CN115232226B - 一种骆驼刺泛菌胞外多糖的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种骆驼刺泛菌胞外多糖提取方法，包括如下步骤：（1）调节驼刺泛菌胞外多糖的发酵液的pH至11~12；（2）将（1）处理后得到的发酵液在80~90℃加热下反应，静置使菌体自然沉降，弃去沉降的菌体，保留微微浑浊的上清层；（3）向（2）处理后得到的上清层中加入珍珠岩，搅拌均匀后通过板框压滤机过滤除去菌体，得到澄清的滤液；（4）向（3）处理后得到的滤液中加入去离子水进行稀释，搅拌均匀后，使用陶瓷膜过滤器进行脱盐脱色处理，当透过液pH=6.5~7，电导率≤900μs/cm后结束过滤，保留浓缩液；（5）将（4）处理后得到的浓缩液喷雾干燥，即得纯化的泛菌多糖。本发明制备的泛菌多糖，纯度≥92%，分子量≥1000 kDa，多糖易溶解。
Description
技术领域
本发明属于生物分离工程技术领域，具体涉及发酵多糖的提取方法。
背景技术
多糖是一类结构复杂的高分子聚合物，其不仅参与生命体的组成，还具备抗氧化、抗疲劳、抗辐射、抗肿瘤、降血脂、抑制炎症和调节免疫等功能效应，对富含多糖的健康营养食品需求也随之增多。时下科学技术发展迅速，已有越来越多的功能性多糖被逐步开发与利用。自然界中的多糖主要来自植物、动物和微生物。近年来，微生物多糖具备多种优点且可以通过生物技术途径从廉价的可再生原料中制备，在食品和、医疗、医美等领域开发潜力巨大，因而受到大家的密切关注。微生物多糖包括胞外多糖、胞壁多糖和胞内多糖。其中，微生物胞外多糖因无毒安全、生产周期短等特点研究较多，逐渐成为植物和动物等多糖产品的有效替代品。但由于多糖分子量大，提取过程黏度高，因此其分离纯化长期以来一直是困扰工业生产的一大难题。醇沉法是目前提取各种多糖的主流工艺，但醇沉法会破坏有些种类多糖的其溶解性能和高维构效，针对不同种类的多糖需要开发具有针对性的提取方法。
骆驼刺泛菌胞外多糖是一种新型的微生物多糖资源，其在农业(CN201810815380.2)，日化领域已表现出较好的应用前景，但其纯化过程需要消耗大量的乙醇(CN202010738964.1)，导致其下游分离成本过高，价格昂贵，严重限制了其在食品、日化等领域的应用。
发明内容
发明目的：针对骆驼刺泛菌胞外多糖分离纯化中因有机试剂用量大导致的生产成本过高的技术问题，本申请提供了一种骆驼刺泛菌胞外多糖提取方法，通过优化条件，不仅节省了有机试剂，同时制备的泛菌多糖溶解性能更佳。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种骆驼刺泛菌胞外多糖提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)调节驼刺泛菌胞外多糖的发酵液的pH至11～12；
(2)将(1)处理后得到的发酵液在80～90℃加热下反应，静置使菌体自然沉降，弃去沉降的菌体，保留微微浑浊的上清层；
(3)向(2)处理后得到的上清层中加入珍珠岩，搅拌均匀后通过板框压滤机过滤除去菌体，得到澄清的滤液；
(4)向(3)处理后得到的滤液中加入去离子水进行稀释，搅拌均匀后，使用陶瓷膜过滤器进行脱盐脱色处理，当透过液pH＝6.5～7，电导率≤900μs/cm后结束过滤，保留浓缩液；
(5)将(4)处理后得到的浓缩液喷雾干燥，即得纯化的泛菌多糖。
其中，步骤(1)所用骆驼刺泛菌为Pantoea alhagi XK-11，菌种保藏号为CGMCCNO.15525，发酵液中胞外多糖含量≥2％，分子量≥1500kDa。
步骤(1)中，反应时间为60-90min，静置6h以上。优选地，静置6-8h。
步骤(3)中，珍珠岩的加入量为上清液质量的1％～2％。
所述板框压滤机使用滤布的规格为400-600目。
优选地，步骤(4)中，加入3～4倍体积的去离子水进行稀释。
优选地，陶瓷膜孔径为10000Da。
其中，步骤(1)中，所述驼刺泛菌胞外多糖的发酵液通过如下步骤得到：
1)将在固体平板上培养的菌种接种至新鲜的LB液体培养基中，在37℃，200rpm条件下培养10-12h，获得种子液；
2)种子液以1％～8％v/v的接种量转接至泛菌多糖的发酵培养基中，发酵温度为30℃，pH控制在6.6～7.2，通气量为0.7vvm，搅拌转速为700-800rpm，发酵24h，即获得骆驼刺泛菌XK-11胞外多糖的发酵液。
其中，所述发酵培养基组成如下：蔗糖60g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、磷酸氢二钠1.9g/L和磷酸二氢钠0.792g/L，pH调至7.1。
在一种优选的实施方式中，步骤(1)中，反应时间为60-90min，静置6-8h，珍珠岩的加入量为上清液质量的1％～2％；板框压滤机使用滤布的规格为400-600目；陶瓷膜孔径为10000Da。
有益效果：本申请提出了一种针对骆驼刺泛菌胞外多糖的提取纯化工艺，通过将碱性热处理步骤、珍珠岩过滤、膜法脱色除盐等步骤有机结合，不仅节省了传统多糖提取中使用的大量有机溶剂，同时避免了有机溶剂对于骆驼刺泛菌胞外多糖结构的影响，通过该方法制备的泛菌多糖，纯度≥92％，分子量≥1000kDa，多糖易溶解。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明的保护范围之内。
实施例1骆驼刺泛菌多糖的发酵制备。
将在固体平板上培养P.alhagi XK-11接种至5L新鲜的LB液体培养基中，在37℃，200rpm条件下培养12h，获得一级种子液；
将一级种子液转接至100L LB液体培养基中，在37℃，200rpm条件下培养8h，获得二级种子液；
将二级种子液转接至10T发酵培养基中，发酵温度为30℃，pH控制在6.6～7.2，通气量为0.7vvm，搅拌转速为700rpm，发酵24h，即获得骆驼刺泛菌XK-11胞外多糖的发酵液。
上述发酵液经检测：pH＝5.0，胞外多糖含量为2.2％(质量比)，分子量为1570kDa。
实施例2不同pH处理对菌体分离和骆驼刺泛菌多糖分子量的影响。
取500mL实施例1中的发酵液14份，用浓盐酸和氢氧化钠分别调节pH为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，然后置于80℃水浴中加热60min，冷却至室温后，静置12h，观察各处理菌体沉降情况，并检测发酵液中多糖的分子量。
多糖分子量采用液相色谱仪进行检测，使用GPC色谱柱，用不同分子量的葡聚糖标准品制作分子量—出峰时间标准曲线，通过测定样品中骆驼刺泛菌多糖出峰时间，根据葡聚糖标准曲线计算骆驼刺泛菌多糖的相对分子量。结果如下表所示：
表1不同pH处理对菌体分离和骆驼刺泛菌多糖分子量
由表1可知，在实施例2的实验条件下，当pH为4～10时，加热处理不足以使菌体分层，这是由于酸度或碱度不足以破坏骆驼刺泛菌多糖的粘度，使菌体与多糖产生分层。当pH为1～3或pH为13～14时，尽管出现了明显的菌体分层，但是多糖分子量被显著破坏，这表明过酸或过碱会导致骆驼刺泛菌多糖糖苷键迅速断裂，不利于获得分子量较高的多糖。当pH为11～12时，发酵液经加热处理，既能使菌体分层，又可以使多糖分子量保留在较的范围(≥1000kDa)。
实施例3碱性热处理对发酵液过滤性能的影响。
取500mL实施例1中的发酵液2份，其中1份不做任何处理作为对照组，1份调节pH至12，80℃加热60min后，静置12h，用细软管抽取上清液约450mL作为处理组，弃掉沉降的菌体层约50mL。将对照组和处理组分别用9cm直径的布氏漏斗进行抽滤(抽滤前，漏斗上先铺一层湿滤纸，再通过抽滤的式铺一层5g重的珍珠岩)，观察抽滤的效率。
表2碱性热处理对发酵液过滤性能的影响
微生物多糖在发酵过程中往往会形成多糖包裹菌体的状态，菌体与多糖形成一层薄膜，使用过滤除菌时，因菌体在过滤介质表面堆积，使过滤表面形成一层致密的生物膜，阻碍了多糖继续透过过滤介质。因此，本发明中碱性热处理可以破坏菌体和多糖形成的包裹状态，释放菌体，通过自然沉降，将绝大部分菌体去除后，再通过过滤除菌，极大提高了过滤效率。
实施例4碱性加热时间对发酵液菌体分层和骆驼刺泛菌多糖分子量的影响。
取500mL实施例1中的发酵液5份，用氢氧化钠分别调节pH为12，然后置于80℃水浴中分别加热30min、60min、90min、120min、150min，冷却至室温后，静置12h，观察各处理菌体沉降情况，并检测发酵液中多糖的分子量。结果如下表所示。
表3碱性加热时间对发酵液菌体分层和骆驼刺泛菌多糖分子量的影响
由表3可知，加热时间太短(30min)，不足以破环多糖与菌体直接的包裹结构，形成菌体沉降，加热时间过长(＞90min)，会造成多糖分子量显著降低，因此在确保多糖分子量的基础上，加热时间以60-90min为宜。同时，加热60-90min在工业上也更容易实现和控制能耗。
实施例5碱性加热温度对发酵液菌体分层和骆驼刺泛菌多糖分子量的影响。
取500mL实施例1中的发酵液5份，用氢氧化钠分别调节pH为12，然后分别置于60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴中加热60min，冷却至室温后，静置12h，观察各处理菌体沉降情况，并检测发酵液中多糖的分子量。结果如下表所示。
表4碱性加热温度对发酵液菌体分层和骆驼刺泛菌多糖分子量的影响
由表4可知，加热温度太低(＜80℃)，不足以破环多糖与菌体直接的包裹结构，形成菌体沉降，加热温度太高(＞90℃)，会造成多糖分子量显著降低，因此在确保多糖分子量的基础上，加热温度以80-90℃为宜。
实施例6碱性加热后，静置时间的优化。
取500mL实施例1中的发酵液5份，调节pH至12，80℃加热60min后，分别静置2h、4h、6h、8h、10h，取上清液，测定600nm处的透光率，测定各处理菌体沉降情况。
表5碱性加热后，静置时间的优化
由上表可知，碱性加热处理后，至少静置6h以上，上清的透光率可达到90％以上，表明菌体沉降较好，更利于后续分离。
实施例7过滤介质对发酵液处理效率的影响。
取500mL实施例1中的发酵液2份，分别调节pH至12，80℃加热60min后，静置12h，用细软管抽取上清液约450mL用于后续处理，弃掉沉降的菌体层约50mL。将两份上清液分别用9cm直径的布氏漏斗进行抽滤，抽滤前，漏斗上先铺一层湿滤纸，再通过抽滤的方式铺一层5g重的助滤介质，其中一份上清液使用硅藻土作为助滤介质，另一份上清液使用珍珠岩作为助滤介质，两种助滤介质均为200目颗粒大小，观察抽滤的效率。
表6不同助滤介质对发酵液过滤性能的影响
上表说明，与硅藻土相比，珍珠岩是相对于泛菌多糖发酵液更为惰性的过滤介质，更适合高效过滤该发酵液。
实施例8纯化工艺对骆驼刺泛菌多糖溶解性能的影响
取1L实施例1中的发酵液，调节pH至12，80℃加热60min后，静置6h，用细软管抽取上清液约900mL用于后续处理，弃掉沉降的菌体层约100mL。将上清液分为对照组(450mL)和处理组(450mL)，分别用9cm直径的布氏漏斗进行抽滤(抽滤前，漏斗上先铺一层湿滤纸，再通过抽滤的式铺一层5g重的珍珠岩)，得到澄清的滤液，两份滤液分别做如下处理：
处理1：向滤液中加入3倍体积的无水乙醇，获得白色沉淀，离心去除乙醇后，每次加入原上清液1/3体积的乙醇溶液(70％)清洗沉淀，至洗涤液无色后，将白色沉淀于80℃烘干，即得到纯化的泛菌多糖；
处理2：滤液中加入3倍体积的去离子水进行稀释，搅拌均匀后，使用陶瓷膜过滤器进行脱盐脱色处理，其中陶瓷膜孔径为10000Da，当透过液pH＝6.5～7，电导率≤900μs/cm后结束过滤，保留浓缩液；最后将浓缩液喷雾干燥，即得纯化的泛菌多糖。
分别配制1％浓度的多糖溶液，在磁力搅拌器上以同一搅拌转速搅拌至完全溶解，对比两种纯化多糖的溶液的溶解效率，如下表所示。
表7不同纯化工艺对骆驼刺泛菌多糖溶解性能的影响
醇沉法是目前提取各种多糖的主流工艺，但是由上表可知，醇沉法脱色除盐提取的泛菌多糖溶解较慢，溶解性能差。通过膜法脱色除盐后用喷雾干燥制备的泛菌多糖溶解性能更佳。这可能是由于醇沉过程，乙醇改变了泛菌多糖的高维构效，降低了其溶解性能
本发明提供了一种骆驼刺泛菌胞外多糖的提取的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (2)
1.一种骆驼刺泛菌胞外多糖提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）调节驼刺泛菌胞外多糖的发酵液的pH至11~12，所用骆驼刺泛菌为Pantoea alhagiXK-11，菌种保藏号为CGMCC NO.15525，发酵液中胞外多糖含量≥2%，分子量≥1500 kDa；
（2）将（1）处理后得到的发酵液在80~90℃加热下反应，反应时间为60-90min，静置6h以上，静置使菌体自然沉降，弃去沉降的菌体，保留微微浑浊的上清层；
（3）向（2）处理后得到的上清层中加入珍珠岩，搅拌均匀后通过板框压滤机过滤除去菌体，得到澄清的滤液；
（4）向（3）处理后得到的滤液中加入去离子水进行稀释，搅拌均匀后，使用陶瓷膜过滤器进行脱盐脱色处理，当透过液pH=6.5~7，电导率≤900 μs/cm后结束过滤，保留浓缩液；
（5）将（4）处理后得到的浓缩液喷雾干燥，即得纯化的泛菌多糖；
其中，步骤（1）中，所述驼刺泛菌胞外多糖的发酵液通过如下步骤得到：
1）将在固体平板上培养的菌种接种至新鲜的LB液体培养基中，在37℃，200 rpm条件下培养10-12 h，获得种子液；
2）种子液以1%~8%v/v的接种量转接至泛菌多糖的发酵培养基中，发酵温度为30 ℃，pH控制在6.6~7.2，通气量为0.7 vvm，搅拌转速为700-800 rpm，发酵24 h，即获得骆驼刺泛菌XK-11胞外多糖的发酵液；
所述发酵培养基组成如下：蔗糖 60 g/L、蛋白胨 10 g/L、NaCl 10 g/L、磷酸氢二钠1.9 g/L和磷酸二氢钠 0.792 g/L，pH调至7.1；
步骤（2）中，反应时间为60-90min，静置6-8h，珍珠岩的加入量为上清液质量的1%~2%；板框压滤机使用滤布的规格为400-600目；陶瓷膜孔径为10000 Da。
2.根据权利要求1所述的骆驼刺泛菌胞外多糖提取方法，其特征在于，步骤（4）中，加入3~4倍体积的去离子水进行稀释。
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