JP4090438B2 - アガリクス茸菌糸体液体培養法によって生成されたイソフラボン−β−D−グルカン及びその製造方法ならびにそれを含有する抗癌剤及び免疫増進剤 - Google Patents
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Description
図1に示した通り、本発明は高分子イソフラボン−β−D−グルカンを生成する段階(1)を含む。
表1はアガリクス、平茸(夏)、ササクレヒトヨタケ、椎茸、霊芝茸菌株などを3日間液体培養した後(培養条件:25℃、1v/v/m airation)、その培養液(10ml)とアガリクス茸菌糸体液体培養物、平茸菌糸体培養物から抽出された高分子多糖体を80%エタノールで処理したもの(以下、'80EP'と称する)を三角フラスコ(50ml)に入れ、予備実験で選抜された温度である53℃と63℃の培養器(インキュベータ)で5時間反応させた後粘度変化を測定した結果である。
固体培養の場合は培養期間が長く抗癌性多糖類の抽出工程が複雑であり、子実体から抗癌性多糖体を抽出する場合、抽出される多糖体の含量が少なく、収率が低い問題点があって大量生産が困難な実情である。
(1)実験過程
前記アガリクス茸菌糸体液体培養物の熱水抽出液をエタノール濃度別に分画して沈澱物を分離し、各分離された沈澱物をバイオセップS−2000カラム(Biosep S−2000column)を使って分離した。
図2は、横軸に時間(min)、縦軸に長さ(mAU)をとり、上段から順番に40,50,60,70,80%でエタノールを処理した沈澱物をバイオセップS−2000で分離したことをそれぞれ示した図である。最下段右側はアガリクス茸菌糸体液体培養物原液の場合を示した図である。
図3はアガリクス茸菌糸体液体培養物を10%TCA溶液で沈澱させ、その沈澱物をジエチルアミノエチル(diethylaminoethyl、以下‘DEAE'と称する)カラムクロマトグラフィで分画した後のUV(280nm)スペクトルである。
自家分解酵素の活性を確認するため、自家分解酵素が含有されていると推定されるDEAEカラムクロマトグラフィ分画物を80EPに処理した後、TSKカラム(移動相:H2O)、C18カラム(移動相:メタノール(MeOH):1mMアンモニウムアセテート(ammoniumacetate 6:4))を使って高分子β−D−グルカンが中低分子β−D−グルカンに変ったことを確かめた。このとき、流速は全て1ml/minであり、ピークの検出はイソフラボンを確かめるためにUV257mm,267mmを使用したし、β−D−グルカンを確かめるためにRI検出器(detector)を使用した。
(1)実験内容
前記チューブ#8が自家分解活性試験で最高の活性を示したところ、以下これに含まれたプロチン(protein)の分子量をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(sodium dodecyl sulfate−polyacrylamide gel electrophoresis、以下‘SDS−PAGE'と称する)で測定した。
自家分解酵素が含まれているDEAEカラムクロマトグラフィ分画物(チューブ#8)から溶媒を除去した後少量のSDS−PAGEサンプルバッファで溶かした後、Laemmli法によって12%SDS−PAGEで電気泳動した。
図5は前記チューブ#8と#14のSDS−PAGEパターンを示した図である。横軸のSM(サイズ標識、size marker、以下'SM'と称する)は前記分子量標準タンパク質の分子量サイズの基準標識であり、縦軸は分子量サイズを示す。
(1)実験過程
アガリクス茸菌糸体培養物自体の自家分解酵素活性化(activation)の最適条件を求めるためにアガリクス茸菌糸体培養物と前記80EPを1,3,5,15,24時間の反応時間別に反応温度53℃、63℃の反応温度で反応pH4.5,5.5,6.5,7.5の条件下で培養し粘度の変化を測定した。
表2はアガリクス茸菌糸体培養物の粘度変化結果である。
実験の結果、アガリクス茸菌糸体培養物の自家分解酵素活性は培養物のpH4.5〜5.5、53℃で3時間反応したときが最適であった。
[1]薄層クロマトグラフィ(thin−layer chromatography、以下'TLC'と称する)分離による確認
図6は自家分解酵素を80EPに反応させたものに対するTLCパターンを示した図である。
図7a及び図7bは、80EPにHPLC(TSK column)から分離した分画(自家分解酵素)を反応させ反応物に含有されている分解物をHPLCで分析したものを示した図である。
[1]80EPの差異
中低分子イソフラボン−β−D−グルカンが、アガリクス茸菌糸体を培養する途中に、自家分解酵素の作用を受けて生成されたものであることを立証するための実験である。
図9は培地原料として使用されたSPとその酸加水分解物(以下、'SPH'と称する)をTLCに分離した後そのパターンを示した図である。
従って、これらの物質は全てGやDのグリコサイド(glycoside)であることが分かった。
よってこれらは培養のうち酵素によって生物学的元素転換がなされたことが分かった。
前記分画物中に中低分子イソフラボン−β−D−グルカンの存在はTLCとHPLCを使って確認した。
シリカゲルカラムクロマトグラフィによって分離された分画物を再びTLC(Silica 60F−254プレート、5×10cm)を使用して分離した。このとき、ブタノール(Butanol):エタール(Ethanol):水(H2O)を5:3:3(v/v/v)を展開溶媒として使った。
バイオセップS−2000カラム(移動相;20mM リン酸ナトリウム)、TSKカラム(移動相;H2O)、C18カラム(移動相;メタノール(MeOH):1mMアンモニウムアセテート(ammonium acetate)6:4)を使用した。流速は全て1ml/minであった。このとき、ピークの検出はUV257nm,267nm,280nmとRI検出器を使用した。
表3は、最終的に分離・精製された本発明のイソフラボン−β−D−グルカン(A)とイソフラボン−β−D−グルカンを自家分解酵素で加水分解したもの(B)のそれぞれの場合に、遊離ゲネステインとダイドザインの含量を比較したものである。
TSKカラムが装着されたHPLC(Dionex社PDA−100UV探知機とRI探知機、P−680ポンプ(pump)、ASI−100フラクションコレクタ(fraction collector))を使って分子量を測定した。このときの移動相は3次蒸溜水を使用し、流速は1ml/minであった。
製造用HPLC(TSKカラム、移動相;H2O)を使って中低分子イソフラボン−β−D−グルカンを再び分離し、その中から抗癌効果が最大のピークを収集(collection)して構成糖とイソフラボン(ゲネステイン、ダイドザイン)、IR、H−NMR、UVスペクトルを分析した。
IR分析で特徴的なスペクトルは495−656cm-1(強、広い)、1014cm-1(強、狭い)、1109cm-1(弱、狭い)、1402.0、1450.8、1472.7cm-1(弱、広い)、1642.6cm-1(強、狭い)、2097.0−2112.0cm-1(中弱、広い)、2390cm-1(極弱、広い)、2843cm-1(中、OH吸収付近で狭い〜3000cm-1)、3173.0−3648cm-1(OH吸収広い〜3000cm-1)であった。
これは、標準フォームGやDのIRスペクトルと比較したとき、標準フォームが示す特徴的な作用時のIR吸光を示した。
図16は前記実験の結果、現われたUVスペクトルを示した図である。
UVは267nmで最大吸光度を示したが、これもGの最大吸光度と同一であった。
これより、RT8.8ピークはイソフラボンのうちGを主に含有するβ−D−グルカンであることが分かる。
試料にリン酸ナトリウムバッファ(buffer)(20mM、pH6.5)5mlを入れ、メガザイムキット(β−glucosidase)(0.2U、0.1ml)とリケナーゼ(licnenase)(10U、0.2ml)に分解した後、HPLCでカラム(RezoRCM−Monosaccharide column)、200×10mm)で糖を分析した。
RT8.8の構成糖を調べたところ、β−D−グルコース、D−フルクトース(D−fructose)リボース(ribose)で構成糖とするβ−D−グルカンであることが分かる。
[中低分子イソフラボン−β−D−グルカンを含有する自家分解物または分離精製された中低分子イソフラボン−β−D−グルカンの抗癌効果]
(1)実験
10mg/mlダブル蒸溜水(double distilled water、以下‘DDW'と称する)で調製した試料を再びダルベッコMEM培地(Dulbecco's modified Eagle's medium、以下‘DMEM'と称する)で再び10倍稀釈して処理はDDW(100μl)+DMEM(900μl)、試料処理は試料稀釈液(100μl)+DMEM(900μl)濃度になるよう構成した。予め培養されたS−180細胞を1.5×105細胞/mlになるよう稀釈して、表5のように3ml体積で処理した後(5×104cell/ml DMEMで稀釈)、処理されたウェルプレート(well plate)を5%CO2培養器(incubator)(37℃)で48時間培養してからトリフェインブルー(tryphane blue)で細胞を染色してヘマサイトメーター(haemacytometor)で生細胞数を調べてED50値を求めた。
表4は80EPを自家分解酵素(チューブ#8)で処理した試料のS−180腹水癌細胞に対する細胞毒性を調べた結果を示したものである。
これは自家分解酵素によって80EPから癌細胞に毒性を示す物質が生成されたことを意味する。
(1)動物及び材料
癌研究所(Institute for Cancer Research、以下‘ICR'と称する)雌マウス(mouse)(6〜7週齢)は‘生命科学'(Life Science)(大邱)で、S−180は'遺伝子銀行'(ソウル)で購入して継代しつつ使用した。S−180培養に必要な培地はGIBCO BRL社で、その他使用された一般試薬は特急ないし1級以上を使った。
雌マウス(6〜7週齢)をケージ(cage)当り10匹ずつ入れた(このとき、ケージ当り平均重さが同じくなるよう任意的に入れる)。温度と湿度が調節される施設に水と食べ物を自由に食べさせて1週間飼育した。ICR雌マウス腹腔で継代培養されたS−180細胞(1×107cell/ml PBS)を各マウスに0.1mlずつ腹腔に注射して腹水癌を誘発した。
表5は、S−180腹水癌細胞をICR雌マウスの腹腔に投与した1日後に試料(自家分解酵素を処理した80EP)を処理した後、40日間生存したマウスの数と生存日数を調べたことを示している。
(1)用意1−培地調製
DMEM培地1袋を900mlの3次蒸溜水に入れ完全に溶かしてペニシリン−ストラプトマイシン(phenicillin-straptomicin)1mlを添加した。これに、重炭酸ナトリウム(sodium bicarbonate)(2g)を添加しウシ胎児血清(fetal bovine serum、以下'FBS'と称する)100mlを添加した後濾過紙(0.22μm)でろ過させ4℃に保管した。
実験開始24時間前にヒト癌細胞株 (MCF−7、乳ガンとヘラ細胞(breastcencer and Hela)、子宮頸部癌細胞(uterine cervix cencer cell))をDMEM培養液(5%CO2培養器、37℃、24時間)に継代培養した。
[1]ヘラ細胞(Hela cell)とMCF−7cell
表6は、80EPを自家分解酵素(チューブ#8)で処理する前後のヒト癌細胞株[ヘラ細胞(Hela cell:子宮頸部癌細胞株(uterine cervis cancer cell line)]に対する細胞毒性を調べた結果を示したものである。
ヒト癌細胞株Caco−2に対する自家分解酵素(チューブ#8またはHPLCによって分画された自家分解酵素、図5)を処理した80EPをDEAEカラムクロマトグラフィで6分画(Tube 4,14,25,32,68,83)を得た。
この結果は前述した結果(自家分解酵素処理による細胞毒性物質の生成)を裏付けられる資料になる。
横軸は‘対照群'と‘自家分解酵素を処理しない80EP'(サンプルA)、‘自家分解酵素を処理した80EP'(サンプルB)を示したものであり、縦軸は細胞数を対照群に対するパーセンテージで示したものである。白棒の濃度は1mg、点文様棒は5mg、黒棒は10mgである。
従って、この分解物は細胞毒性が強く、分解によって細胞毒性物質が生成されたことを意味する。
(1)動物、材料及び実験条件
ICR雌マウス(6〜7週齢、4匹/ケージ/群)で、マウス用ペレット(pellet)飼料で1週間予備飼育して、体重が28±1gであるものを実験に使用した。水と飼料は自由に提供し、照明は12時間間隔の明暗サイクル(light−and−dark cycle)を維持して自然照明に近くし、飼育室の温度は22±1℃、湿度は50%に調節して飼育した。
試料をそれぞれ1,2,4mg/g体重/0.2ml D・W濃度で調剤して経口を通して強制に投与した。最後の試料処理の次の日に各マウスの重さを計って、リポポリサッカライド[(lipopolysaccharide、以下‘LPS'と称する)1mg/kg無菌ヘペス(HEPES)]をマウスの腹腔に注射した。LPS注射した直後迅速にマウスの体重を調べた。そして4,8,12,24,48時間経過後それぞれマウスの体重を調べた。
図20は、LPSを処理することによってICR雌マウスの体重を減量させることについて、自家分解酵素が処理された80EPの効果を示した図である。
横軸は時間、縦軸は体重減量を示したものである。
自家分解された80EP処理群(自家分解されたAZ)も、LPS処理後経時的に体重が減少したが、対照群よりはその体重減少の程度が少なかった。
1.イソフラボンを含有する培地にアガリクス茸菌糸体を液体培養して高分子イソフラボン−β−D−グルカン(分子量3万以上)の生成
前記培養液を高圧抽出(121℃、1時間)した後、硅藻土ろ過した濾液を真空濃縮(10倍)した試料200gに80%エタノール溶液になるようエタノールを添加し、均一に振った後、4℃で24時間放置して沈澱させた。
(1)TCA沈澱
アガリクス茸菌糸体培養物を減圧濾過して、濾液にTCAを混合(最終濃度が10%になるよう)して4℃で24時間放置してから、遠心分離(10,000rpm、15min、4℃)して沈澱物を分離した。
前記沈澱物を50mMソジウムアセテートバッファ(pH.5.0)に溶かしてDEAEカラム(2cm、110cm)で分離して10mlずつ収集した。
このとき使われた移動相は、20mMリン酸ナトリウムバッファ(20mM NaH2PO4と20mM Na2HPO4、pH7.0)であった。
前段階で製造された80EPをpH5.5に調整した後、DEAEカラムから分離された自家分解酵素10mlを添加して、振動培養器(shaking incubator)で反応(53℃、1時間)させた。自家分解酵素によって中・低分子イソフラボン−β−D−グルカン(分子量3万未満)が生成されたかを確認するため、TLCとHPLCを使って分離/確認した実験例は前述した通りである。
(1)DEAEカラムクロマトグラフィ
前記実施例3で製造された自家分解物3mlを5mMリン酸ナトリウムバッファ(pH7.7)が充填されたDEAEカラム(2cm,110cm)に充填した後、310ドロップ(10ml)ずつ収集(collection)した。このとき、使われた移動相は、5mMリン酸ナトリウムバッファ(5Mm NaH2PO4と5mM Na2HPO4、pH7.7)にした。
DEAEカラムクロマトグラフィによって分離された分画物を真空濃縮器で濃縮させた後、再びシリカゲルカラムクロマトグラフィを使って分離した。
このとき、ブタノール(Butanol):エタノール(Ethanol):水(H2O)を5:3:3(v/v/v)を溶離剤として使った。分劃物中に中低分子イソフラボン−β−D−グルカンの存在はTLCとHPLCと確認したことは実験例で述べた通りである。
2 高分子イソフラボン−β−D−グルカン分離
3 自家分解酵素分離
4 中低分子イソフラボン−β−D−グルカン生成
5 中低分子イソフラボン−β−D−グルカン分離
6 高分子イソフラボン−β−D−グルカン生成
7 中低分子イソフラボン−β−D−グルカン生成
8 中低分子イソフラボン−β−D−グルカン分離
Claims (7)
- イソフラボンを含有する培地にアガリクス茸菌糸体を液体培養して分子量3万以上の高分子イソフラボン−β−D−グルカンを生成する段階と、前記アガリクス茸菌糸体液体培養物から前記高分子イソフラボン−β−D−グルカンを分離する段階と、別個のアガリクス茸菌糸体液体培養物から自家分解酵素を分離する段階と、前記高分子イソフラボン−β−D−グルカンに前記自家分解酵素を反応させ分子量9,000以上、3万未満の中低分子イソフラボン−β−D−グルカンを生成する段階と、前記中低分子イソフラボン−β−D−グルカンを分離精製する段階とを含むアガリクス茸菌糸体液体培養物を用いて生成されたイソフラボン−β−D−グルカンの製造方法。
- 前記分子量3万以上の高分子イソフラボン−β−D−グルカンを分離する段階は、前記アガリクス茸菌糸体液体培養物の熱水抽出液の濃縮溶液にエタノールを処理する段階と、前記濃縮溶液にエタノールを処理した溶液を沈澱させた後遠心分離して沈澱物を分離する段階とを含むことを特徴とする請求項1に記載のアガリクス茸菌糸体液体培養物を用いて生成されたイソフラボン−β−D−グルカンの製造方法。
- 前記エタノールは80%の濃度で処理することを特徴とする請求項2に記載のアガリクス茸菌糸体液体培養物を用いて生成されたイソフラボン−β−D−グルカンの製造方法。
- 前記分子量9,000以上、3万未満の中低分子イソフラボン−β−D−グルカンを生成する段階は、前記自家分解酵素をpH4.5〜pH5.5で反応させることを特徴とする請求項1に記載のアガリクス茸菌糸体液体培養物を用いて生産されたイソフラボン−β−D−グルカンの製造方法。
- 前記自家分解酵素を分離する段階は、前記アガリクス茸菌糸体液体培養物を減圧ろ過する段階と、該減圧ろ過したアガリクス茸菌糸体液体培養物にTCAを混合し遠心分離する段階と、前記遠心分離してできた沈澱物を分離する段階とを含むことを特徴とする請求項1に記載のアガリクス茸菌糸体液体培養物を用いて生産されたイソフラボン−β−D−グルカンの製造方法。
- イソフラボンを含有する培地にアガリクス茸菌糸体を液体培養して分子量3万以上の高分子イソフラボン−β−D−グルカンを生成する段階と、前記アガリクス茸菌糸体液体培養物の自家分解酵素を活性化させ分子量9,000以上、3万未満の中低分子イソフラボン−β−D−グルカンを生成する段階と、前記中低分子イソフラボン−β−D−グルカンを分離・精製する段階とを含むアガリクス茸菌糸体液体培養物を用いて生産されたイソフラボン−β−D−グルカンの製造方法。
- 請求項1ないし6のうちいずれか1項の製造方法によって製造された分子量9,000以上、3万未満のイソフラボン−β−D−グルカン。
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