 A 패널은 RI 검출결과, 우측 B패널은 UV 검출결과(267nm)를 도시한 것이다.

도 8에 도시된 바와 같이, RT 8.8피크만 UV와 RI 검출 양쪽에 모두 반응이 있었고, 다른 피크는 UV 흡광도를 갖거나 RI 검출에만 반응을 갖는 것을 볼 수 있다.

따라서, RT 8.8 피크의 반응양상으로 보아 다당체가 다른 물질(UV흡광도를 갖는 물질)과 결합하고 있다는 사실을 확인할 수 있으며, 이 물질은 UV흡광도를 갖는 물질인 이소플라본을 의미한다.

[실험예 8]

- 중ㆍ저분자 이소플라본- 베타디글루칸의 생성이 가수분해효소에 의한 것인지의 확인 -

① 80 EP의 차이

중·저분자 이소플라폰- 베타디글루칸이 아가리쿠스 버섯균사체를 배양하는 중 자가분해효소의 작용을 받아서 생성된 것임을 입증하기 위한 실험이다.

배지의 일부 구성분인 대두박(이하 'SP'라 칭함)을 에탄올농도 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 %)별로 분획하여 침전물을 분리하였다.

그 결과, SP 분해물은 10 ∼ 60 % 에탄올에 의해 형성되는 침전물은 거의 없었고, 70EP에서 가장 많은 침전물이 형성되었고 80EP는 소량이었다.

따라서, 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물로부터 유래한 침전물은 80EP에서 가장 많았기 때문에 이 침전물에 함유된 물질은 SP에 함유되어 있던 물질이 아니라 아카리쿠스버섯 균사체를 배양하는 과정에서 생성된 생물학적 전환(bioconversion)된 물질임을 짐작할 수 있다.

② TLC에 의한 확인

도 9는 배지원료로 사용된 SP와 이의 산 가수분해물(이하 'SPH'라 칭함)을 TLC로 분리한 후 그 패턴을 도시한 것이다.

가로축의 AP는 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물로부터 얻은 80EP를 다시 80% 에탄올로 처리한 침전물, APH는 AP를 산 가수분해한 것, AS는 상기 80EP의 상등액, ASH는 AS를 가수분해한 것, SP는 중간 구성성분, SPH는 SP를 가수분해한 것을 나타내며, G, D 및 GT를 표지로 사용하였다. 여기서 G는 게니스테인,D는 다이드자인,GT는 게니스타인 표준폼이며,세로축은 이들 각각에 대한 알에프를 나타낸다.

SP로부터 얻은 모든 시료에는 UV만 흡광도를 갖는 물질 (RF 0.999, 0.542, 0.306)만 확인되었고 (특히 G 및 D 등), UV lamp와 DAP에서 동시에 반응하는 물질은 분리되지 않았다.

따라서, SP에서는 UV 흡광도만 갖는 물질이 배양액으로 공급됨을 알 수 있었다. 그러나, AP로부터 얻은 분획물에서는 UV와 DAP에서 동시에 반응하는 물질 (Rf 0.542, 0.014)이 있었다.

따라서, 이들 물질은 원료에 함유된 물질이 아니라 배양과정 중에서 원료의 성분이 효소에 의해 생물학적 변환(bioconversion) 되었다는 사실을 알 수 있다.

도 10은 이들 분리된 물질에 대한 UV 스펙트럼 결과를 도시한 것이며, 도 11a, 11b, 11c은 IR 스펙트럼 결과를 도시한 것이다.

이들 스펙트럼은 모두 G나 D의 스펙트럼과 아주 유사하였다.

따라서 이들의 물질은 모두 G나 D의 글리코사이드(glycoside)임을 알 수 있었다. 따라서 이들은 배양 중 효소에 의해 생물학적전환(bioconversion)이 되었음을 알 수 있었다.

상기 실험예 7,8 에 의하여 고분자 베타디글루칸이 중저분자 베타디글루칸으로 분해되었고, 그 분해가 자가분해효소에 의한 것이며, 또한 중저분자 베타디글루칸으로만 구성되는 것이 아니라 다당체가 아닌 다른 어떤 물질(이 물질은 후술하는 실험에서 확인)이 결합되어 있는 형태로 생성되었음을 확인하였다.

본 발명에 의한 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물을 이용하여 생성된 이소플라본-베타디글루칸의 제조방법은, 도 1에 도시된 바와 같이 본 발명은 상기 생성된 중ㆍ저분자 이소플라본-베타디글루칸을 분리ㆍ정제하는 단계(5)를 포함한다.

생성된 이소플라본을 함유한 중ㆍ저분자 베타디글루칸을 DEAE 칼럼 크로마토그래피로 분리하고 상기 DEAE 칼럼 크로마토그래피로 분리된 분획물을 진공농축기로 농축시킨 다음, 다시 실리카겔(silicagel)칼럼 크로마토그래피를 사용하여 분리한다.

[실험예 9]

- 중ㆍ저분자 이소플라본-베타디글루칸의 존재의 확인 -

상기 분획물 중에 중ㆍ저분자 이소플라본-베타디글루칸의 존재는 TLC와 HPLC를 사용하여 확인하였다.

① TLC 에 의한 확인

실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 분리된 분획물을 다시 TLC (Silica 60 F-254 플레이트, 5 × 10 ㎝)를 사용하여 분리하였다. 이때 부탄올(Butanol):에탄올( Ethanol):물(H₂O)를 5: 3: 3 (v/v/v)을 전개용매로 사용하였다.

분리된 밴드가 당 화합물임을 확인하기 위해서 DAP으로 발색시켰으며, UV흡광물질의 존재를 확인하기 위해서는 UV lamp(단파)조사하였다.

② HPLC

바이오셉 에스 2000 칼럼(Bio-Sep S2000 column) (이동상; 20mM 소듐 포스페이트), TSK 칼럼(이동상; H2O), C18 칼럼 (이동상; 메탄올(MeOH): 1mM 암모늄 아세테이트(ammonium acetate) 6:4)을 사용하였다. 유속( Flow rate)은 모두 1㎖/min이였다. 이때, 피크의 검출은 UV 257nm, 267nm, 280nm와 RI 검출기를 사용하였다.

[실험예 10]

-최종물질에 이소플라본이 함유되었는지의 확인-

표 3은 최종적으로 분리ㆍ정제된 본 발명의 이소플라본-베타디글루칸(A)과 이소플라본-베타디글루칸을 자가분해효소로 가수분해한 것(B)의 각각의 경우에 유리 게네스테인과 다이드자인의 함량을 비교한 것이다.

	게네스테인(Genestein)	다이드자인(Deidzein)
이소플라본-베타디글루칸(A)	-	-
이소플라본-베타디글루칸의가수분해(B)	150 mg/g 건조함량	28.2 mg/g 건조함량

이소플라본-베타디글루칸(A)과 이소플라본-베타디글루칸을 효소(베타글루코시다아제(β-glucosidase) : 메가자임킷트(Megazyme kit))로 가수분해 시킨 것(B) 각각에 대해서 HPLC로 분석하였다.(C18 칼럼, 이동상 메탄올:1mM 암모늄 아세테이트 =6:4, 유속: 1ml/min)

그 결과, A에서는 유리 게네스테인과 다이드자인이 측정이 되지 않았고, B에서는 게네스테인은 150 mg/g dry weight, 다이드자인은 28.2 mg/g dry weight의 함량을 나타내었다.

이는 본 발명의 최종 산물인 A에서는 이소플라본의 유리형태인 게네스테인과 다이드자인이 검출되지 않았는데 가수분해시킨 후(B)에만 검출된 것으로서, 첫째, 최종산물에 이소플라본이 함유되어 있음을 나타내고, 둘째, 본 발명의 최종산물인 A의 이소플라본과 베타디글루칸은 단순히 혼합된 것이 아니라 배당체로서 존재하는 신물질임을 알 수 있다.

본 발명의 아가리쿠스 버섯균사체의 액체배양물을 이용하여 생성된 항암성 이소프라본-베타디글루칸의 또 하나의 제조방법은 다음과 같다.

도 12에 도시된 (6)단계는 도 1의 (1)단계, 도 12의 (8)단계는 도 1의 (5)단계와 동일한 과정에 의해 이루어진다.

도 12의 (7)단계는 자가분해효소를 분리하여 80EP( 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물로부터 추출액에 80 % 에탄올로 처리한 고분자 이소플라본을 함유한 베타디글루칸)에 처리하는 것이 아니라, 전술한 자가분해효소의 활성 최적조건인 pH 5.5~6.5에서 1~3시간동안 반응시킨 다음 고압가열하여 추출하는 방법으로 이루어진다. 상기 고압가열하여 추출하는 방법은 전술한 도1의 (2)단계에서 행해지는 방법과 동일하다.

본 발명의 상기 제조방법에 의하여 제조된 중ㆍ저분자 이소플라본-베타디글루칸의 분자량과 구조는 다음과 같다.

[실험예 11]

- 중ㆍ저분자 이소플라본- 베타디글루칸의 분자량 측정 -

TSK column이 장착된 HPLC (Dionex사 PDA-100 UV 탐지기와 RI 탐지기, P-680 펌프(pump), ASI-100 프랙션 콜렉터(fraction collector))를 사용하여 분자량을 측정하였다. 이 때의 이동상은 3차 증류수를 사용하였으며, 유속은 1㎖/min이었다.

도 13은 덱스트란(Dextran) 표준폼과 비교하여 로그 스케일(log scale)로 대략의 분자량을 계산한 것으로서 중.저분자 이소플라본- 베타디글루칸의 분자량은 대략 25,000으로 결과가 나왔다.

[실험예 12] - 중.저분자 이소플라본- 베타디글루칸의 구조 -

제조용 HPLC (TSK 칼럼, 이동상; H₂O)을 사용하여 중ㆍ저분자 이소플라본- 베타디글루칸을 다시 분리하고, 그 중에서 항암효과가 가장 큰 피크를 콜렉션 (collection)하여 구성당과 이소플라본(게네스테인,다이드자인), IR , H-NMR, UV 스펙트럼을 분석하였다.

도 14는 상기 실험결과 나타난 IR스펙트럼을 도시한 것이다.

IR 분석에서 특징적인 스펙트럼은 495-656 ㎝-1 (강, 넓음), 1014 ㎝-1 (강,좁음), 1109 ㎝-1 (약,좁음), 1402.0, 1450.8, 1472.7 ㎝-1 (약,넓음), 1642.6 ㎝-1 (강,좁음), 2097.0-2112.0 ㎝-1 (중약,넓음), 2390 ㎝-1 (매우 약,넓음), 2843 ㎝-1 (중,OH 흡수부근에서 좁음 ∼ 3000 ㎝-1), 3173.0-3648 ㎝-1 (OH 흡수 넓음∼ 3000 ㎝-1) 였다.

이것은 표준폼 G나 D의 IR스펙트럼과 비교하였을 때 표준폼이 나타내는 특징적인 작용시의 IR 흡광을 보였다.

도 15는 상기 실험결과 나타난 H-NMR을 도시한 것이다.

도 16는 상기 실험결과 나타난 UV 스펙트럼을 도시한 것이다.

UV는 267 nm에서 최대흡광도를 나타내었는데 이것도 G의 최대흡광도와 동일하였다. 이것으로 미루어 볼 때 RT 8.8 peak는 이소플라본 중 G를 주로 함유하는 베타디글루칸임을 알 수 있다.

[실험예 13]

-구성당 조사-

시료에 소듐 포스페이트 버퍼(buffer) (20mM, pH 6.5) 5 ㎖넣고, 메가자임 킷트(β-glucosidase) (0.2U, 0.1 ㎖)와 리케나아제(licnenase) (10U, 0.2 ㎖)로 분해한 다음, HPLC에서 칼럼 (레족스 알씨엠-모노사카라이드 칼럼 (Rezo RCM -Monosaccharide column), 200 × 10 ㎜)으로 당을 분석하였다.

도 17은 상기 실험결과 RT 8.8의 단당류의 구성을 도시한 것이다.

RT 8.8의구성당을 조사해 본 결과 디-글루코오스(β-D-glucose), 디-프룩토오스(D-fructose), 리보오스(ribose)로 구성당으로 하는 베타디글루칸임을 알 수 있다.

본 발명의 상기 제조방법에 의하여 제조된 중ㆍ저분자 이소플라본- 베타디글루칸은 항암제 및 면역증진제로서 사용된다.

본 발명인 제조방법에 의해 제조되어 분리된 이소플라본-중ㆍ저분자 베타디글루칸은 암세포에 대해 강한 살해효과를 보이는 반면, 일반 세포에는 거의 독성이 없는 것이 특징이다. 본 발명은 이소플라본 함유배지에 아가리쿠스 버섯균사체를 액체배양한 것을 이용한 것으로서 이소플라본의 유리형태에 항암효과가 있는 것을 밝혀진 사실이지만, 본 발명과 같이 이소플라본-베타디글루칸 배당체가 항암효과가 있다는 것은 보고된 바 없다.

이하 본 발명인 제조방법에 의해 제조된 중ㆍ저분자 이소플라본- 베타디글루칸의 항암효과와 면역효과를 실험예를 통해 뒷받침한다.

- 중ㆍ저분자 이소플라본- 베타디글루칸을 함유하는 자가분해물 또는 분리정제된 중ㆍ저분자 이소플라본-베타디글루칸의 항암효과 -

[실험예 14]

- S-180 세포에 대한 독성실험 -

(1)실험

10 ㎎/㎖ 재증류수(double distilled water,이하 'DDW'로 칭함)로 조제한 시료를 다시 둘베코변법이글배지(Dulbecco's modified Eagle's medium , 이하 'DMEM'라 칭함)로 다시 10배 희석하여 처리는 DDW (100 ㎕) + DMEM (900 ㎕), 시료처리는 시료 희석액 (100 ㎕) + DMEM (900 ㎕) 농도가 되게 구성하였다. 미리 배양된 S-180 세포를 1.5×105 세포 /㎖이 되게 희석하여 표5와 같이 3 ㎖ 부피로 처리한 다음 (5×104 cell/㎖ DMEM으로 희석), 처리된 웰 플레이트(well plate)를 5% CO2 배양기(incubator) (37℃)에서 48시간 동안 배양하고 나서 트라이페인 블루(tryphane blue)로 새포를 염색하여 헤마사이토미터 (haemacytometor)로 생세포수를 조사하여 이디50(이하,'ED50'이라 칭함) 값을 구하였다.

(2)결과

표 4는 80EP를 자가분해효소(튜브 #8)로 처리한 시료의 S-180 복수암세포에 대한 세포독성을 조사한 결과를 나타낸 것이다.

48시간 배양 후 대조구의 세포는 23.7×104cell/㎖로 성장하였다. 자가분해한 시료 (자가분해된 AB )는 첨가 농도별 (10, 20, 30 ㎍/㎖)로 각각 7.5, 6.0, 5.5×104cell/㎖로 성장하여 ED50 (㎍/㎖) 값은 0.9였고, 자가분해하지 않은 시료 (AB)는 첨가 농도별(10, 20, 30 ㎍/㎖)로 각각 11.0, 9.5, 8.0×104 세포/㎖로 성장하여 ED50 (㎍/㎖) 값은 2.1이었다.

따라서 자가분해효소를 처리한 시료의 세포독성이 증가하였다.

이것은 자가분해효소에 의해 80EP로부터 암세포에 독성을 나타내는 물질이 생성이 되었다는 것을 의미한다.

	투약량(㎍/㎖)	세포생장(x10⁴세)포/㎖	생장률(%)	ED50((㎍/㎖)
대조구	10	23.7±2.5	100	-
	20
	30
AB	10	7.5 ±0.7	12.95	0.9
	20	6.0 ±0.1	5.18
	30	5.5 ±1.4	2.59
가수분해된 AB	10	11.0± 0.7	31.11	21
	20	9.5 ±1.4	23.32
	30	8.5± 0.7	18.14

[실험예 15]

- 마우스에 대한 항복수암성-

(1) 동물 및 재료

암연구소(Institute for Cancer Research ,이하 'ICR'이라 칭함) 암컷 마우스 (mouse) (6∼7주령)는 '생명과학'(Life Science) (대구)에서, S-180는 '유전자은행' (서울)에서 구입 후 계대 하면서 사용하였다. S-180 배양에 필요한 배지는 지브코 비알엘 (GIBCO BRL)사에서, 그 외 사용된 일반시약은 특급 내지 1급 이상을 사용하였다.

(2) Mouse 항복수암 실험

암컷 마우스(6∼7주령)를 케이지(cage)당 10마리씩 넣었다 (이때, 케이지당 평균무게가 같게 임의적으로 넣는다). 온도와 습도가 조절되는 시설에 물과 음식을 자유롭게 먹도록 하여 1주일 동안 사육하였다. ICR 암컷 마우스 복강에서 계대 배양된 S-180 세포 (1×107 cell/㎖ PBS)을 각 마우스에 0.1 ㎖씩 복강에 주사하여 복수암을 유발하였다. 복수암 유발 후 2일마다 시료 0.1 ㎖을 마우스의 복강에 주사하였다. S-180 세포 복강 투여 후 3일 간격으로 마우스의 무게와 사료 섭취량을 조사하며 40일 동안 생존한 마우스의 수와 생존일수를 기록하였다.

(3)결과

표 5는 S-180 복수암 세포를 ICR 암컷 마우스의 복강에 투여한 1일 후에 시료 (자가분해효소를 처리한 80EP)를 처리한 다음 40일 동안 생존한 마우스의 수와 생존일수를 조사한 것을 표로 나타낸 것이다.

대조구 마우스의 평균수명은 19.2일이었다. 그러나 자가분해 된 80EP 처리구 (AB 자가분해)의 수명은 26.9일로 연장되어 40%의 수명연장효과를 나타내었고 40일까지 3마리가 생존하였다. 자가분해되지 않은 80EP 처리구 (AB)의 수명연장효과는 Control구보다는 강하였지만, AB 자가분해 처리구보다는 약하였다.

트리트먼트	평균생존일수	생존율	생존 마우스
대조구	19.2	100	0/10
AB	22.3	116	0/10
자가분해된 AB	26.9	140	3/10

[실험예 16]

- 인간 암세포주(Human cancer cell lines)에 대한 세포독성 -

(1) 준비 1- 배지조제

DMEM 배지 1봉지를 900 ㎖의 3차 증류수에 넣고 완전히 녹여 페니실린-스트랩토마이신(phenicillin-straptomicin) 1 ㎖를 첨가하였다. 여기에 소듐 바이카보네이트(sodium bicarbonate) (2 g)를 첨가하고 페이탈 보바인 세럼(fetal bovine serum ,이하 'FBS'라 칭함)100 ㎖ 첨가한 후 여과지(0.22 ㎛)로 여과시켜 4℃에 보관하였다.

(2) 준비 2- 전배양

실험 시작 24시간 전에 Human cancer cell lines (MCF-7, 유방암과 헬라세포(breast cencer and Hela), 자궁경부암세포(uterine cervix cencer cell))을 DMEM 배양액 (5% CO2 배양기, 37℃, 24시간)에 계대 배양하였다.

계대 배양된 Human cancer cell lines (MCF-7, breast cencer and Hela, uterine cervix cencer cell)에 트립신-에틸렌디아민테트라 아세틱액시드 (Trypsin-ethylenediamine tetraacetic acid, 이하 'Trypsin-EDTA'라 칭함) 1 ㎖을 처리하여 5% C0₂ 배양기, 37 ℃에 10분 정도 반응시켜 셀이 배지에서 떨어지게 한 다음, 원심분리 (1,500 rpm, 2 min) 하여 셀을 회수한 후, 회수된 셀을 상기 제조한 배지를 12 웰 플레이트에 각각 1 ㎖씩 분주하고 5×104 셀이 되도록 조절하였다.

(3) Human cancer cell line에 대한 세포독성

① Hela cell과 MCF-7 cell

표 6은 80EP를 자가분해효소 (튜브 #8)로 처리하기 전과 후의 인간 암세포주 [헬라 세포(Hela cell: 자궁경부암 세포라인(uterine cervis cancer cell line)]에 대한 세포독성을 조사한 결과를 나타낸 것이다.

헬라 세포는 48시간 배양 후 각 20.1 x 104 cell/ml로 성장하였다. 헬라세포에서 자가분해된 AB 와 AB의 ED50값은 각각 0.9와 5.6 ㎍/ml으로 자가분해된 AB 가 강한 세포독성을 나타내었다.

이 암세포주에 대해 자가분해된 AB 가 AB보다 강한 세포독성을 나타내어 자가분해에 의해 80EP로부터 독성이 강한 물질이 생성되었음을 의미한다.

처리	투약량(㎍/㎖)	세포생장 (x10 세포/㎖)	생장률(%)	ED50(㎍/㎖)
대조구	10	20.1 ±1.1	100	-
	20
	30
AB	10	11.0 ±1.4	36.4	5.6
	20	9.5 ± 1.4	27.2
	30	7.0 ± 0.7	12.1
자가분해된 AB	10	7.0 ± 0.7	18.1	0.9
	20	6.0 ±0.1	15.1
	30	5.5 ± 1.4	3.0

표 7은 상기 헬라세포의 경우와 마찬가지로, 80EP를 자가분해효소 (튜브 #8)로 처리하기 전과 후의 인간 암세포주 MCF-7 세포(유방암세포라인)에 대한 세포독성을 조사한 결과를 나타낸 것이다.

MCF-7 세포는 48시간 배양 후 21.5 x 104 cell/ml로 성장하였다. MCF-7에 대해 자가분해된 AB 와 AB의 ED50 값은 각각 1.2, 5,8 ㎍/㎖으로 헬라세포에 대한 독성과 유사하였다.

처리	투약량(㎍/㎖)	세포생장 (x10 세포/㎖)	생장률(%)	ED50(㎍/㎖)
대조구	10	21.5 ± 2.1	100	-
	20
	30
AB	10	12.0 ±1.4	39.3	5.8
	20	9.5 ± 1.4	27.2
	30	8.0 ±1.4	18.1
자가분해된 AB	10	8.5 ±0.7	21.2	1.2
	20	7.0 ±0.1	18.1
	30	5.5 ±1.4	6.1

② 카코-2(Caco-2)(대장암세포)

인간 암세포주 Caco-2에 대한 자가분해효소(튜브 #8 또는 HPLC에 의해 분획된 자가분해효소.도 5)를 처리한 80EP를 DEAE 칼럼 크로마토그래피로 6 분획(Tube 4, 14, 25, 32, 68, 83)을 얻었다.

도 18은 각 분획에 대해 카코-2에 대한 세포독성을 조사한 것을 도시한 것이다. 그래프의 가로축은 '대조구','베타 -글루칸','#4','#14'등 각 샘플을 표시한 것이며, 세로축은 자가분해효소를 처리한 후의 세포수를 대조구에 대한 퍼센티지로 나타낸 것이다.

도 18에서 볼 수 있듯이, 대조구에 비해, 자가분해효소를 처리하지 않은 80EP는 85.7%의 생존율을 나타내는바, 14%의 세포독성을 나타내었지만, 80EP에 자가분해효소를 처리하여 분리한 분획 튜브 #4과 #14은 각각 약 37%와 33%의 세포독성을 나타내었다. 다른 분획에서도 세포독성은 있었지만 튜브 #4나 #14보다는 약하였다.

이 결과는 앞서 언급한 결과(자가분해효소 처리에 의한 세포독성물질의 생성)를 뒷받침 할 수 있는 자료가 된다.

도 19는 튜브 #8을 농도별로 처리한 결과를 나타내고 있다.

가로축은 '대조구'와 '자가분해효소를 처리하지 않은 80EP'(샘플 A),'자가분해효소를 처리한 80EP'(샘플 B)을 표시한 것이며, 세로축은 세포수를 대조구에 대한 퍼센티지로 나타낸 것이다. 흰 막대의 농도는 1mg ,점무늬 막대는 5mg,검정 막대는 10mg 이다.

자가분해효소를 처리하지 않은 80EP (샘플 A)는 농도가 증가할수록 큰 효과가 없었다. 그러나 자가분해효소를 처리한 80EP을 1, 5, 10 mg 처리하였을 때의 Caco-2에 대한 세포독성은 대조구에 비해 각각 약 2, 23, 42%로 나타났다.

따라서 이 분해물은 세포독성이 강하고, 분해에 의해 세포독성물질이 생성되었음을 의미한다.

본 발명의 이소플라본-중저분자 베타디글루칸은 상기한 항암효과 뿐만 아니라, 면역효과를 동시에 갖는 것을 특징으로 한다. 면역기능은 항암기능과 병행될 때 항암효과를 더욱더 상승시켜 줄 수 있다. 이하 실험예를 통하여 본 발명의 이소플라본-중저분자 베타디글루칸이 가지는 면역효과를 살펴보기로 한다.

[실험예 17]

- 이소플라본-베타디글루칸을 함유하는 자가분해물 또는 분리정제된 이소플라본-베타디글루칸의 면역증진효과 -

(1)동물,재료 및 실험조건

ICR 암컷 마우스 (6∼7주령, 4 마리/우리/군)에서 마우스용 펠렛(pellet) 사료로 1주일 동안 예비 사육하여 체중이 28±1 g인 것을 실험에 사용하였다. 물과 사료는 자유로이 제공하고, 조명은 12시간 간격의 명암사이클 (light-and-dark cycle)을 유지하여 자연조명에 가깝게 하며, 사육실의 온도는 22±1℃, 습도는 50％로 조절하여 사육하였다.

(2)실험내용

시료를 각각 1, 2, 4㎎/g 몸무게/0.2 ㎖ D·W농도로 조제하여 경구를 통하여 강제 투여하였다. 마지막 시료 처리 다음 날 각 마우스의 무게를 달고 리포폴리사카라이드[(lipopolysaccharide, 이하 'LPS'라 칭함) 1 ㎎/㎏ 무균 헤페스(HEPES)]를 마우스의 복강에 주사 하였다. LPS 주사한 직후 신속히 마우스의 몸무게를 조사하였다. 그리고 4, 8, 12, 24, 48시간 경과 후 각각 마우스의 몸무게를 조사하였다.

(3)실험결과

도 20은 LPS를 처리함으로써 ICR 암컷 마우스의 체중을 감량시키는 것에 대해 자가분해효소가 처리된 80EP의 효과를 도시한 것이다.

가로축은 시간,세로축은 체중감량을 나타낸 것이다.

도 20의 (1)은 대조구, (2), (3), (4)는 자가분해된 AZ 처리구를 각각 1 , 2, 4 mg 처리한 것, (5), (6), (7)은 자가분해 처리하지 않은 80EP를 각각 1, 2, 4 mg 처리한 것을 나타낸다.

LPS는 일반적으로는 공유결합으로 결합된 지질과 다당의 복합체인데, 주로 그람음성균의 외막성분으로서 존재하는 내독소의 본체이다. LPS는 여러 가지 생물활성을 나타내기 때문에 내독소(엔도톡신)라고도 불리고, 병원세균의 리포다당은 숙주의 면역계에 의해 감염의 신호로서 인식된다. 따라서, LPS를 처리하여 체중이 감소되는 정도를 관찰함으로써 면역력을 추정할 수 있다.

본 실험에서 LPS를 처리한 마우스는 모두 체중이 감소되었다. 시료를 처리하지 않은 대조구 마우스는 LPS 처리 후 시간이 경과함에 따라 체중이 급격히 감소하여 LPS 처리 24시간 후에는 LPS처리 전보다 2.42 g이 감소하였다.

자가분해된 80EP 처리구(자가분해된 AZ )도 LPS 처리 후 시간이 지나감에 따라 체중이 감소하였지만. 대조구보다는 그 체중감소의 정도가 적었다.

대조구의 경우 체중의 감소가 현저했던 LPS 처리 24시간의 체중 감소정도는 자가분해된 AZ 처리구의 경우 1mg, 2 mg, 4 mg 처리에 대해 각각 -1.77, -1.22 g, -0.75 g으로 체중 변화가 있었다. 즉, 자가분해된 AZ 처리구는 LPS의 효과를 감소시킬 수 있었다.

자가분해를 처리하지 않은 80EP처리구 (80% EtOH)도 처리농도 (1, 2, 4 mg)에 따라 몸무게의 감소를 줄였지만 그 효과는 자가분해된 AZ 처리구보다 낮았다.

이로써 80EP를 자가분해효소로 처리하였을 경우, ICR 암컷 마우스에서 LPS의 효과를 경감시킬 수 있는 물질이 생성되었다는 것을 의미하며 즉, 이소플라본-중저분자 베타디글루칸에 면역효과가 있음을 나타내는 것이다.

이하에서는 본 발명의 아가리쿠스 버섯균사체를 액체배양하여 생성된 이소플라본-베타디글루칸의 제조방법에 대한 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명이 이들 만으로 한정되는 것은 아니다. 각각 실시예는 반복 실시하여 그 결과의 재현성을 확인하였다.

[실시예]

1. 이소플라본을 함유하는 배지에 아가리쿠스 버섯균사체를 액체배양하여 고분자 이소플라본-베타디글루칸(분자량 3만 이상)의 생성

대두(40g) 또는 대두박(40g)을 물에불려 믹서로 충분히 마쇄시킨 후 프로테아제(10g) 및 셀룰라제(10g)를 첨가하여 60C, 200rpm에서 1-5시간 처리하여 효소분해시켰다. 이를 그대로 사용할 수 도 있지만, 천연식물성소재로부터 분리된이소플라본 (이소플라본 함량 10-1000mg) 또는 합성 이소플라본 (10-1000mg)을 첨가할 수 있다. 여기에 탄소원으로 황백당(220g), 리보오스(ribose)(3g)과 무기염 (MgSO4: 10g, KH₂PO₄:10g)을 첨가하여 물을 가하여 1ℓ로 하였다. 이것을 고압멸균(121℃, 1시간)하여 액체배지로 사용하였다. 아가리쿠스버섯균사체를 액체배지에 접종한 후 25-35℃에서 진탕 또는 폭기하여 1-7일 동안 배양하였다.

2. 고분자 이소플라본- 베타디글루칸의 분리

상기배양액을 고압추출(121℃, 1시간)한 다음, 규조토 여과한 여액을 진공농축(10배)한 시료 200 g에 80% 에탄올 용액이 되도록 에탄올을 첨가하고

고루 흔든 다음, 4 ℃에서 24시간동안 방치하여 침전시켰다.

침전물과 상등액을 분리하기 위해서 10,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상등액을 제거한 다음, 분자량 10만 이상의 베타디글루칸을 함유하는 침전물(80EP: 3.8g)을 분리하였다.

3. 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물로부터 자가분해효소의 분리/정제

(1) TCA침전

아가리쿠스 버섯균사체 배양물을 감압여과하여, 여액에 TCA를 혼합 (최종농도가 10 % 되도록)하여 4 ℃에서 24시간 동안 방치한 다음, 원심분리 (10,000 rpm, 15 min, 4 ℃)하여 침전물을 분리하였다.

(2) DEAE column chromatography

상기 침전물을 50mM 소듐 아세테이트 버퍼(pH.5.0)에 녹여 DEAE 칼럼 (2 ㎝, 110 ㎝)에서 분리하여 10 ml씩 수집하였다.

이때 사용된 이동상은 20mM 소듐 포스페이트 버퍼(20mM NaH₂PO₄와 20mM Na₂HPO₄, pH 7.0)이었다.

4. 중ㆍ저분자 이소플라본- 베타디글루칸을 생성하는 단계

전단계에서 제조된 80EP를 pH 5.5로 조정한 다음, DEAE 칼럼으로부터 분리된 자가분해효소 10 ml를 첨가하여, 진동배양기(shaking incubator)에서 반응 (53℃, 1시간)시켰다. 자가분해효소에의해 중·저분자 이소플라본-베타디글루칸 ( 분자량 3만 미만)이 생성되었는지 확인하기위해 TLC 와 HPLC를 사용하여 분리/확인한 실험예는 전술한 바와 같다.

5. 중ㆍ저분자 이소플라본- 베타디글루칸의 분리ㆍ정제

(1) DEAE 칼럼 크로마토그래피

상기 실시예 3에서 제조된 자가분해물 3 ㎖를 5mM 소듐 포스페이트 버퍼 (pH 7.7)가 충진된 DEAE 칼럼 (2 ㎝, 110㎝)에 채운 후 310 드롭(10 ml)씩 수집(collection)하였다. 이때 사용된 이동상 5mM 소듐 포스페이트 버퍼(5mM NaH₂PO₄와 5mM Na₂HPO₄, pH 7.7)으로 하였다.

(2)실리카겔(Silicagel) 칼럼 크로마토그래피

DEAE 칼럼 크로마토그래피에 의해 분리된 분획물을 진공농축기로 농축시킨 다음, 다시 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 분리하였다.

이때 부탄올(Butanol):에탄올( Ethanol): 물(H₂O)를 5: 3: 3 (v/v/v)을 용리제로 사용하였다. 분획물중에 중ㆍ저분자 이소플라본- 베타디글루칸의 존재는 TLC와 HPLC로 확인한 것은 실험예에 서술한 바와 같다.

본 발명은 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물을 이용하여 중ㆍ저분자 이소플라본-베타디글루칸 배당체를 제조하는 방법 및 그 방법에 의하여 제조된 항암 및 면역기능을 가지는 물질로서, 본 발명에 의한 중ㆍ저분자 이소플라본-베타디글루칸의 제조방법에 있어, 아가리쿠스 버섯균사체 자체의 자가분해효소를 이용하여 자가분해효소의 최적활성조건에서 고분자 베타디글로칸을 중ㆍ저분자 베타디글루칸으로 제조함으로써 종래 중ㆍ저분자 베타디글루칸의 제조에 드는 비용 및 시간을 절감시켜 단위시간당 생산량에 있어 우수한 효과를 가지고, 본 발명인 중ㆍ저분자 이소플라본-베타디글루칸은 단순히 혼합되어 있는 형태가 아니라 결합되어 있는 물질로서, 이소플라본, 베타디글루칸 각각이 가지는 항암기능 또는 면역기능을 동시에 갖게 되어, 항암효과를 상승시키는 효과를 나타낸다.

도 1은 본 발명인 중ㆍ저분자 이소플라본-베타디글루칸의 제조공정을 도시한 것이며,

도 2는 아가리쿠스 버섯균사체 액체 배양물에 에탄올 처리한 것에 대한 HPLC크로마토그램을 도시한 것이며,

도 3은 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물의 침전물을 DEAE 칼럼 크로마토그래피로 분획한 후의 UV스펙트럼을 도시한 것이며,

도 4는 튜브 #8의 UV스펙트럼을 도시한 것이며,

도 5는 튜브 #8과 튜브 #14의 SDS-PAGE 패턴을 도시한 것이며,

도 6은 자가분해효소를 80EP에 반응시킨 것에 대한 TLC패턴을 도시한 것이며,

도 7a와 도 7b는 각 분획물에 80 EP를 반응시키기 전과 후의 HPLC 크로마토그램을 도시한 것이며,

도 8은 80EP에 튜브 #8을 처리한 것에 대한 UV와 RI 검출결과를 도시한 것이며,

도 9는 대두박과 이의 산 가수분해물을 TLC로 분리한 후 그 패턴을 도시한 것이며,

도 10은 상기 분리된 물질에 대한 UV스펙트럼을 도시한 것이며,

도 11a,11b,11c는 상기 분리된 물질에 대한 IR스펙트럼을 도시한 것이며,

도 12는 본 발명에 의한 이소플라본-베타디글루칸의 다른 제조방법의 공정도를 도시한 것이며,

도 13은 중ㆍ저분자 이소플라본-베타디글루칸의 분자량을 로그스케일로 도시한 것이며,

도 14는 중ㆍ저분자 이소플라본-베타디글루칸의 IR스펙트럼을 도시한 것이며,

도 15는 중ㆍ저분자 이소플라본-베타디글루칸의 H-NMR 스펙트럼을 도시한 것이며,

도 16은 중ㆍ저분자 이소플라본-베타디글루칸의 UV스펙트럼을 도시한 것이며,

도 17은 중ㆍ저분자 이소플라본-베타디글루칸의 단당류의 구성을 도시한 것이며,

도 18은 각 분획에 대해 카코-2에 대한 세포독성을 나타낸 것이며,

도 19는 튜브#8을 농도별로 처리한 결과를 도시한 것이며,

도 20은 LPS의 처리와 ICR암컷 마우스의 체중감량 관계를 자가분해효소 처리와 관련하여 도시한 것이다.

Claims (9)

1. 이소플라본을 함유하는 배지에 아가리쿠스 버섯균사체를 액체배양하여 고분자 이소플라본-베타디글루칸을 생성하는 단계 ; 상기 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물로부터 상기 고분자 이소플라본-베타디글루칸을 분리하는 단계 ; 별개의 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물로부터 자가분해효소를 분리하는 단계 ; 상기 고분자 이소플라본-베타디글루칸에 상기 자가분해효소를 반응시켜 중ㆍ저분자 이소플라본-베타디글루칸을 생성하는 단계 ; 및 상기 중ㆍ저분자 이소플라본- 베타디글루칸을 분리 정제하는 단계 ; 를 포함하는 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물을 이용하여 생성된 이소플라본-베타디글루칸의 제조방법
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 고분자 이소플라본- 베타디글루칸을 분리하는 단계는 상기 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물의 열수추출액의 농축용액에 에탄올을 처리하는 단계 ; 상기 농축용액에 에탄올을 처리한 용액을 침전시킨 후 원심분리하여 침전물을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물을 이용하여 생성된 이소플라본-베타디글루칸의 제조방법.
3. 제 2 항에 있어서,

   상기 에탄올은 80 %의 농도로 처리하는 것을 특징으로 하는 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물을 이용하여 생성된 이소플라본-베타디글루칸의 제조방법
4. 제 1 항에 있어서,

   상기 중ㆍ저분자 이소플라본- 베타디글루칸을 생성하는 단계는 상기 자가분해효소를 pH 4.5 ~pH 5.5에서 반응시키는 것을 특징으로 하는 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물을 이용하여 생산된 이소플라본-베타디글루칸의 제조방법.
5. 제 1 항에 있어서,

   상기 자가분해효소를 분리하는 단계는 상기 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물을 감압여과하는 단계 ; 상기 감압여과한 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물에 TCA를 혼합하고 원심분리하는 단계 ; 상기 원심분리하여 생긴 침전물을 분리하는 단계 ; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물을 이용하여 생산된 이소플라본-베타디글루칸의 제조방법
6. 이소플라본을 함유하는 배지에 아가리쿠스 버섯균사체를 액체배양하여 고분자 이소플라본-베타디글루칸을 생성하는 단계 ; 상기 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물의 자가분해효소를 활성화시켜 중.저분자 이소플라본- 베타디글루칸을 생성하는 단계 ;및 상기 중ㆍ저분자 이소플라본- 베타디글루칸을 분리ㆍ정제하는 단계 ; 를 포함하는 아가리쿠스 버섯균사체 액체배양물을 이용하여 생산된 이소플라본-베타디글루칸의 제조방법
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 제조방법에 의하여 제조된 이소플라본-베타디글루칸.
8. 제 7 항의 이소플라본-베타디글루칸을 항암제로 사용하는 방법
9. 제 7 항의 이소플라본-베타디글루칸을 면역증진제로 사용하는 방법