CN115369134A - 一种淀粉基多酚复合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种淀粉基多酚复合物及其制备方法与应用。本发明通过将灭菌的淀粉与蒸馏水混合，在得到的培养基质中接种红曲霉种子液，培养；将得到的发酵液进行固液分离，收集得到的固体物冷冻干燥，过筛除去红曲霉菌体，得到发酵后的淀粉；将发酵后的淀粉加入多酚溶液或多酚提取物溶液中进行吸附；吸附后进行固液分离，固体冷冻干燥后为淀粉基多酚复合物。本发明首次利用发酵法提升了淀粉对多酚的吸附能力；相较于现有的淀粉改性方法，发酵法更简单高效，克服物理化学法的高能耗和高污染的问题，减少了酶解法的酶制造步骤，更具全发酵体系(酶、酸、气体、微生物)的优势。

Description

一种淀粉基多酚复合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物材料领域，特别涉及一种淀粉基多酚复合物及其制备方法与应用。
背景技术
多酚类化合物是一类复杂多羟基类的次生代谢产物，广泛存在于植物中，特别是在蔬菜、水果、植物种子、茶叶和草药中。多酚类化合物是一种重要的工业原料，广泛应用于制革、酿酒和生物医用材料领域。多酚具有抗氧化、降血糖、抗癌、抗炎、抗菌、抗过敏和抗病毒等多种生物活性，具有显著的食用和药用优势，可用于预防糖尿病、帕金森病等多种人类慢性疾病。然而，多酚化合物的生物利用度低、水溶性差、分解迅速，在环境、加工和胃肠道条件下稳定性低，如果暴露于氧气、光线、酶、不利的温度和pH、金属离子等环境中，就会被降解破坏，这可能导致多酚的有益活性发生变化，严重限制其在食品和医药领域的应用。
研究显示，淀粉、蛋白质、多糖、脂质体等多种生物材料具有提高多酚类物质体外稳定性和体内生物利用度的潜力，其中淀粉材料可生物降解，成本低廉，具有良好的生物相容性和安全性，受到了广大研究者的关注。
谷物来源的天然淀粉表面存在部分小孔，为吸附活性化合物提供了空间，可用于构建多酚的递送体系，作为载体控制多酚释放。然而，由于天然淀粉的比表面积小，活性位点有限，对多酚的吸附低。目前常采用物理、化学、生物等方法对淀粉进行改性，通过破坏淀粉的结构，形成表面多孔结构，提高吸附能力。常见的物理改性法有机械挤压、微波和超声法，化学法有溶剂交换法、酸水解法和分子插入法，生物法主要是酶解法。目前，物理和化学改性方法能耗高、污染大，单纯的酶解法成本较高，难以推广。目前迫切需要一种更加绿色环保、成本低廉的方法对淀粉进行改性以提高其吸附能力。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种淀粉基多酚复合物的制备方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的淀粉基多酚复合物。
本发明的再一目的在于提供上述淀粉基多酚复合物的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种淀粉基多酚复合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料预处理：将淀粉干燥，过筛；
(2)发酵培养：将步骤(1)得到的淀粉灭菌，与灭菌后蒸馏水混合，制成培养基质；将红曲霉种子液接入培养基质中，培养；
(3)分离干燥：将步骤(2)得到的发酵液进行固液分离，去除液体，收集固体物；将固体物冷冻干燥，过筛除去红曲霉菌体，得到发酵后的淀粉；
(4)淀粉基多酚复合物制备：取步骤(3)得到的发酵后的淀粉加入多酚溶液或多酚提取物溶液中进行吸附；吸附后进行固液分离，去除液体，得到固体，冷冻干燥，得到淀粉基多酚复合物。
步骤(1)中所述的淀粉优选为玉米淀粉、蜡质玉米淀粉、木薯淀粉和大米淀粉中的至少一种。
步骤(1)中所述的干燥的温度优选为30～60℃；更优选为35～45℃；最优选为40℃。
步骤(1)中所述的干燥的时间优选为2～24h；更优选为4～8h；最优选为6h。
步骤(1)中所述的筛更优选为至少30目筛；更优选为40目筛。
步骤(2)中所述的灭菌的条件优选为115～121℃灭菌15～30℃。
步骤(2)中所述的水优选为蒸馏水。
步骤(2)中所述的水的用量优选按其与淀粉为质量比1～10：1配比；更优选按其与淀粉为质量比2～5：1配比；最优选按其与淀粉为质量比4～5：1配比；进一步优选按其与淀粉为质量比4：1配比。
步骤(2)中所述的红曲霉优选为红曲霉(Monascus anka)GIM 3.592，但不限于该菌。
步骤(2)中所述的红曲霉种子液的浓度优选为1×105～1×108个孢子/mL；更优选为2 ×106～4×106个孢子/mL；最优选为3×106个孢子/mL。
步骤(2)中所述的红曲霉种子液优选通过如下步骤制备得到：采用0.1％的tween80洗脱活化好的红曲霉菌，接种于已灭菌的液体培养基中，摇瓶培养，得到红曲霉种子液；液体培养基的配方如下:葡萄糖20g/L、酵母膏3g/L、蛋白胨10g/L、KH2PO4 4g/L、KCl 0.5g/L、 FeSO4·7H2O 0.01g/L；溶剂为去离子水。
所述的摇瓶培养的条件优选为：液体培养基的装载量为三角瓶容积的1/5～1/4，于25～ 37℃、150～220rpm下培养25～30小时；优选为：液体培养基的装载量为三角瓶容积的1/5～ 1/4，于28～32℃、150～200rpm下培养25～30小时；最优选为液体培养基的装载量为三角瓶容积的1/5，于30℃、180rpm下培养27小时。
步骤(2)中所述的红曲霉种子液的接种量按培养基质体积比1～20％计算；更优选按培养基质体积比5～7％计算；最优选按培养基质体积比7％计算。
步骤(2)中所述的培养的条件优选为20～37℃、50～500rpm培养2～10d；更优选为28～ 32℃、160～200rpm培养6～8d；最优选为30℃、180rpm培养6～8d；进一步为30℃、180rpm 培养8d。
步骤(3)和步骤(4)中所述的固液分离的方法为离心或过滤。
所述的离心的条件优选为8000～12000rpm离心15～25min；更优选为10000rpm离心 20min。
所述的过滤的条件优选为真空下过0.45～0.88μm滤膜。
步骤(3)中所述的冷冻干燥的时间优选为48～96h；更优选为72h。
步骤(3)中所述的筛的规格和步骤(1)中所述的筛的规格一样，其能使得淀粉或发酵淀粉通过，但是红曲霉菌体不能通过；优选为至少30目筛，从而能分离除去沉淀物中的红曲霉菌体，得到发酵淀粉。
步骤(4)中所述的多酚溶液或多酚提取物溶液是含有没食子酸、绿原酸、杨梅素、槲皮素和山奈酚中的至少一种的液体。
步骤(4)中所述的多酚溶液的溶剂为水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯和乙腈中的至少一种；优选为浓度为体积百分比70％的乙醇水溶液。
步骤(4)中所述的多酚溶液或多酚提取物溶液优选初始浓度0.2～0.8g/L、pH3～11的多酚溶液或多酚提取物溶液；更优选初始浓度0.2～0.4g/L、pH3～7的多酚溶液或多酚提取物溶液；最优选初始浓度0.2～0.4g/L、pH7的多酚溶液或多酚提取物溶液。
步骤(4)中所述的发酵后的淀粉的用量优选按其与多酚质量比为100：2～4进行配比。
步骤(4)中所述的吸附的条件优选为于暗处恒温震荡吸附。
所述的温度优选为20～60℃；更优选为25～50℃；更优选为30℃。
所述的震荡吸附的转速优选为50～500rpm；更优选为120～180rpm；最优选为150rpm。
所述的震荡吸附的时间优选为0～600min(不含端点0值)；更优选为120～240min。
一种淀粉基多酚复合物，通过上述的制备方法得到。
上述淀粉基多酚复合物在食品领域和/或医药领域中的应用。
本发明建立在以下基础上：
(1)发酵菌株选用一株益生菌株红曲霉(Monascus anka GIM 3.592)，这为复合物在食品、医药领域的应用提供了可能；
(2)红曲霉发酵过程代谢产生酶、酸和气体等代谢产物，发酵过程代谢产物对淀粉颗粒表面的侵蚀破坏，红曲霉与淀粉颗粒的直接接触，促使淀粉形成多孔形貌，为提供更多吸附空间和活性位点提供可能；
(3)在对多酚的吸附过程中，具有多孔表面的淀粉颗粒更容易与多酚发生吸附，为形成稳定的淀粉基多酚复合物提供可能；
(4)淀粉与多酚形成稳定复合物，为实现多酚的缓慢释放提供可能。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明首次利用发酵法提升了淀粉对多酚的吸附能力。
(2)相较于现有的淀粉改性方法，发酵法更简单高效，克服物理化学法的高能耗和高污染的问题，减少了酶解法的酶制造步骤，更具全发酵体系(酶、酸、气体、微生物)的优势。
(3)相较于多酚，本发明制备的淀粉基多酚复合物具有更强的稳定性和缓释性。
附图说明
图1是发酵前后淀粉的表观形态图；其中，A为未发酵淀粉、B为红曲霉发酵淀粉的SEM 图。
图2是模拟胃肠道条件下样品的释放率特性结果图；其中，A为模拟胃环境、B为模拟肠道环境。
图3是不同微生物发酵蜡质玉米淀粉在200倍数下的光学显微镜图；其中，A为未发酵， B为植物乳杆菌发酵，C为红曲霉发酵蜡质玉米淀粉。
图4是红曲霉发酵木薯淀粉的光学显微镜图像图；其中，A为未发酵，B为红曲霉发酵木薯淀粉。
图5是植物乳杆菌发酵木薯淀粉的光学显微镜图像图；其中，A为未发酵，B为植物乳杆菌发酵木薯淀粉。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
对比例所用酶均购自Macklin公司，其中，α-淀粉酶与普鲁兰酶的酶活力分别为2×106U/g 和1×105U/g。
红曲霉种子液的制备：采用0.1％的tween 80洗脱活化好的红曲霉菌，接种于已灭菌的液体培养基中，液体培养基的装载量为三角瓶容积的1/5，于30℃、180rpm下培养27小时摇瓶培养，得到红曲霉种子液；液体培养基的配方如下:葡萄糖20g/L、酵母膏3g/L、蛋白胨 10g/L、KH2PO4 4g/L、KCl 0.5g/L、FeSO4·7H2O 0.01g/L；溶剂为去离子水。可通过镜检计数调整红曲霉种子液的浓度。
实施例1
(1)选取干燥的蜡质玉米淀粉(购自中粮生物科技股份有限公司，下同)，121℃灭菌 15min，与无菌蒸馏水按照质量比1:2混合形成淀粉乳，按照体积比接入5％的红曲霉(Monascus anka GDMCC 3.592，广东省微生物菌种保藏中心；已在CN201510450416.8中公开，即该申请中的“GIM 3.592”)种子液(约3×106个孢子/mL)，30℃、180rpm培养6d。发酵液于10000rpm 下离心20min，去除上清液，取沉淀冷冻干燥72h，过40目筛除去红曲霉菌体，得到发酵淀粉样品。
(2)取30mg番石榴叶多酚提取物(参考硕士学位论文“邬亚男.番石榴叶发酵增效及其提取物包合与体外消化”第三章3.2.5.2制备)溶于100mL浓度为体积百分比70％的乙醇溶液中，得到提取液，调节初始pH至7.0；取1g发酵淀粉样品加入提取液中，于暗处30℃、150rpm下恒温震荡240min，得到淀粉吸附液；取1mL淀粉吸附液，5000rpm下离心5min，收集上清液，沉淀物加入去离子水至1mL洗涤三次，合并收集上清液，用以测定多酚浓度(参考文献“Adsorption mechanism of polyphenols onto starch nanoparticles and enhancedantioxidant activity under adverse conditions”中2.3的检测方法，设置对照组:不加入淀粉，番石榴叶多酚提取物在同样条件下测定的浓度作为吸附前浓度)。多酚浓度采用福林酚法进行测定。用没食子酸(0.01～0.1mg/mL)制备校正曲线，得到回归方程(y＝5.999x+0.014，R2＝0.997)。计算得到吸附量为11.47mg GAE/g，吸附率为18.59％。公式如下(下同)：
吸附量＝(吸附前浓度*吸附前体积-吸附后浓度*吸附后体积)/淀粉质量
吸附率％＝(吸附前浓度*吸附前体积-吸附后浓度*吸附后体积)/(吸附前浓度*吸附前体积)*100％。
实施例2
(1)选取干燥的蜡质玉米淀粉，121℃灭菌15min，与无菌蒸馏水按照质量比1:4混合形成淀粉乳，按照体积比接入5％的红曲霉种子液(约3×106个孢子/mL)，30℃、180rpm培养 6d。发酵液于10000rpm下离心20min，去除上清液，取沉淀冷冻干燥72h，过40目筛除去红曲霉菌体，得到发酵淀粉样品。
(2)取30mg番石榴叶多酚提取物溶于100mL浓度为体积百分比70％的乙醇溶液中，得到提取液，调节初始pH至7.0；取1g发酵淀粉样品加入提取液中，于暗处30℃、150rpm 下恒温震荡240min；取1mL淀粉吸附液，5000rpm下离心5min，沉淀物加入去离子水至1mL 洗涤三次，合并收集上清液，用以测定多酚浓度。多酚浓度采用福林酚法进行测定。用没食子酸(0.01～0.1mg/mL)制备校正曲线，得到回归方程(y＝5.999x+0.014，R2＝0.997)。吸附量为16.90mg GAE/g，吸附率为24.55％。
实施例3
(1)选取干燥的蜡质玉米淀粉，121℃灭菌15min，与无菌蒸馏水按照质量比1:5混合形成淀粉乳，按照体积比接入5％的红曲霉种子液(约3×106个孢子/mL)，30℃、180rpm培养 6d。发酵液于10000rpm下离心20min，去除上清液，取沉淀冷冻干燥72h，过40目筛除去红曲霉菌体，得到发酵淀粉样品。
(2)取30mg番石榴叶多酚提取物溶于100mL浓度为体积百分比70％的乙醇溶液中，得到提取液，调节初始pH至7.0；取1g发酵淀粉样品加入提取液中，于暗处30℃、150rpm 下恒温震荡240min；取1mL淀粉吸附液，5000rpm下离心5min，沉淀物加入去离子水至1mL 洗涤三次，合并收集上清液，用以测定多酚浓度。多酚浓度采用福林酚法进行测定。用没食子酸(0.01～0.1mg/mL)制备校正曲线，得到回归方程(y＝5.999x+0.014，R2＝0.997)。吸附量为12.74mg GAE/g，吸附率为18.88％。
实施例4
(1)选取干燥的蜡质玉米淀粉，121℃灭菌15min，与无菌蒸馏水按照质量比1:5混合形成淀粉乳，按照体积比接入7％的红曲霉种子液(约3×106个孢子/mL)，30℃、180rpm培养 6d。发酵液于10000rpm下离心20min，去除上清液，取沉淀冷冻干燥72h，过40目筛除去红曲霉菌体，得到发酵淀粉样品。
(2)取30mg番石榴叶多酚提取物溶于100mL浓度为体积百分比70％的乙醇溶液中，得到提取液，调节初始pH至7.0；取1g发酵淀粉样品加入提取液中，于暗处30℃、150rpm 下恒温震荡240min；取1mL淀粉吸附液，5000rpm下离心5min，沉淀物加入去离子水至1mL 洗涤三次，合并收集上清液，用以测定多酚浓度。多酚浓度采用福林酚法进行测定。用没食子酸(0.01～0.1mg/mL)制备校正曲线，得到回归方程(y＝5.999x+0.014，R2＝0.997)。计算吸附量为22.36mg GAE/g，吸附率为30.20％。
实施例5
(1)选取干燥的蜡质玉米淀粉，121℃灭菌15min，与无菌蒸馏水按照质量比1:5混合形成淀粉乳，按照体积比接入7％的红曲霉种子液(约3×106个孢子/mL)，30℃、180rpm培养8d。发酵液于10000rpm下离心20min，去除上清液，取沉淀冷冻干燥72h，过40目筛除去红曲霉菌体，得到发酵淀粉样品。
(2)取30mg番石榴叶多酚提取物溶于100mL浓度为体积百分比70％的乙醇溶液中，得到提取液，调节初始pH至7.0；取1g发酵淀粉样品加入提取液中，于暗处30℃、150rpm 下恒温震荡240min；取1mL淀粉吸附液，5000rpm下离心5min，沉淀物加入去离子水至1mL 洗涤三次，合并收集上清液，用以测定多酚浓度。多酚浓度采用福林酚法进行测定。用没食子酸(0.01～0.1mg/mL)制备校正曲线，得到回归方程(y＝5.999x+0.014，R2＝0.997)。计算吸附量为15.73mg GAE/g,吸附率为23.40％。
实施例6(最优发酵条件)
(1)选取干燥的蜡质玉米淀粉，121℃灭菌15min，与无菌蒸馏水按照质量比1:4混合形成淀粉乳，按照体积比接入7％的红曲霉种子液(约3×106个孢子/mL)，30℃、180rpm培养 8d。发酵液于10000rpm下离心20min，去除上清液，取沉淀冷冻干燥72h，过40目筛除去红曲霉菌体，得到发酵淀粉样品。
(2)取30mg番石榴叶多酚提取物溶于100mL浓度为体积百分比70％的乙醇溶液中，得到提取液，调节初始pH至7.0；取1g发酵淀粉样品加入提取液中，于暗处30℃、150rpm 下恒温震荡240min；取1mL淀粉吸附液，5000rpm下离心5min，沉淀物加入去离子水至1mL 洗涤三次，合并收集上清液，用以测定多酚浓度。多酚浓度采用福林酚法进行测定。用没食子酸(0.01～0.1mg/mL)制备校正曲线，得到回归方程(y＝5.999x+0.014，R2＝0.997)。计算吸附量为24.81mg GAE/g，吸附率为33.10％。
如图1所示，未发酵淀粉表面光滑，形态饱满，发酵淀粉形状不规则，表面粗糙形成孔洞，证明发酵是淀粉改性的有效手段。
实施例7
(1)选取干燥的蜡质玉米淀粉，121℃灭菌15min，与无菌蒸馏水按照质量比1:4混合形成淀粉乳，按照体积比接入7％的红曲霉种子液(约3×106个孢子/mL)，于暗处30℃、180rpm 培养8d。发酵液于10000rpm下离心20min，去除上清液，取沉淀冷冻干燥72h，过40目筛除去红曲霉菌体，得到发酵淀粉样品。
(2)取30mg番石榴叶多酚提取物溶于100mL浓度为体积百分比70％的乙醇溶液中，得到提取液，调节初始pH至3.0；取1g发酵淀粉样品加入提取液中，于暗处30℃，150rpm 下恒温震荡240min；取1mL淀粉吸附液，5000rpm下离心5min，沉淀物加入去离子水至1mL 洗涤三次，合并收集上清液。多酚浓度采用福林酚法进行测定。用没食子酸(0.01～0.1mg/mL)制备校正曲线，得到回归方程(y＝5.999x+0.014，R2＝0.997)。计算吸附量为16.72mg GAE/g，吸附率为19.70％。
实施例8
(1)选取干燥的蜡质玉米淀粉，121℃灭菌15min，与无菌蒸馏水按照质量比1:4混合形成淀粉乳，按照体积比接入7％的红曲霉种子液(约3×106个孢子/mL)，于暗处30℃、180rpm 培养8d。发酵液于10000rpm下离心20min，去除上清液，取沉淀冷冻干燥72h，过40目筛除去红曲霉菌体，得到发酵淀粉样品。
(2)取30mg番石榴叶多酚提取物溶于100mL浓度为体积百分比70％的乙醇溶液中，得到提取液，调节初始pH至7.0；取1g发酵淀粉样品加入提取液中，于暗处50℃、150rpm 下恒温震荡240min；取1mL淀粉吸附液，5000rpm下离心5min，沉淀物加入去离子水至1mL 洗涤三次，合并收集上清液。多酚浓度采用福林酚法进行测定。用没食子酸(0.01～0.1mg/mL)制备校正曲线，得到回归方程(y＝5.999x+0.014，R2＝0.997)。计算吸附量为11.96mg GAE/g，吸附率为11.78％。
实施例9
(1)选取干燥的蜡质玉米淀粉，121℃灭菌15min，与无菌蒸馏水按照质量比1:4混合形成淀粉乳，按照体积比接入7％的红曲霉种子液(约3×106个孢子/mL)，于暗处30℃、180rpm 培养8d。发酵液于10000rpm下离心20min，去除上清液，取沉淀冷冻干燥72h，过40目筛除去红曲霉菌体，得到发酵淀粉样品。
(2)取20mg番石榴叶多酚提取物溶于100mL浓度为体积百分比70％的乙醇溶液中，得到提取液，调节初始pH至7.0；取1g发酵淀粉样品加入提取液中，于暗处30℃、150rpm 下恒温震荡240min；取1mL淀粉吸附液，5000rpm下离心5min，沉淀物加入去离子水至1mL 洗涤三次，合并收集上清液。多酚浓度采用福林酚法进行测定。用没食子酸(0.01～0.1mg/mL)制备校正曲线，得到回归方程(y＝5.999x+0.014，R2＝0.997)。计算吸附量为19.72mg GAE/g，吸附率为33.50％。
实施例10
(1)选取干燥的蜡质玉米淀粉，121℃灭菌15min，与无菌蒸馏水按照质量比1:4混合形成淀粉乳，按照体积比接入7％的红曲霉种子液(约3×106个孢子/mL)，于暗处30℃、180rpm 培养8d。发酵液于10000rpm下离心20min，去除上清液，取沉淀冷冻干燥72h，过40目筛除去红曲霉菌体，得到发酵淀粉样品。
(2)取40mg番石榴叶多酚提取物溶于100mL浓度为体积百分比70％的乙醇溶液中，得到提取液，调节初始pH至7.0；取1g发酵淀粉样品加入提取液中，于暗处30℃、150rpm 下恒温震荡240min；取1mL淀粉吸附液，5000rpm下离心5min，沉淀物加入去离子水至1mL 洗涤三次，合并收集上清液。多酚浓度采用福林酚法进行测定。用没食子酸(0.01～0.1mg/mL)制备校正曲线，得到回归方程(y＝5.999x+0.014，R2＝0.997)。计算吸附量为30.13mg GAE/g，吸附率为29.24％。
实施例11
(1)选取干燥的蜡质玉米淀粉，121℃灭菌15min，与无菌蒸馏水按照质量比1:4混合形成淀粉乳，按照体积比接入7％的红曲霉种子液(约3×106个孢子/mL)，于暗处30℃、180rpm 培养8d。发酵液于10000rpm下离心20min，去除上清液，取沉淀冷冻干燥72h，过40目筛除去红曲霉菌体，得到发酵淀粉样品。
(2)取40mg番石榴叶多酚提取物溶于100mL浓度为体积百分比70％的乙醇溶液中，得到提取液，调节初始pH至7.0；取1g发酵淀粉样品加入提取液中，于暗处30℃、150rpm 下恒温震荡120min；取1mL淀粉吸附液，5000rpm下离心5min，沉淀物加入去离子水至1mL 洗涤三次，合并收集上清液。多酚浓度采用福林酚法进行测定。用没食子酸(0.01～0.1mg/mL)制备校正曲线，得到回归方程(y＝5.999x+0.014，R2＝0.997)。计算吸附量为22.97mg GAE/g，吸附率为22.18％
实施例12(最优吸附条件)
(1)选取干燥的蜡质玉米淀粉，121℃灭菌15min，与无菌蒸馏水按照质量比1:4混合形成淀粉乳，按照体积比接入7％的红曲霉种子液(约3×106个孢子/mL)，30℃、180rpm培养 8d。发酵液于10000rpm下离心20min，去除上清液，取沉淀冷冻干燥72h，过40目筛除去红曲霉菌体，得到发酵淀粉样品。
(2)取40mg番石榴叶多酚提取物溶于100mL浓度为体积百分比70％的乙醇溶液中，得到提取液，调节初始pH至7.0；取1g发酵淀粉样品加入提取液中，于暗处25℃、150rpm 下恒温震荡240min；取1mL淀粉吸附液，5000rpm下离心5min，沉淀物加入去离子水至1mL 洗涤三次，合并收集上清液。多酚浓度采用福林酚法进行测定。用没食子酸(0.01～0.1mg/mL)制备校正曲线，得到回归方程(y＝5.999x+0.014，R2＝0.997)。计算吸附量为33.79mg GAE/g，吸附率为32.52％。
缓释效果测定：
取0.1g实施例12制备得到的淀粉基多酚复合物和等量的游离多酚(等量即相等的没食子酸当量，即33.79mg GAE/g的游离多酚)溶解于10mL乙醇-磷酸缓冲液(乙醇5％，0.01M、 pH 2.0或7.0磷酸缓冲液)，加入5kDa透析袋，置于90毫升新鲜透析液中，37℃、150rpm 缓慢搅拌。采用福林酚法测定缓冲液在特定时间(0、2.5、5、10、20、30、60、90、120、180、 240、300、360、420、600min)多酚含量，定期补充新鲜透析液，观察释放特性。
结果如图2显示，相较游离多酚(Free GLP)，淀粉基多酚复合物(FS-GLP)在模拟胃(图2中A)和模拟肠道(图2中B)的pH条件下均表现出明显的缓释效果。
抗氧化活性稳定性测定：
将等量的游离多酚(Free GLP)和实施例12中制备的淀粉基多酚复合物(FS-GLP)用功率为20W的紫外线处理30min，距离紫外灯0.5m，按照1g:20mL的质量体积比溶解于浓度为体积百分比70％的乙醇中，40℃下温育5min，得到样品溶液，测定其抗氧化活性(DPPH 自由基清除率，ABTS自由基清除率，亚铁离子还原能力FRP)。
表1各样品抗氧化活性
Figure RE-GDA0003899039710000101
同行(A-B)或同列(a-b)的不同字母表示具有显著性差异(p<0.05)。
结果表明，紫外处理前，淀粉基多酚复合物的抗氧化活性强于游离多酚(p<0.05)，紫外处理后，游离多酚的抗氧化活性损失严重，DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和亚铁离子还原能力分别下降了51.16％、26.51％和45.61％，而淀粉基多酚复合物分别下降了 9.67％、7.61％和10.70％。说明淀粉基多酚复合物在紫外处理下更加稳定，发酵淀粉能够有效保护多酚物质的抗氧化活性。
对比例1
与实施例6区别在于：不发酵得到空白对照淀粉。
(1)选取干燥的蜡质玉米淀粉，121℃灭菌15min，与无菌蒸馏水按照质量比1:4混合形成淀粉乳，不接种红曲霉，30℃，180rpm培养8d。淀粉乳于10000rpm下离心20min，去除上清液，取沉淀冷冻干燥72h，过40目筛，得到空白对照淀粉样品。
(2)取30mg番石榴叶多酚提取物溶于100mL浓度为体积百分比70％的乙醇溶液中，得到提取液，调节初始pH至7.0；取1g淀粉样品加入提取液中，于暗处30℃、150rpm下恒温震荡240min；取1mL淀粉吸附液，5000rpm下离心5min，沉淀物加入去离子水至1mL洗涤三次，合并收集上清液。多酚浓度采用福林酚法进行测定。用没食子酸(0.01～0.1mg/mL) 制备校正曲线，得到回归方程(y＝5.999x+0.014，R2＝0.997)。计算吸附量为7.87mg GAE/g，吸附率为8.52％。吸附量显著低于实施例6，图1A展示了未发酵淀粉的表面形态。
对比例2
与实施例6区别在于：采用植物乳杆菌发酵蜡质玉米淀粉。
(1)选取干燥的蜡质玉米淀粉，121℃灭菌15min，与无菌蒸馏水按照质量比1:4混合形成淀粉乳，按照体积比接入7％的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum，购自山东中科嘉亿生物工程有限公司)种子液，30℃、180rpm培养8d。淀粉乳于10000rpm下离心20min，去除上清液，取沉淀冷冻干燥72h，过40目筛，得到植物乳杆菌发酵淀粉样品。
(2)取30mg番石榴叶多酚提取物溶于100mL浓度为体积百分比70％的乙醇溶液中，得到提取液，调节初始pH至7.0；取1g淀粉样品加入提取液中，于暗处30℃、150rpm下恒温震荡240min；取1mL淀粉吸附液，5000rpm下离心5min，沉淀物加入去离子水至1mL洗涤三次，合并收集上清液。多酚浓度采用福林酚法进行测定。用没食子酸(0.01～0.1mg/mL) 制备校正曲线，得到回归方程(y＝5.999x+0.014，R2＝0.997)。计算吸附量为8.24mg GAE/g，吸附率为8.24％。吸附量显著低于实施例6。
如图3所示，相比未发酵的蜡质玉米淀粉，植物乳杆菌发酵后，少部分淀粉颗粒发生皱缩，绝大部分颗粒没有发生明显变化，而红曲霉发酵的蜡质玉米淀粉中，更多颗粒的形态发生明显变化。从结构角度证实了，植物乳杆菌发酵对蜡质玉米淀粉的改性效果远低于红曲霉，说明菌种是发酵改性淀粉的关键技术。
对比例3
与实施例6区别在于：红曲霉发酵木薯淀粉
(1)选取干燥的木薯淀粉(购自新乡良润全谷物食品有限公司，下同)，121℃灭菌15min，与无菌蒸馏水按照质量比1:4混合形成淀粉乳，按照体积比接入7％的红曲霉种子液，30℃、 180rpm培养8d。淀粉乳于10000rpm下离心20min，去除上清液，取沉淀冷冻干燥72h，过 40目筛，得到红曲霉发酵木薯淀粉样品。
(2)取30mg番石榴叶多酚提取物溶于100mL浓度为体积百分比70％的乙醇溶液中，得到提取液，调节初始pH至7.0；取1g淀粉样品加入提取液中，于暗处30℃、150rpm下恒温震荡240min；取1mL淀粉吸附液，5000rpm下离心5min，沉淀物加入去离子水至1mL洗涤三次，合并收集上清液。多酚浓度采用福林酚法进行测定。用没食子酸(0.01～0.1mg/mL) 制备校正曲线，得到回归方程(y＝5.999x+0.014，R2＝0.997)。计算吸附量为12.78mg GAE/g，吸附率为14.66％。吸附量显著低于实施例6。
如图4所示，相比未发酵的木薯淀粉，红曲霉发酵后，大部分木薯淀粉颗粒没有发生明显变化；红曲霉发酵对木薯淀粉的改性效果不如蜡质玉米淀粉，说明淀粉种类同样是发酵改性淀粉的关键技术。
对比例4
与实施例6区别在于：植物乳杆菌发酵木薯淀粉
(1)选取干燥的木薯淀粉，121℃灭菌15min，与无菌蒸馏水按照质量比1:4混合形成淀粉乳，按照体积比接入7％的植物乳杆菌种子液，30℃、180rpm培养8d。淀粉乳于10000rpm 下离心20min，去除上清液，取沉淀冷冻干燥72h，过40目筛，得到植物乳杆菌发酵木薯淀粉样品。
(2)取30mg番石榴叶多酚提取物溶于100mL浓度为体积百分比70％的乙醇溶液中，得到提取液，调节初始pH至7.0；取1g淀粉样品加入提取液中，于暗处30℃、150rpm下恒温震荡240min；取1mL淀粉吸附液，5000rpm下离心5min，沉淀物加入去离子水至1mL洗涤三次，合并收集上清液。多酚浓度采用福林酚法进行测定。用没食子酸(0.01～0.1mg/mL) 制备校正曲线，得到回归方程(y＝5.999x+0.014，R2＝0.997)。计算吸附量为7.29mg GAE/g，吸附率为7.12％。吸附量显著低于实施例6。
如图5所示，相比未发酵的木薯淀粉，植物乳杆菌发酵后木薯淀粉颗粒的形态几乎没有发生变化；说明植物乳杆菌几乎不影响木薯淀粉的形态，没有提升其吸附性能的作用。因此，菌种和淀粉种类的组合决定了发酵法的成败，是本发明的关键技术。
对比例5
与实施例6区别在于：复合酶解得到酶解淀粉。
(1)选取干燥的蜡质玉米淀粉，加入0.1M、pH为5.5的醋酸钠缓冲液配成质量百分比 30％的淀粉乳，于50℃水浴搅拌混匀预热，加入1.5％(v/v)淀粉干基的复合酶(α-淀粉酶: 普鲁兰酶＝3:1(v/v))。反应12h后，用1mol/L的NaOH溶液调节pH至10。于10000rpm下离心20min，去除上清液，取沉淀冷冻干燥72h，过40目筛，得到酶解蜡质玉米淀粉。
(2)取30mg番石榴叶多酚提取物溶于100mL浓度为体积百分比70％的乙醇溶液中，得到提取液，调节初始pH至7.0；取1g淀粉样品加入提取液中，于暗处30℃、150rpm下恒温震荡240min；取1mL淀粉吸附液，5000rpm下离心5min，沉淀物加入去离子水至1mL洗涤三次，合并收集上清液。多酚浓度采用福林酚法进行测定。用没食子酸(0.01～0.1mg/mL) 制备校正曲线，得到回归方程(y＝5.999x+0.014，R2＝0.997)。计算吸附量为23.93mg GAE/g，吸附率为28.99％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种淀粉基多酚复合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)原料预处理：将淀粉于干燥，过筛；
(2)发酵培养：将步骤(1)得到的淀粉灭菌，与灭菌后蒸馏水混合，加入灭菌培养基质；将红曲霉种子液接入培养基质中，培养；
(3)分离干燥：将步骤(2)得到的发酵液进行固液分离，去除液体，收集固体物；将固体物冷冻干燥，过筛除去红曲霉菌体，得到发酵后的淀粉；
(4)淀粉基多酚复合物制备：取步骤(3)得到的发酵后的淀粉加入多酚溶液或多酚提取物溶液中进行吸附；吸附后进行固液分离，去除液体，得到固体，冷冻干燥，得到淀粉基多酚复合物。
2.根据权利要求1所述的淀粉基多酚复合物的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的淀粉为玉米淀粉、蜡质玉米淀粉、木薯淀粉和大米淀粉中的至少一种；
步骤(2)中所述的红曲霉为红曲霉(Monascus anka)GIM 3.592；
步骤(4)中所述的多酚溶液或多酚提取物溶液是含有没食子酸、绿原酸、杨梅素、槲皮素和山奈酚中至少一种的液体；
步骤(4)中所述的多酚溶液或多酚提取物是初始浓度0.1～20g/L、pH3～11的多酚溶液或多酚提取物。
3.根据权利要求1所述的淀粉基多酚复合物的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的干燥的温度为30～60℃；
步骤(1)中所述的干燥的时间为2～24h；
步骤(1)中所述的筛为至少30目筛；
步骤(2)中所述的培养的条件为20～37℃、50～500rpm培养2～10d；
步骤(3)和步骤(4)中所述的固液分离的方法为离心或过滤；
步骤(3)中所述的筛为至少30目筛；
步骤(4)中所述的吸附的条件为于暗处恒温震荡吸附。
4.根据权利要求3所述的淀粉基多酚复合物的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的干燥的温度为35～45℃；
步骤(1)中所述的干燥的时间为4～8h；
步骤(2)中所述的培养的条件为28～32℃、160～200rpm培养6～8d；
所述的离心的条件为8000～12000rpm离心15～25min；
所述的过滤的条件为真空下过0.45～0.88μm滤膜；
所述的温度为20～60℃；
所述的震荡吸附的转速为50～500rpm；
所述的震荡吸附的时间为0～600min，不含端点0值。
5.根据权利要求1所述的淀粉基多酚复合物的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的水的用量按其与淀粉为质量比1～10：1配比；
步骤(2)中所述的红曲霉种子液的浓度为1×105～1×108个孢子/mL；
步骤(2)中所述的红曲霉种子液的接种量按培养基质体积比1～20％计算；
步骤(4)中所述的发酵后的淀粉的用量按其与多酚质量比为100：2～4进行配比。
6.根据权利要求5所述的淀粉基多酚复合物的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的红曲霉种子液通过如下步骤制备得到：采用0.1％的tween 80洗脱活化好的红曲霉菌，接种于已灭菌的液体培养基中，摇瓶培养，得到红曲霉种子液；液体培养基的配方如下:葡萄糖20g/L、酵母膏3g/L、蛋白胨10g/L、KH2PO4 4g/L、KCl 0.5g/L、FeSO4·7H2O 0.01g/L；溶剂为去离子水。
7.根据权利要求1所述的淀粉基多酚复合物的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的灭菌的条件为115～121℃灭菌15～30℃；
步骤(2)中所述的水为蒸馏水。
8.一种淀粉基多酚复合物，其特征在于：通过权利要求1～7任一项所述的制备方法得到。
9.权利要求8所述的淀粉基多酚复合物在食品领域和/或医药领域中的应用。
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