CN111893152B - 一种利用细菌生物合成壳聚糖的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用细菌生物合成壳聚糖的方法，所涉及的微生物菌株为木醋杆菌AS1.1812，保藏号为CGMCC No.1.1812。本发明以木醋杆菌AS1.1812为出发菌株，经过活化、种子培养及发酵培养等工序后，在一定条件下分离、纯化制备得到高纯度的壳聚糖。本发明报道的壳聚糖生产方法具有化学品耗量少、工艺环保，成本低、易于推广生产等优点，生产的壳聚糖可广泛应用于食物、医疗、生物环保等领域。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种利用细菌生物合成壳聚糖的方法。
背景技术
壳聚糖是天然多糖中大量存在的唯一碱性氨基多糖，具有生物降解性、生物相容性、无毒性、抑菌、抗癌、降脂及增强免疫等多种生理功能，被广泛应用于食品添加剂、纺织、环保、美容保健、化妆品、抗菌剂、人造组织材料、药物缓释材料、基因转导载体、组织工程载体材料、医疗以及药物开发等众多领域。此外壳聚糖还有增强人体免疫力、清除体内多余脂肪、抑制有害菌、降低血脂、调节血糖、无毒性抗癌效果及作为生物医用材料等功能。研究表明，壳聚糖可吸附镉、汞、铜等重金属，可作为絮凝各种胶态等颗粒而用于果汁澄清、蔗糖净化、废水处理、蛋白质菌丝体的絮凝等。另外，由于壳聚糖具有生物功能性、安全无毒、可生物降解和生物相容性等优点，在医学上具有较好的应用前景。在农业上，壳聚糖是一种很有效的化肥和农药的载体，能减少农用化肥对环境的污染，有效地保护环境和维持生态平衡。壳聚糖作为自然界仅次于纤维素的第二大丰富的生物聚合物，具有巨大的潜在市场和广阔的应用前景。
传统生产壳聚糖主要有两个方法：虾蟹壳提取法和微生物发酵法。虾蟹壳提取法采用虾蟹等海洋节肢动物的甲壳、昆虫的甲壳、软体动物的壳和骨骼提取甲壳素，再经过强碱溶液脱乙酰获得壳聚糖。这种工艺消耗大量的强酸、强碱，存在较大的环保压力。微生物发酵法相比虾蟹壳提取法具有产品品质稳定，差异小，灰分含量较低，提取过程中需要消耗的酸液少等优点。目前，文献报道较多的微生物发酵法制备壳聚糖的菌种主要为丝状真菌，但其提取方法主要借鉴虾蟹壳法，为去除菌丝体中的蛋白质，同样会产生较多的碱废液，环境不够友好。
木醋杆菌属于微生物发酵和食品生物技术领域长期使用的安全菌株，无毒无害，已经成功应用于细菌纤维素的发酵生产。如中国专利CN106244646A提供了一种血液吸附用细菌纤维素的制备方法，其通过将培养后的木醋杆菌种子液接种于改良的SH的培养基中，静置培养后得到细菌纤维素湿膜，进一步水洗后用氢氧化钠溶液煮沸4小时，水洗后于室温下在0.5%乙酸中浸泡半小时，用蒸馏水冲洗干净，烘干得到细菌纤维素。细菌纤维素是由葡萄糖单体以β-1,4 糖苷键连接而成的直链多糖，壳聚糖是由氨基葡萄糖单体以β-1,4 糖苷键连接而成的直链多糖，虽然壳聚糖和细菌纤维素的化学结构非常接近，但能否利用木醋杆菌生物合成壳聚糖，尚未有明确的报道。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种利用细菌生物合成壳聚糖的方法，所述细菌为木醋杆菌AS1.1812，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC编号为1.1812，包括以下步骤：
S1：将木醋杆菌AS1.1812接种于活化培养基平板，所述活化培养基pH 值为6.6~7.0，置于培养箱内倒置活化培养，得到活化的单菌落；
S2：将步骤S1得到的单菌落接种于种子培养基，置于摇床震荡种子培养至种子液的OD600 达到0.6~1.0后，再将种子液接入发酵培养基中，置于摇床震荡发酵培养，得到发酵后产物；
S3：将步骤S2得到的发酵后产物进行离心分离，收集上层清液，清液中加入氢氧化钠调节溶液pH至中性，离心收集沉淀，获得壳聚糖粗品；
S4：将步骤S3获得的壳聚糖粗品，使用0.5%乙酸溶液将其充分溶解，离心，收集上清液，清液中加入氢氧化钠溶液调节pH至中性，离心收集沉淀，沉淀经蒸馏水洗涤、过滤及干燥后，获得壳聚糖。
其中，所述发酵培养基的制备方法为：
（1）秤量聚蛋白胨5g，酵母提取物5g，丙三醇20g，MgSO4 • 7H2O0.1g，乙醇5mL，加去离子水溶解并定容至500 mL，经高压蒸汽灭菌后得到溶液A；
（2）秤量氨基葡萄糖盐酸盐20g，氢氧化钠1.8g，加纯水溶解并定容至500 mL，再使用0.2 2μm孔径的除菌过滤器过滤得到溶液B；
（3）将溶液A和B等体积混合，得到发酵培养基。
其中，所述活化培养基的组分及含量为：聚蛋白胨5g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖5g/L，甘露醇5g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，乙醇5mL/L，琼脂15g/L。
其中，所述种子培养基的组分及含量为：聚蛋白胨5g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖5g/L，甘露醇5g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，乙醇5 mL/L。
其中，所述发酵培养基的组分及含量为：聚蛋白胨5g/L，酵母提取物5g/L，氨基葡萄糖盐酸盐20g/L，氢氧化钠1.8g/L，丙三醇20g/L，MgSO4·7H2O0.1 g/L，乙醇5mL/L。
其中，所述种子液和所述发酵培养基的体积百分比为5~10%：90~95%。
其中，步骤S1中，所述活化培养的温度为25~30℃，时间为48~72 h。
其中，步骤S2中，所述种子培养的温度为25~30℃，时间为12~16 h，摇床震荡转速为100~150 r/min。
其中，步骤S2中，所述发酵培养的温度为25~30℃，时间为40~48 h，摇床震荡转速为100~150 r/min。
其中，步骤S3和S4中，所述离心分离的时间为10~20min，转速为3000~5000 r/min。
本发明的有益效果：
本发明以氨基葡萄糖盐酸盐和丙三醇作为碳源，以木醋杆菌AS1.1812为细菌生物，经过活化、培养、发酵及后处理，获得了一种壳聚糖的生产方法。本发明报道的壳聚糖生产方法具有化学品耗量少、工艺环保，成本低、易于推广生产等优点，所用微生物菌种木醋杆菌AS1.1812属于微生物发酵和食品生物技术领域长期使用的安全菌株，无毒无害，生产的壳聚糖可广泛应用于食物、医疗、生物环保等领域。
具体实施方式
以下是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
本发明是通过以下方式实施的：
（1）配制培养基：
配制活化培养基：分别称取5g聚蛋白胨、5g酵母提取物、5g葡萄糖、5g甘露醇、0.1gMgSO4·7H2O、5 mL乙醇及15g琼脂，混合搅拌均匀后得到活化培养基。
配制种子培养基：分别称取5g聚蛋白胨、5g酵母提取物、5g葡萄糖、5g甘露醇、0.1gMgSO4·7H2O及5mL乙醇，混合均匀后得到种子培养基。
配制发酵培养基：将5g聚蛋白胨、5g酵母提取物、20g丙三醇，0.1gMgSO4 • 7H2O和5mL乙醇混合，再加蒸馏水溶解并定容至500mL，经高压蒸汽灭菌后得到溶液A；将20g氨基葡萄糖盐酸盐、1.8g氢氧化钠加入蒸馏水水中，完全溶解后定容至500mL，再使用0.22μm孔径的除菌过滤器过滤得到溶液B；将溶液A和B等体积混合，得到发酵培养基。
（2）合成壳聚糖
将木醋杆菌AS1.1812接种于活化培养基平板，置于培养箱内倒置活化，得到的活化的单菌落；
将活化的单菌落接种于种子培养基，置于摇床震荡种子培养，得到种子液；将种子液按比例接入发酵培养基中，置于摇床震荡发酵培养，得到发酵后产物；
将发酵后的产物进行离心分离，收集清液，使用氢氧化钠调节清液pH值至中性，离心收集沉淀，获得壳聚糖粗品；
使用0.5%乙酸溶液将壳聚糖粗品充分溶解，离心，收集上层清液，再将氢氧化钠加入得到的清液中，调节溶液pH至中性，离心收集沉淀，沉淀经蒸馏水洗涤、过滤及干燥后，获得壳聚糖。
实施例1
本发明提供了一种利用细菌生物合成壳聚糖的方法，包括以下步骤：
S1、将木醋杆菌AS1.1812接种于活化培养基平板，置于培养箱内倒置活化，培养温度为25℃，时间72 h，得到的活化的单菌落；
S2、将活化的单菌落接种于种子培养基，置于摇床震荡种子培养，培养温度为25℃，时间16h，摇床震荡转速为100 r/min，得到种子液，经测试，种子液OD600 为0.6；
S3、将种子液接入发酵培养基中，种子液和发酵培养基体积占比分别为5%和95%，置于摇床震荡发酵培养，培养温度为25℃，时间为48h，摇床震荡转速为100r/min，得到发酵后产物；将发酵后的产物进行离心分离，收集清液，使用氢氧化钠调节清液pH值至中性，离心收集沉淀，获得壳聚糖粗品；
S4、将步骤S3获得的壳聚糖粗品使用0.5%乙酸溶液充分溶解、离心，收集上层清液，经测试上层清液中壳聚糖含量达到2.2mg/mL；将氢氧化钠加入得到的清液中，调节溶液pH至中性，离心收集沉淀，沉淀经蒸馏水洗涤、过滤及干燥后，获得壳聚糖。
实施例2
本发明提供了一种利用细菌生物合成壳聚糖的方法，包括以下步骤：
S1、将木醋杆菌AS1.1812接种于活化培养基平板，置于培养箱内倒置活化，培养温度为26℃，时间70 h，得到的活化的单菌落；
S2、将活化的单菌落接种于种子培养基，置于摇床震荡种子培养，培养温度为25℃，时间16 h，摇床震荡转速为100 r/min，得到种子液，经测试，种子液OD600 为0.8；
S3、将种子液接入发酵培养基中，种子液和发酵培养基体积占比分别为6%和94%，置于摇床震荡发酵培养，培养温度为26℃，时间为45h，摇床震荡转速为120r/min，得到发酵后产物；将发酵后的产物进行离心分离，收集清液，使用氢氧化钠调节清液pH值至中性，离心收集沉淀，获得壳聚糖粗品；
S4、将步骤S3获得的壳聚糖粗品使用0.5%乙酸溶液充分溶解、离心，收集上层清液，经测试上层清液中壳聚糖含量达到2.6mg/mL；将氢氧化钠加入得到的清液中，调节溶液pH至中性，离心收集沉淀，沉淀经蒸馏水洗涤、过滤及干燥后，获得壳聚糖。
实施例3
本发明提供了一种利用细菌生物合成壳聚糖的方法，包括以下步骤：
S1、将木醋杆菌AS1.1812接种于活化培养基平板，置于培养箱内倒置活化，培养温度为27℃，时间60 h，得到的活化的单菌落；
S2、将活化的单菌落接种于种子培养基，置于摇床震荡种子培养，培养温度为29℃，时间13 h，摇床震荡转速为130 r/min，得到种子液，经测试，种子液OD600 为0.7；
S3、将种子液接入发酵培养基中，种子液和发酵培养基体积占比分别为7%和93%，置于摇床震荡发酵培养，培养温度为27℃，时间为40h，摇床震荡转速为130r/min，得到发酵后产物；将发酵后的产物进行离心分离，收集清液，使用氢氧化钠调节清液pH值至中性，离心收集沉淀，获得壳聚糖粗品；
S4、将步骤S3获得的壳聚糖粗品使用0.5%乙酸溶液充分溶解、离心，收集上层清液，经测试上层清液中壳聚糖含量达到2.3mg/mL；将氢氧化钠加入得到的清液中，调节溶液pH至中性，离心收集沉淀，沉淀经蒸馏水洗涤、过滤及干燥后，获得壳聚糖。
实施例4
本发明提供了一种利用细菌生物合成壳聚糖的方法，包括以下步骤：
S1、将木醋杆菌AS1.1812接种于活化培养基平板，置于培养箱内倒置活化，培养温度为28℃，时间55 h，得到的活化的单菌落；
S2、将活化的单菌落接种于种子培养基，置于摇床震荡种子培养，培养温度为28℃，时间14 h，摇床震荡转速为140 r/min，得到种子液，经测试，种子液OD600 为0.9；
S3、将种子液接入发酵培养基中，种子液和发酵培养基体积占比分别为8%和92%，置于摇床震荡发酵培养，培养温度为28℃，时间为46h，摇床震荡转速为140r/min，得到发酵后产物；将发酵后的产物进行离心分离，收集清液，使用氢氧化钠调节清液pH值至中性，离心收集沉淀，获得壳聚糖粗品；
S4、将步骤S3获得的壳聚糖粗品使用0.5%乙酸溶液充分溶解、离心，收集上层清液，经测试上层清液中壳聚糖含量达到1.9mg/mL；将氢氧化钠加入得到的清液中，调节溶液pH至中性，离心收集沉淀，沉淀经蒸馏水洗涤、过滤及干燥后，获得壳聚糖。
实施例5
本发明提供了一种利用细菌生物合成壳聚糖的方法，包括以下步骤：
S1、将木醋杆菌AS1.1812接种于活化培养基平板，置于培养箱内倒置活化，培养温度为29℃，时间50 h，得到的活化的单菌落；
S2、将活化的单菌落接种于种子培养基，置于摇床震荡种子培养，培养温度为27℃，时间12 h，摇床震荡转速为150 r/min，得到种子液，经测试，种子液OD600 为1.0；
S3、将种子液接入发酵培养基中，种子液和发酵培养基体积占比分别为9%和91%，置于摇床震荡发酵培养，培养温度为29℃，时间为42h，摇床震荡转速为150r/min，得到发酵后产物；将发酵后的产物进行离心分离，收集清液，使用氢氧化钠调节清液pH值至中性，离心收集沉淀，获得壳聚糖粗品；
S4、将步骤S3获得的壳聚糖粗品使用0.5%乙酸溶液充分溶解、离心，收集上层清液，经测试上层清液中壳聚糖含量达到2.0mg/mL；将氢氧化钠加入得到的清液中，调节溶液pH至中性，离心收集沉淀，沉淀经蒸馏水洗涤、过滤及干燥后，获得壳聚糖。
实施例6
本发明提供了一种利用细菌生物合成壳聚糖的方法，包括以下步骤：
S1、将木醋杆菌AS1.1812接种于活化培养基平板，置于培养箱内倒置活化，培养温度为30℃，时间48 h，得到的活化的单菌落；
S2、将活化的单菌落接种于种子培养基，置于摇床震荡种子培养，培养温度为26℃，时间15 h，摇床震荡转速为110 r/min，得到种子液，经测试，种子液OD600 为0.8；
S3、将种子液接入发酵培养基中，种子液和发酵培养基体积占比分别为10%和90%，置于摇床震荡发酵培养，培养温度为30℃，时间为44 h，摇床震荡转速为110r/min，得到发酵后产物；将发酵后的产物进行离心分离，收集清液，使用氢氧化钠调节清液pH值至中性，离心收集沉淀，获得壳聚糖粗品；
S4、将步骤S3获得的壳聚糖粗品使用0.5%乙酸溶液充分溶解、离心，收集上层清液，经测试上层清液中壳聚糖含量达到1.8mg/mL；将氢氧化钠加入得到的清液中，调节溶液pH至中性，离心收集沉淀，沉淀经蒸馏水洗涤、过滤及干燥后，获得壳聚糖。
以上实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都是属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种利用细菌生物合成壳聚糖的方法，所述细菌为木醋杆菌AS1.1812，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC编号为1.1812，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将木醋杆菌AS1.1812接种于活化培养基平板，所述活化培养基pH值为6.6～7.0，置于培养箱内倒置活化培养，得到活化的单菌落；
所述活化培养基的组分及含量为：聚蛋白胨5g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖5g/L，甘露醇5g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，乙醇5mL/L，琼脂15g/L；
S2：将步骤S1得到的单菌落接种于种子培养基，置于摇床震荡种子培养至种子液的OD600达到0.6～1.0后，再将种子液接入发酵培养基中，置于摇床震荡发酵培养，得到发酵后产物；
所述种子培养基的组分及含量为：聚蛋白胨5g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖5g/L，甘露醇5g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，乙醇5mL/L；
所述发酵培养基的组分及含量为：聚蛋白胨5g/L，酵母提取物5g/L，氨基葡萄糖盐酸盐20g/L，氢氧化钠1.8g/L，丙三醇20g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，乙醇5mL/L；
S3：将步骤S2得到的发酵后产物进行离心分离，收集上层清液，清液中加入氢氧化钠调节溶液pH至中性，离心收集沉淀，获得壳聚糖粗品；
S4：将步骤S3获得的壳聚糖粗品，使用0.5％乙酸溶液将其充分溶解，离心，收集上清液，清液中加入氢氧化钠溶液调节pH至中性，离心收集沉淀，沉淀经蒸馏水洗涤、过滤及干燥后，获得壳聚糖。
2.根据权利要求1所述的一种利用细菌生物合成壳聚糖的方法，其特征在于，所述发酵培养基的制备方法为：
(1)秤量聚蛋白胨5g，酵母提取物5g，丙三醇20g，MgSO4·7H2O 0.1g，乙醇5mL，加去离子水溶解并定容至500mL，经高压蒸汽灭菌后得到溶液A；
(2)秤量氨基葡萄糖盐酸盐20g，氢氧化钠1.8g，加纯水溶解并定容至500mL，再使用0.22μm孔径的除菌过滤器过滤得到溶液B；
(3)将溶液A和B等体积混合，得到发酵培养基。
3.根据权利要求1所述的一种利用细菌生物合成壳聚糖的方法，其特征在于：所述种子液和所述发酵培养基的体积百分比为5～10％：90～95％。
4.根据权利要求1～3中任意一项权利要求所述的一种利用细菌生物合成壳聚糖的方法，其特征在于：步骤S1中，所述活化培养的温度为25～30℃，时间为48～72h。
5.根据权利要求1～3中任意一项权利要求所述的一种利用细菌生物合成壳聚糖的方法，其特征在于：步骤S2中，所述种子培养的温度为25～30℃，时间为12～16h，摇床震荡转速为100～150r/min。
6.根据权利要求1～3中任意一项权利要求所述的一种利用细菌生物合成壳聚糖的方法，其特征在于：步骤S2中，所述发酵培养的温度为25～30℃，时间为40～48h，摇床震荡转速为100～150r/min。
7.根据权利要求1～3中任意一项权利要求所述的一种利用细菌生物合成壳聚糖的方法，其特征在于：步骤S3和S4中，所述离心分离的时间为10～20min，转速为3000～5000r/min。
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