FI110324B - Uudet polysakkaridit ja niiden valmistus - Google Patents

Description

1 110324

Uudet polysakkaridit ja niiden valmistus Tämä keksintö koskee uusia polysakkarideja, jotka ovat peräisin nestemäisen viljelmän kasvatusliemestä. Nestemäi-5 nen viljelmä käsittää seoksen, jossa on kasvisolukoita sisältävää kasvatusalustaa ja sukuun Basidiomvcetes kuuluvien mikro-organismien rihmastoa. Uudet polysakkaridit eristetään ja puhdistetaan näistä kasvatusliemistä. Polysakkaridien molekyylipaino on 500 - 10.000 ja ne koostuvat 10 lineaarisesti (1 - >4) liitetyistä ar-D-glukoosiyksiköistä, joiden 2,3-hydroksyyliryhmät ovat osittain asetyloituja, suhteessa noin 30 %.

Viime aikoina syöpien immunologisessa hoidossa on käytetty 15 käsitettä biologisen vasteen muuntajat (biological response modifiers, BRM), mikä viittaa yleisesti aineisiin, joiden odotetaan kontrolloivan potilaan kehon luontaisia puolustusmekanismeja, ts. immuniteettia, ja osoittavan terapeuttista tehoa eri sairauksissa. Tärkeisiin esimerkkeihin 20 BRM:istä kuuluvat bakteereista johdetut aineet, kuten BCG (Bacillus Calmette-Guerin) ja Picibanil, esim. Picibanil .·, OK-432, sienistä johdetut aineet, kuten lentinaani ja .·. : skitsofyllaani, ja synteettiset aineet, kuten pyraanikopo- ^·· lymeerit ja levamisoli. Tyypillisiin esimerkkeihin RBM:is- • » · . 25 tä kuuluu lentinaani, joka on eristetty fysikokemiallises- j*‘j ti erittäin puhdistettuna ja karakterisoitu. Lentinaani on : aine, joka on eristetty Lentinus edodesin itiöemistä. Tämä • · · *·' ‘ yhdiste on glukaani, jonka molekyylipaino on 400.000 - 800.000, ja joka koostuu pääasiassa ketjusta β-D-glu-;t| \ 30 koosiyksiköitä, jotka on liitetty yhteen 3- ja 6- asemista vastaavasti suhteessa 5:2. Mitä tulee biologiseen aktiivi- f.". suuteen, tämän yhdisteen tiedetään stimuloivan luontaisil- le puolustusmekanismeille tärkeiden solujen kypsymistä, erilaistumista ja jakaantumista. Mikä tärkeämpää, ne anta- 110324 vat voimaa syöpiä, infektioita ynnä muita vastaan niin, | että ne ovat tehokkaita tällaisia sairauksia vastaan.

Paitsi edellä mainittu lentinaani, sukuun Basidiomvcetes 5 kuuluvista organismeista on eristetty monia kasvainten vastaisia, immuunivastetta lisääviä yhdisteitä, kuten skitsofyllaani ja grifolaani, joista suurin osa on suuren molekyylipainon omaavia β-l,3-glukaaneja.

10 Raaka-aineiden laadun tutkimuksen ja saannon lisäämisen näkökulmasta tämän keksinnön tavoite on uuttaa ja eristää uusia polysakkarideja, joilla on tehokkaampia immuunivastetta lisääviä kykyjä, nesteviljelmässä kasvatettujen Basidiomvcetes -mikro-organismien viljelmistä.

15 Tämän keksinnön tekijät ovat jo jättäneet patenttihakemuksen, joka koskee menetelmää biologisesti aktiivisen he-miselluloosan valmistamiseksi, jolloin kasvisolukkoa olevaa raaka-ainetta assimiloidaan rihmasienten kasvatusalus-20 tästä (japanilainen patenttihakemus, nähtäväksipanonumero 1-153701). Näitä tutkimuksia on jatkettu, jotta eristet-,·. täisiin aktiivisia yhdisteitä, jotka-osallistuvat fysiolo- : gisen aktiivisuuden olennaiseen mekanismiin. Tämän-tulok- • · > sena on nyt menestyksekkäästi eristetty ja puhdistettu . 25 uusi polysakkaridi, jolla on fysiologista aktiivisuutta • · · ···; (aktiivinen polysakkaridi, tämän jälkeen toisinaan lyhensi : netty "APS") kasvatusalustasta, jossa kasvatetaan sukuun · Basidiomvcetes kuuluvia mikro-organismeja raaka-aineena olevan kasvisolukon läsnäollessa, mikä täten täydentää : : : 3 0 tämän keksinnön.

Näin ollen tämä keksintö saa aikaan: 3 110324 1) Uuden polysakkaridin (APS), joka käsittää (1 - >4)-sidoksin liitettyjä α-D-glykoosiyksiköitä ja jota esittää seuraava kaava, 5 ch2oh ch2oh

OR OR

10 jossa R on vetyatomi tai asetyyliryhmä suhteessa noin 7:3. Seuraavat ovat fysikaalis-kemiallisia ominaisuuksia: (1) luonne: valkoinen amorfinen jauhe, ei makua tai tuoksua, (2) liukoisuus: liukenematon alkoholiin, asetoniin, hek-15 saaniin, bentseeniin, etyyliasetaattiin, tetrakloorime- taaniin, kloroformiin ja eetteriin, ja liukoinen veteen, formamidiin ja dimetyylisulfoksidiin, (3) vesiliuoksen pH: neutraali, (4) sokeriaineosa: ainoastaan glukoosia, 20 (5) molekyylipaino: 500 - 10.000, (6) spesifinen optinen kiertyminen: [a]D(24 °C) = +112° - +116° (vedessä) , ; (7) värireaktio: positiivinen antroni-rikkihapporeaktio, • · · fenoli-rikkihapporeaktio ja kromotrooppinen happo-rikki- . 25 happoreaktio, ja negatiivinen biureettireaktio, Lowry-Fo- • * · “•j lin-reaktio, Elson-Morgan-reaktio ja jodireaktio, *··: · (8) sulamispiste: ei osoita mitää selkeää sulamispistettä, * (9) IR-spektri: absorptio spesifinen asetyyliryhmille, (10) 13C-NMR-spektri: osoittaa signaaleja, jotka ovat spe-: 30 sifisiä a-1,4-glukaanille ja asetyyliryhmille; ja (2) menetelmän edellä kuvatun APS:n valmistamiseksi.

APS, toisin kuin konventionaaliset lentinaani ja skitso-35 fyllaani, käsittää ainoastaan (l->4)-sidoksin liitettyjä 4 110324 α-D-glukoosiyksiköitä, jolloin noin 30 prosentissa 2,3-hydroksyyleistä on asetyyliryhmiä. Polysakkaridin molekyy-lipaino on 500 - 10.000, edullisesti 1.000 - 7.000, määritettynä geelisuodatuspylväskromatografiällä. Polysakkaridi 5 voidaan uuttaa ja eristää kasvatusalustan nesteestä tai seoksesta, ja sukuun Basidiomvcetes kuuluvan mikro-organismin rihmaston nesteviljelmästä kasvisolukoiden läsnäollessa nestemäisessä viljelmässä kasvatusalustan raaka-aineena.

10

Seuraavaksi tätä keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin.

Niihin mikro-organismeihin tai Basidiomvcetes-lai eihin. joita voidaan käyttää tässä keksinnössä, kuuluvat esimer-15 kiksi Lentinus edodes. Aaaricus biscorus. Grifola frondo-sa. Pholiota nameko. Pleurotus ostreatus. Flammulina velu-tioes. Ganoderma lucidum. Auricularia auricula. Ganoderma applanaturn. Coriolus versicolor. Grifola umbellata. Schi-zophvllum commune. Volvariella volvaceae ynnä muut. Niitä 20 voidaan käyttää yksittäin tai yhdistetyissä muodoissa.

Basidiomvcetes-oraanismia voidaan viljellä pääasiassa ta-vanomaisella menetelmällä mikro-organismien kasvattamisek- * · · : si. On kuitenkin edullista käyttää nestemäistä kasva- *:·. 25 tusalustaa ja kasvattaa kohtuullisissa olosuhteissa se- koittaen ja ilmastaen, koska Basidiomvcetes-lai it ovat aerobisia.

• · · "·' Kasvatusalustan raaka-aine käsittää kasvikuituja, kuten 30 leseitä, olkia, riisin leseitä, bagassia, sahanpurua ja ·.· : soijapapu jät että. Spesif isemmin sanottuna yhden tai useam- : : man kasvikuidun uutetta kuuman veden kanssa voidaan käyt- : tää edullisesti.

* · · • · • * * * · » · » · • · 110324 5 i Hiilenlähteinä voidaan käyttää mitä tahansa seuraavista: glukoosi, invertaasi, maltoosi, sakkaroosi, valkosokeri, sokeriruokomelassi, liotusvesi, liotusvesijäte, mallasuut-teet ynnä muut.

5

Typen lähteinä voidaan käyttää lihauutteita, peptonia, gluteenijauhoja, soijapapujauhoa, kuivahiivaa, hiivauut-teita, ammoniumsulfaattia, ammoniumtartraattia, ureaa ynnä muita. Jos halutaan, on myös mahdollista lisätä ravinto-10 alustaan erilaisia lisäaineita, kuten epäorgaanisia suoloja, esim. fosfaatteja, ruokasuolaa (NaCl), magnesiumsuolo-ja, mangaanisuoloja, kalsiumsuoloja, rautasuoloja jne. ja vitamiineja, esim. inositolia, Bl-vitamiinihydrokloridia, L-asparagiinia, biotiinia jne.

15

Olosuhteet edellä mainittujen Basidiomvcetes-mikro-or-ganismien kasvattamiseksi voivat olla samanlaiset kuin keskilämpötiloja vaativille bakteereille. Niitä voidaan viljellä esimerkiksi lämpötilassa 10 - 45 °C, edullisesti 20 15 - 30 °C, 4-20 vuorokautta, edullisesti 6-12 vuoro kautta, pH:Ssa 2-6.

t f : Näin saatuun kasvatusalustan seokseen ja rihmastoon voi- f · 9 ** ·;·, daan lisätä entsyymiä, kuten sellulaasia, amylaasia, pro- * · 25 teaasia, pektinaasia, kitinaasia, jne. Seoksen annetaan Γ’! reagoida 2-20 tuntia optimilämpötilaoloissa rihmaston i t » maseroimiseksi, mitä seuraa kuumennus entsyymin inaktivoi- # 1 1 ’·’ ’ miseksi.

· ; 30 Rihmastojäännös poistetaan näin käsitellystä viljelmästä ί_: : sentrifugoimalla tai samanlaisella erottelutekniikalla.

,···, Sitten supernatantti uutetaan heksaanilla, eetterillä tai kloroformilla, tai eluoidaan veden kanssa pylväskromato-grafialla käyttäen käänteisfaasi-partitiokantajaa, kuten 35 oktadekyylisilaania (ODS (C18), jne.), polystyreenipoh- 110324 6 jäistä polymeeriä (MCI-geeli® CHP-20P (Mitsubishi Chemical) , jne.), hydroksipropyylidekstraanihartsia (Sephadex ® LH-20 (Pharmacia), jne.), ynnä muita lipidien poistamiseksi. Vedellä eluoitu fraktio konsentroidaan ja konsentraat-5 ti liuotetaan sopivaan määrään vettä, ja etanolin lisääminen määränä 3-5 kertaa veden määrä liuoksessa saa aikaan valkoisia saostumia. Esim. sentrifugoimalla kerättyjä saostumia käsitellään ioninvaihtohartsilla tai vastaavalla suolojen, proteiinien jne. poistamiseksi siitä, jotta saa-10 daan neutraali polysakkaridifraktio. Sen jälkeen polysakkaridi fraktio puhdistetaan geelisuodatuskromatografiällä polyakryyliamidihartsilla (Bio-gel ® P-2 (Bio Rad), jne.), dekstraanihartsilla (Sephadex ® G-15 (Pharmacia), jne.), selluloosamatriisilla (Cellulofine (Seikagaku Kogyo)), 15 Toyopearlilla ® (HW-40F (Toso), jne.) tai käyttämällä ult-rasuodatusmembraania.

Tämän keksinnön mukaisilla polysakkarideilla on ominaisuuksia, jotka ovat sopivia biologisen vasteen muuntajille 20 (BRM), ja niitä voidaan käyttää immuunivastetta lisäävänä aineena tai immuuniaktivaattorina.

• · • · • · • · · ” Tämän jälkeen tätä keksintöä kuvataan esimerkein. Tämä i « » ·.· · keksintö ei kuitenkaan rajoitu niihin.

:· 25 • · · · : : : [Valmistus] • < · · 1) Kasvatus: .·. : Lentinus edodesta, jota oli kasvatettu kiinteällä kasva- .···. 30 tusalustalla (1 % maltoosia, 0.2 % peptonia, 0.2 % am- moniumtartraattia ja 1.5 % agaria) lasisella petrimaljal- la, jonka halkaisija oli 90 mm, siirrostettiin 10-litran kasvatuspulloon, joka sisälsi 8 litraa nestemäistä kasva- . .’. tusalustaa (150 g riisin leseitä ja 800 ml vettä kuumen- • * · ,···, 35 nettiin 120 °C:ssa 15 minuutin ajan ja suodatettiin ja • · » · * 7 110324 lisättiin 10 g maltoosia, 2.5 g peptonia ja 2.0 g am-moniumtartraattia yhdessä sopivan määrän vettä kanssa, pH 4.0) . Sisältöä inkuboitiin 20 °C:ssa 7 vuorokautta ilmastaen. Seuraavaksi siirrostettiin 8 litraa viljelmälientä 5 viljelysäiliöön, joka sisälsi 300 litraa nestemäistä kasvatusalustaa, jonka koostumus oli sama kuin edellä esitetty. Kasvatusta jatkettiin 23 °C:ssa 9 vuorokautta ilmastaen ja sekoittaen varovasti.

10 2) Uutto, erottelu ja puhdistus

Kasvatusalustan ja rihmaston seos lämmitettiin 90 °C:seen. Lisättiin 8 g amylaasia ja jatkettiin reaktiota 3 tuntia, minkä jälkeen reaktioseos jäähdytettiin 60 °C:seen. Kun 15 oli lisätty 15 g sellulaasia ja 15 g proteaasia, seoksen annettiin seistä 55 °C:ssa 10 tuntia. Reaktioseosta kuumennettiin vielä 120 °C:ssa 20 minuuttia entsyymien inak-tivoimiseksi.

20 Näin käsitelty kasvatusalusta sentrifugoitiin jäännösrih- . maston poistamiseksi ja supernatantti konsentroitiin alen- '· , netussa paineessa, jotta saatiin 7,5 kg uutetta, joka saa- ” tettiin pylväskromatografiaan, jossa käytettiin MCI-geeliä *·* ‘ ® CHP-20P (Mitshubishi Chemical) kantajana ja deionisoitua 25 vettä eluenttina. Deionisoidun veden kanssa eluoituva * · :.· · fraktio konsentroitiin. Jäännös liuotettiin 1,5 litraan :: : deionisoitua vettä. Sen jälkeen siihen lisättiin 6 litraa etanolia, jotta saatiin valkoiset saostumat. Seos sentri- ;\j fugoitiin ja supernatantti poistettiin. Saostumat liuotet- .···. 30 tiin samalla tavalla deonisoituun veteen ja lisättiin 4- kertainen tilavuus etanolia. Seos sentrifugoitiin ja su- *·’·* pernatantti poistettiin dekantoimalla. Tämä menettely * · * ·...· toistettiin kahdesti. Näin saadut saostumat käsiteltiin : kationinvaihtohartsilla Dowex ® 50w x-8 (H-muoto) (The Dow • * ♦ 35 Chemical Company), se osa konsentroitiin, joka ei adsor- 8 11Ö324 hoitunut ja eluoitui ulos vedellä. Tämä fraktio saatettiin pylväskromatografiaan käyttäen Sephadex ® G-15:ttä (Pharmacia). Se osa, joka eluoitui välisijatilavuudessa, haihdutettiin kuiviin alennetussa paineessa, jotta saatiin 5 600 g haluttua polysakkaridia.

Tuotteen fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet ovat seuraavat: (1) Luonne: valkoinen amorfinen jauhe, ilman makua ja ha- 10 j ua, (2) Liukoisuus: liukenematon alkoholiin, asetoniin, hek- saaniin, bentseeniin, etyyliasetaattiin, tetrakloorime-taaniin, kloroformiin ja eetteriin, ja liukoinen veteen, formamidiin ja dimetyylisulfoksidiin, 15 (3) vesiliuoksen pH: neutraali, (4) sokeriaineosa: yhdisteen 1-prosenttiseen vesiliuokseen lisättiin rikkihappoa konsentraatioon 1 N ja saatua liuosta kuumennettiin 100 °C:ssa 3 tuntia. Reaktioseos neutraloitiin bariumkarbonaatilla ja sentrifugoitiin. Superna-20 tantin ohutkerroskromatografia tehtiin seuraavilla neljällä kehitysliuottimella. Missään tapauksessa ei havaittu ' muuta sokeritäplää kuin glukoosi, osoittaen, että tämä ·.*·: yhdiste on polysakkaridi, joka koostuu yksinomaan glukoo- ·/· ’ sista.

*:* 25 (i) Etyyliasetaatti : metanoli : etikkahappo : vesi = i 65:15:10:10 • * · · (ii) etyyliasetaatti : isopropanoli : vesi = 65:23:12 (iii) n-butanoli : etikkahappo : vesi = 2:1:1 •# . (iv) n-butanoli : pyridiini : vesi = 6:4:3, • · · !..* 30 (5) molekyylipaino: yhdisteen molekyylipainon oletettiin • » olevan 500 - 10.000 eluutiokäyrän perusteella, joka saa- :.v tiin saattamalla näytteet geelisuodatuspylväskromatografi- : : aan (Sephadex ® G-25 ja Sephadex ® G-50, Pharmacia) • · · ]·_ käyttäen standardiaineena dekstraania, jonka !” 35 molekyylipaino oli tunnettu, 9 110324 (6) spesifinen optinen kiertyminen: [a]D(24 °C)=+112° - 116° , (7) värireaktio: yhdisteen täydellisen hydrolyysin tuote oli positiivinen antroni-rikkihapporeaktiossa, fenoli-rik- 5 kihapporeaktiossa ja kromotrooppisessa happo-rikkihappo-reaktiossa, mutta negatiivinen biureettireaktiossa, Lowry-Folin-reaktiossa, Elson-Morgan-reaktiossa ja jodireaktios-sa, (8) sulamispiste: ei osoita selvää sulamispistettä, 10 (9) IR-spektri: absorptio asetyyliryhmien johdosta noin 1740 cm‘l ja (10) 13C-NMR-spektri: 172, 100 - 104, 76 - 78, 72 - 74, 70, 68, 61, 18 ppm.

15 Suurimpina huippuina havaitaan ot-1,4-glukaanille ja ase-tyyliryhmille ominaiset huiput. Lisäksi osa (n. 30 %) glukoosin C-l:n, C-3:n ja C-4:n antamista signaaleista on siirtynyt asetyloinnin johdosta, varmistaen sen, että tämä yhdiste koostuu (l->4)-sidoksin liitetyistä a-D-glukoosi-20 yksiköistä, ja että sitä edustaa seuraava kaava: CH2OH ch2oh

: : 25 OR OR

: jossa R esittää vetyatomia tai ase tyyli ryhmää oleellisesti t t i suhteessa 7:3, ja että yhdiste on uusi polysakkaridi, jonka molekyylipaino on 500 - 10.000.

: .·. 30 • · · ’!!.* [Testiesimerkit] • * • · ·

Seuraavien testien tarkoituksena oli tutkia, onko tämän ·:·*: keksinnön mukaisilla uusilla polysakkarideilla immuunivas- ( « * 110324 10 tetta tehostavan aineen ominaisuuksia (biologisen vasteen muuntajat (BRM)).

Neutrofiilien leukosyyttien kerääntyminen: 5

Fagosyyteillä, kuten neutrofiileillä leukosyyteillä ja makrofaageilla on tärkeä tehtävä elävän kehon homeostaasin ylläpitämisessä. Niillä on suuri määrä tehtäviä, joihin kuuluvat syövän vastaiset tai mikrobien vastaiset vaiku-10 tukset, tulehdus ja vasta-aineiden tuotto, samoin kuin fagosytoosi. Fagosyyteillä on taipumus kulkeutua ja kertyä paikkoihin, joissa on vieraita tekijöitä. Toisin sanoen aineet, jotka ovat vieraita elävän kehon luonteelle, aiheuttavat fagosyyttien kertymistä. Immuunivastetta tehostava 15 aine (biologisen vasteen muuntaja (BRM)), on tyypillinen esimerkki niistä, se ohjaa sisäistä puolustusmekanismia yllä pitäviä fagosyyttejä paikallisiin kohtiin, jonne sitä oh laitettu tai annosteltu, niin että fagosyytit kertyvät näihin kohtiin. Fagosyyttien lukumäärän kasvu indusoi 20 luontaisen puolustuksen tehostumista. Siispä on ymmärrettävää, että fagosyyttejä paikallisiin kohtiin ohjaavilla aineilla on ominaisuuksia, jotka ovat samanlaisia kuin immunologisilla tehostinaineilla (BRM:n kaltaiset aineet) . Hyödyntämällä tätä ilmiötä tehtiin testejä sen tutkimisek-25 si, tehostavatko uudet polysakkaridit (APS) luontaista « i · puolustusmekanismia.

110324 11 kaan leviämisen niin, että neutrofiilien leukosyyttien osuus oli 63 % vatsan soluista. Esimerkissä saadulla APS-! aineella oli voimakas neutrofiilejä leukosyyttejä keräävä aktiivisuus, joka oli 75 %; suurempi kuin tunnetulla 5 BRM:llä.

näyte annos kertyneiden neutrofiilien suhteell. osuus fysiol. suola- 1 ml/hiiri 2 % 10 liuos lentinaani 1 mg/hiiri 63 % APS-aine 1 mg/hiiri 75 % * t » i > · * > · 1

t I

Claims (7)

110324 12

1. Uusi polysakkaridi, tunnettu siitä, että se käsittää (1->4)-sidoksin liitettyjä a-D-glukoosiyksiköitä, 5 ja että sitä esittää seuraava kaava: CH2OH ch2oh

10 OR OR jossa R on vetyatomi tai asetyyliryhmä, joiden suhde on noin 7:3 mainitussa polysakkaridissa, jolla on seuraavat 15 ominaisuudet: | (1) luonne: valkoinen amorfinen jauhe, ei makua tai tuok sua, (2-) liukoisuus: liukenematon alkoholiin, asetoniin, hek- saaniin, bentseeniin, etyyliasetaattiin, tetrakloorime- 20 taaniin, kloroformiin ja eetteriin, ja liukoinen veteen, formamidiin ja dimetyylisulfoksidiin, (3) vesiliuoksen pH: neutraali, = ·*.' (4) sokeriaineosa: ainoastaan glukoosi, * · (5) molekyylipaino: 500 - 10.000, ! ·’ 25 (6) spesifinen optinen kiertyminen: [a]D(24 °c) = +112° - +ii6°, i (7) värireaktio: positiivinen antroni-rikkihapporeaktio, fenoli-rikkihapporeaktio ja kromotrooppinen happo-rikki-happoreaktio, ja negatiivinen biureettireaktio, Lowry-Fo-. . 30 lin-reaktio, Elson-Morgan-reaktio ja jodireaktio, \W (8) sulamispiste: ei osoita mitään selkeää sulamispistet tä, : : (9) IR-spektri: absorptio spesifinen asetyyliryhmille, ja ·:*·· (10) 13C-NMR-spektri: osoittaa signaaleja, jotka ovat omi- 35 naisia a-1,4-glukaanille ja asetyyliryhmille. 13 110324

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polysakkaridi, tunnettu siitä, että se uutetaan ja eristetään kasvatusalustasta, jossa viljellään sukuun Basidiomvcetes kuuluvaa mikro-organismia raaka-aineena olevan kasvisolukon 5 ollessa läsnä.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen polysakkaridi, tunnettu siitä, että mainittu raaka-aineena oleva kas-visplukko on yhtä tai useampaa kasvikuitua, jotka valitaan 10 joukosta, johon kuuluvat lese, riisin olki, riisin lese, bagassi, sahajauho ja soijapapujäte.

4. Menetelmä polysakkaridin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää seuraavat vai- 15 heet: viljellään sukuun Basidiomvcetes kuuluvaa mikro-organismia nestemäisessä kasvatusalustassa kasvisolukon ollessa raaka-aineena ja uutetaan ja eristetään patenttivaatimuksen 1 mukainen polysakkaridi. 20

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu Basidiomvcetes-sukuun kuuluva mikro-organismi on Lentinus edodes. Acraricus bispo-rus. Grifola frondosa. Pholiota nameko. Pleurotus ostrea- • · 25 tus. Flammulina velutipes. Ganoderma lucidum. Auricularia • · auricula. Ganoderma applanatum. Coriolus versicolor. Gri- • *· fola umbellata. Schizophvllum commune tai Volvariella vol- :' ! vaceae. » > ·

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, t u n - ; n e t t u siitä, että mainittu raaka-aineena oleva kas- visolukko on yksi tai useampi kasvikuitu, joka on lese, , riisin olki, riisin lese, bagassi, sahajauho tai soijapa- • pujäte. . ” 35 i · 110324 14

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittuna kasvisolukkoraaka-ainee-na käytetään yhden tai useamman mainitun kasvikuidun kuu-mavesiuutetta. 5 f i · i e * * ! * 1 * · ; 5 11C?24 Paten tkrav