CN108220364B - 一种固液双相酶解与超滤联用制备超低分子量透明质酸寡糖及其盐的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固液双相酶解与超滤联用制备超低分子量透明质酸寡糖及其盐的方法，该方法利用芽孢杆菌产生的透明质酸酶降解透明质酸及其盐，采用固液双相酶解与超滤系统联用的方法制得高浓度透明质酸酶解液，进而通过灭活、活性炭吸附除杂、过滤、喷雾干燥得到分子量≤3kDa的超低分子量透明质酸寡糖及其盐。本发明所得产品稳定性好、分子量超低，抗炎、透皮吸收性好、纯度高、无细胞毒性、抗氧化能力强，具有皮肤细胞损伤修复等优点，可广泛应用在化妆品、食品及医药领域。该方法工艺流程操作简单，条件温和，不使用各种醇，能耗相对较低，对产品结构无破坏，无环境污染，适合大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶切法制备透明质酸寡糖及其盐的工艺，特别是涉及一种固液双相酶解与超滤联用制备具有超低分子量的透明质酸寡糖及其盐的方法，属于透明质酸技术领域。
背景技术
透明质酸(hyaluronic acid，HA)是一种酸性黏多糖，是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位通过β-(1→4)糖苷键和β-(1→3)糖苷键构成的无分支高分子糖胺聚糖，存在于动物组织细胞间质和某些细菌的荚膜中。透明质酸广泛用于医药、化妆品、食品等领域，分子量一般为105~107Da（道尔顿）。寡聚透明质酸是指分子量小于10kDa的透明质酸，而超低分子量透明质酸寡糖主要是指分子量≤3kDa的透明质酸盐。
不同分子量的透明质酸表现出不同的生物活性，低分子量透明质酸甚至表现出与高分子量透明质酸完全相反的活性。很多文献都对透明质酸在创伤修复中发挥的作用进行了报道，尤其是低分子量及透明质酸寡糖作为活性物质受到更多关注。
有研究认为，当透明质酸的分子量降低至寡糖的水平时（10kDa以下），透明质酸寡糖能够抑制细胞炎性因子的产生，防止创伤愈合过程中产生过度的炎症反应（Kim M Y,Muto J, Gallo R L. Hyaluronic Acid Oligosaccharides Suppress TLR3-DependentCytokine Expression in a TLR4-Dependent Manner[J]. Plos One, 2013, 8(8):65-65）。也有文献报道，对于由人体皮肤对正常的外部环境刺激产生过度的炎症反应引起的红斑痤疮，透明质酸寡糖能够抑制皮肤产生抗菌肽，减轻炎症反应（Lee H, Lee S. 263Hyaluronic acid oligosaccharides suppress cytokine expression induced bycathelicidine peptides[J]. Journal of Investigative Dermatology, 2016, 136(9):S206-S206）。
目前，分子量≤3kDa的超低分子量透明质酸寡糖通常采用生物酶解法进行降解得到，而物理法或化学法降解无法获得超低分子量透明质酸寡糖。酶解法降解透明质酸具有只断裂单糖分子间的糖苷键、不会对结构造成破坏、反应条件温和、制备的透明质酸寡糖不会发生褐变、不会造成环境污染的优点。但是，随着降解所得的透明质酸的分子量的降低，降解过程所需的酶量会越来越多，酶解法制备透明质酸寡糖需要的酶量远远大于制备低分子量透明质酸所需要的酶量，而商品化的透明质酸酶价格高昂，因此一直无法进行大规模工业化生产制备透明质酸寡糖。
此外，透明质酸作为高分子多糖，其溶液黏度随着分子量、浓度的升高而升高，在酶解过程中，透明质酸加入酶解液中容易形成外部液体内部固体的包块，透明质酸分散过程耗时耗力。同时，高浓度透明质酸溶液会形成一种致密的弹性体，阻碍透明质酸酶与透明质酸的构象转变，影响底物透明质酸与透明质酸酶活性中心的结合，降低酶解速率，需要加入更多的透明质酸酶才能将高分子透明质酸降解至目标分子量。
发明内容
针对超低分子量透明质酸寡糖制备存在的不足，本发明提供了一种固液双相酶解与超滤联用制备超低分子量透明质酸寡糖（≤3kDa）及其盐的方法，该方法采用固液双相酶解，透明质酸不会形成包块和致密弹性体，提高了酶解速率，同时酶解后期与超滤联用，将部分超低分子量透明质酸寡糖持续分离出来，降低了酶的用量，大大降低了生产成本。
本发明采用申请人自行筛选的芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50（保藏号CGMCC NO.5744）发酵纯化得到的透明质酸酶为生物酶对高分子量透明质酸或其盐进行降解，该酶酶活高，热稳定性和pH稳定性高，可以采用工业化生产的方法获得，用其制备超低分子量透明质酸寡糖及其盐可以使生产成本得到有效的降低。酶解过程是：前期先采用固液双相酶解得到高浓度透明质酸及其盐的酶解液，酶解后期将酶解与超滤联用，边酶解边通过超滤将产生的超低分子量的透明质酸寡糖及其盐从体系中分离出来，最后经灭活、过滤、喷雾干燥得到超低分子量透明质酸寡糖及其盐。该方法大幅度提高了酶解效率，降低了透明质酸酶的用量，生产成本低，为酶解法制备超低分子量透明质酸寡糖及其盐的工业化大规模生产提供了有效的技术支持。
本发明具体技术方案如下：
一种固液双相酶解与超滤联用制备超低分子量透明质酸寡糖及其盐的方法，该方法包括以下步骤：
（1）酶解缓冲液准备：调节纯化水pH为4~9、温度为20~48℃，然后加入芽孢杆菌透明质酸酶，配成酶解缓冲液；
（2）固液双相酶解：在搅拌下向酶解缓冲液中加入氧化锆分散珠，再快速加入高分子量的透明质酸或其盐固体至其质量体积浓度为5~25%，搅拌混匀，得到透明质酸-酶解液固液双相酶解体系；在搅拌下酶解至固液双相酶解体系转变为液液单相酶解体系后，再次快速加入高分子量的透明质酸或其盐固体至其质量体积浓度为5~25%，搅拌混匀形成透明质酸-酶解液固液双相酶解体系，继续搅拌酶解，直至固液双相酶解体系转变为液液单相酶解体系；
（3）超滤：酶解体系变为液液单相酶解体系时，将酶解反应液与超滤系统连接，边超滤边酶解，直至酶解反应液中的透明质酸或其盐的分子量≤3kDa，控制超滤条件使酶解结束时超滤滤出的清液为酶解反应液的40-60%；
（4）后处理：合并超滤滤出的清液和剩余的酶解反应液，进行灭活、活性炭吸附、过滤处理，过滤所得滤液进行喷雾干燥，得到分子量≤3kDa的超低分子量透明质酸寡糖及其盐（简称透明质酸寡糖及其盐，下同）。
本发明方法中，所用的芽孢杆菌透明质酸酶为芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50CGMCC NO.5744纯化得到的透明质酸酶，该酶的制备在专利CN201210317032.5中有详细的记载，该透明质酸酶对透明质酸有很好的降解性，通过控制酶解条件可以得到所需分子量的透明质酸。该透明质酸酶酶活高，纯化得到的芽孢杆菌透明质酸酶的比活为8×106~1.5×107IU/mg。
进一步的，步骤（2）中，所述高分子量的透明质酸及其盐固体的分子量大于10kDa，例如10-1000kDa，优选为100kDa~1000kDa或300~1000kDa。所述高分子量的透明质酸的盐为透明质酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐或锌盐。
进一步的，酶解液中芽孢杆菌透明质酸酶的用量与步骤（2）中加入的高分子量的透明质酸或其盐固体的总质量的关系为：每降解1kg分子量大于10kDa的透明质酸或其盐固体需要4×105~1×106IU的芽孢杆菌透明质酸酶。
进一步的，本发明将高分子量的透明质酸及其盐固体快速加入酶解液中，使透明质酸及其盐在固液双相状态下发生酶解，能更好的与透明质酸酶接触，提高酶解速率。本发明在酶解体系中加入氧化锆分散珠，并全程在搅拌下进行，控制搅拌速度结合分散珠的分散作用，透明质酸盐及其盐固体不会在加入过程中产生包块，在后期降解过程中也不会形成致密的弹性体。优选的，步骤（2）中，在30-40rmp的搅拌速度下加入高分子量的透明质酸及其盐固体，加入后再在此速度下搅拌3-5min，然后将搅拌速度调整为15-20rpm并一直保持该搅拌速度进行固液双相酶解。步骤（3）中，当超滤与酶解联用后，将酶解搅拌速度调整为80-100rpm。
优选的，每次加入高分子量的透明质酸及其盐固体时，加入时间控制在5-15min内。
进一步的，步骤（2）中，每升酶解缓冲液中加入1~2g分散珠。
优选的，步骤（2）中，分两次加入高分子量的透明质酸及其盐固体，每次高分子量的透明质酸及其盐固体的加入量在体系中的质量体积浓度为5~25%（该浓度以N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖的质量体积浓度计），最终酶解得到的酶解液中超低分子量的透明质酸寡糖及其盐的质量体积浓度约为10-50%（该浓度以N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖的质量体积浓度计）。优选的，每次高分子量的透明质酸及其盐固体的加入量在体系中的质量体积浓度为10~18%（该浓度以N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖的质量体积浓度计），最终酶解得到的酶解液中超低分子量的透明质酸寡糖及其盐的质量体积浓度约为30~50%（该浓度以N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖的质量体积浓度计）。
进一步的，固液双相酶解步骤（2）中，为了保证高分子量的透明质酸及其盐固体的良好分散，其分两次加入，第一次加入时，进行固液双相酶解，酶解时间一般为0.5-2h，当酶解体系变为液液单相体系时，第二次加入高分子量的透明质酸及其盐固体。第二次加入后，先进行固液双相酶解，时间一般为0.5-2h，当变为液液单相体系时，将酶解与超滤联用，边酶解边超滤。
进一步的，步骤（2）中，酶解温度为20~48℃，优选为30~45℃，酶解pH为4-9，优选为5.5~7.5。
进一步的，步骤（3）中，酶解与超滤联用时，将酶解反应液与超滤系统连接，边超滤边酶解，超滤的温度和pH保持和酶解一致。本发明所用超滤系统采用市场上常规的超滤系统即可，超滤时控制超滤膜的截留分子量为3kDa。超滤的目的是将体系中形成的分子量≤3kDa的超低分子量的透明质酸寡糖及其盐从酶解体系中缓慢分离出来，以减少产品对透明质酸酶的抑制，降低酶的用量，超滤速度不易过快，过快会使体系中透明质酸浓度过高，降低酶解速度，过慢又起不到很好的解除产物对酶抑制的目的。经过大量实验，控制流速、压力等条件保证酶解结束时超滤滤出的清液体积为酶解反应液体积的40-60%时效果最佳。
进一步的，步骤（3）中，超滤联合酶解所需的时间大约为1-6h，步骤（2）中两次固液双相酶解的时间大约为1-4h，整个酶解过程耗时大约4-10h。
进一步的，酶解后的酶解液需要经过后处理才能得到分子量≤3kDa的超低分子量透明质酸寡糖及其盐产品，后处理主要指灭活、活性炭吸附、过滤、喷雾干燥。具体的后处理操作如下：
灭活：合并超滤滤出的清液和剩余的酶解反应液，在50~90℃下保持10~60min，对芽孢杆菌透明质酸酶进行灭活；
活性炭吸附：向灭活的料液中加入质量体积浓度为0.1~10%的活性炭，在50~90℃下搅拌10~60min；
过滤：将活性炭吸附后的料液先用板框过滤机过滤，再用孔径为0.22µm的聚丙烯滤芯过滤，得滤液；
喷雾干燥：将滤液进行喷雾干燥，进风温度设定值：150℃~180℃，出风温度设定值：70℃~90℃，进料速度：30L/h~50L/h（优选40-45L/h）。
本发明方法最终能获得超低分子量的透明质酸寡糖及其盐，该产品为白色粉末，分子量为≤3kDa，例如1.4-2.8kDa，含量大于95%，其0.1%水溶液的pH在5~7之间。本发明所得超低分子量的透明质酸寡糖及其盐稳定性好，分子量超低，抗炎、透皮吸收性好，纯度高、无细胞毒性、抗氧化能力强，具有皮肤细胞损伤修复等优点，在食品、化妆品或医药领域均有很好的应用前景。
本发明利用芽孢杆菌产生的透明质酸酶降解透明质酸或其盐，采用固液双相酶解体系酶解，并与超滤系统联用，边酶解边超滤，酶解液经过灭酶、活性炭吸附除杂、过滤、喷雾干燥得到超低分子量的透明质酸寡糖及其盐产品。与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明操作简单，条件温和，不使用各种醇，无环境污染，能耗相对较低，而且发酵来源的透明质酸酶可工业化大生产，成本低。
2、本发明采用固液双相酶解体系酶解，并与超滤系统联用，解决了高粘度透明质酸溶液酶解缓慢、用酶量高、无法有效降解的难题，适合大规模工业化生产。酶解所得酶解液中透明质酸浓度高，纯度好，酶解液经过过滤后可直接进行喷雾干燥制得固体产品，对产品结构无破坏，无环境污染，适合大规模工业化生产。
3、本发明所得产物分子量低、稳定性好、透皮吸收性好、纯度高、无细胞毒性，抗炎、抗氧化能力强，能够促进皮肤细胞损伤修复，可用在化妆品、食品及医药领域，前景广阔。
保藏信息
本发明芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50已于2012年2月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC NO. 5744。
附图说明
图1为透明质酸钠的红外图谱，其中A为实施例7的透明质酸寡糖钠盐的红外图谱，B为透明质酸钠的欧洲药典标准图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例和实验例，进一步详细说明本发明。如无特别说明，下述实施例中硫酸铵的浓度为质量体积浓度。
下述实施例中，超低分子量的透明质酸寡糖及其盐的分子量测定采用Laurent法，含量测定采用HPLC法，透明质酸寡糖与普通透明质酸都是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位构成的，因此它们的含量等于双糖的含量，可以用芽孢杆菌透明质酸酶将寡聚透明质酸或普通透明质酸降解成双糖，通过HPLC法测定双糖含量，得到透明质酸寡糖的含量。
实施例1
向1m3不锈钢溶解罐中加入1m3纯化水，升温至20℃，调节pH为4.5，边搅拌边向该溶解罐中加入4.8×107IU的芽孢杆菌透明质酸酶， 搅拌5min后，加入直径1.8-2.0mm的氧化锆分散珠1kg，调整搅拌速度为30-40rmp，然后快速加入分子量为20kDa的透明质酸钾60kg，加入时间为2min，加入后继续在此速度下搅拌3-5min，然后将搅拌转速调整至15-20rpm，搅拌均匀，得到透明质酸-酶解液固液双相酶解体系；在15-20rpm下酶解0.5h后，再次调整转速为30-40rmp，加入分子量为20kDa的透明质酸钾60kg，加入时间为3min，加入后搅拌3-5min，将转速调整至15-20rpm，搅拌均匀，得透明质酸固液双相酶解体系；在15-20rpm下酶解0.5h后酶解体系变为液液双相体系；将搅拌转速调至80-100rpm，然后与超滤系统联用，采用截留分子量为3kDa的膜包，边超滤边酶解，直至所有透明质酸分子量均降至3kDa以下；超滤时控制超滤滤出液流速，使超滤滤出的清液的量为420L。
固液双相酶解和超滤酶解总耗时约8h。合并超滤系统滤出的清液及截留液（即剩余的酶解液），混合料液中透明质酸浓度（以双糖计）约12%，将温度升高至50℃，维持40min；加入5kg 活性炭，维持60min，然后先用板框过滤机过滤，再用0.22μm聚丙烯滤膜过滤，所得滤液进行喷雾干燥，喷雾干燥设定进风温度160℃，设定出风温度80℃，设定进料速度40L/h。喷雾干燥得到的透明质酸寡糖钾盐为白色粉末，含量98.8%，分子量2.8kDa，pH6.5，其红外图谱与欧洲药典标准图谱一致。
实施例2
向1m3不锈钢溶解罐中加入1m3纯化水，升温至30℃，调节pH为4.0，边搅拌边向该溶解罐中加入5.6×107IU的芽孢杆菌透明质酸酶， 搅拌5min后，加入直径1.8-2.0mm的氧化锆分散珠1kg，调整搅拌速度为30-40rmp，然后加入分子量为10kDa的透明质酸钙70kg，加入时间为1-2min，加入后继续在此速度下搅拌3-5min，然后将搅拌转速调整至15-20rpm，搅拌均匀，得到透明质酸-酶解液固液双相酶解体系；在15-20rpm下酶解0.5h后，再次调整转速为30-40rmp，加入分子量为10kDa的透明质酸钙70kg，加入时间为2-3min，加入后搅拌3-5min，将搅拌转速调整至15-20rpm，搅拌均匀，得透明质酸固液双相酶解体系；在15-20rpm下酶解0.5h后酶解体系变为液液双相体系；将搅拌转速调至80-100rpm，然后与超滤系统联用，采用截留分子量为3kDa的膜包，边超滤边酶解，直至所有透明质酸分子量均降至3kDa以下；超滤时控制超滤滤出液流速，使超滤滤出的清液的量为400L。
固液双相酶解和超滤酶解总耗时约7.5h。合并超滤系统滤出的清液及截留液（即剩余的酶解液），混合料液中透明质酸浓度（以双糖计）约14%，将温度升高至55℃，维持35min；加入1kg 活性炭，维持20min，然后先用板框过滤机过滤，再用0.22μm聚丙烯滤膜过滤，所得滤液进行喷雾干燥，喷雾干燥设定进风温度170℃，设定出风温度75℃，设定进料速度35L/h。喷雾干燥得到的透明质酸寡糖钙盐为白色粉末，含量99.9%，分子量1.7kDa，pH6.8，其红外图谱与欧洲药典标准图谱一致。
实施例3
向1m3不锈钢溶解罐中加入1m3纯化水，升温至35℃，调节pH为5.0，边搅拌边向该溶解罐中加入1.2×108IU的芽孢杆菌透明质酸酶，搅拌5min后，加入直径1.8-2.0mm的氧化锆分散珠1.4kg，调整搅拌速度为30-40rmp，然后加入分子量为300kDa的透明质酸钠100kg，加入时间为2-3min，加入后继续在此速度下搅拌3-5min，然后将搅拌转速调整至15-20rpm，搅拌均匀，得透明质酸-酶解液固液双相酶解体系；在15-20rpm下酶解1h后，再次调整转速为30-40rmp，加入分子量为300kDa的透明质酸钠100kg，加入时间为3-4min，加入后搅拌3-5min，将搅拌转速调整至15-20rpm，搅拌均匀，得透明质酸固液双相酶解体系；在20rpm下酶解1h后酶解体系变为液液双相体系；将搅拌转速调至80-100rpm，然后与超滤系统联用，采用截留分子量为3kDa的膜包，边超滤边酶解，直至所有透明质酸分子量均降至3kDa以下；超滤时控制超滤滤出液流速，使超滤滤出的清液的量为440L。
固液双相酶解和超滤酶解总耗时约8.5h。合并超滤系统滤出的清液及截留液（即剩余的酶解液），混合料液中透明质酸浓度（以双糖计）约20%；将温度升高至60℃，维持35min，加入20kg 活性炭，维持30min，然后先用板框过滤机过滤，再用0.22μm聚丙烯滤膜过滤，所得滤液进行喷雾干燥，喷雾干燥设定进风温度180℃，设定出风温度90℃，设定进料速度50L/h。喷雾干燥得到的透明质酸寡糖钠盐为白色粉末，含量99.5%，分子量1.4kDa，pH5.9，其红外图谱与欧洲药典标准图谱一致。
实施例4
向1m3不锈钢溶解罐中加入1m3纯化水，升温至35℃，调节pH为5.5，边搅拌边向该溶解罐中加入2.1×108IU的芽孢杆菌透明质酸酶， 搅拌5min后，加入直径1.8-2.0mm的氧化锆分散珠2kg，调整搅拌速度为30-40rmp，然后加入分子量为500kDa的透明质酸锌150kg，加入时间为4-5min，加入后继续在此速度下搅拌3-5min，然后将搅拌转速调整至15-20rpm，搅拌均匀，得透明质酸固液双相酶解体系；在15-20rpm下酶解1.5h后，再次调整转速为30-40rmp，加入分子量为500kDa的透明质酸锌150kg，加入时间为5-6min，加入后搅拌3-5min，将搅拌转速调整至15-20rpm，搅拌均匀，得透明质酸固液双相酶解体系；在15-20rpm下酶解1.5h后酶解体系变为液液双相体系；将搅拌转速调至80-100rpm，然后与超滤系统联用，采用截留分子量为3kDa的膜包，边超滤边酶解，直至所有透明质酸分子量均降至3kDa以下；超滤时控制超滤滤出液流速，使超滤滤出的清液的量为410L。
固液双相酶解和超滤酶解总耗时约7h。合并超滤系统滤出的清液及截留液（即剩余的酶解液），混合料液中透明质酸浓度（以双糖计）约30%；将温度升高至80℃，维持50min，加入100kg 活性炭，维持40min，然后先用板框过滤机过滤，再用0.22μm聚丙烯滤膜过滤，所得滤液进行喷雾干燥，喷雾干燥设定进风温度175℃，设定出风温度85℃，设定进料速度45L/h。喷雾干燥得到的透明质酸寡糖锌盐为白色粉末，含量98.9%，分子量1.9kDa，pH5.7，其红外图谱与欧洲药典标准图谱一致。
实施例5
向1m3不锈钢溶解罐中加入1m3纯化水，升温至45℃，调节pH为8.5，边搅拌边向该溶解罐中加入3.2×108IU的芽孢杆菌透明质酸酶，搅拌5min后，加入直径1.8-2.0mm的氧化锆分散珠1.5kg，调整搅拌速度为30-40rmp，然后加入分子量为1000kDa的透明质酸镁160kg，加入时间为7-10min，加入后继续在此速度下搅拌3-5min，然后将搅拌转速调整至15-20rpm，搅拌均匀，得透明质酸固液双相酶解体系；在15-20rpm下酶解2h后，再次调整转速为30-40rmp，加入分子量为1000kDa的透明质酸镁160kg，加入时间为7-10min，加入后搅拌3-5min，将搅拌转速调整至15-20rpm，搅拌均匀，得透明质酸固液双相酶解体系；在15-20rpm下酶解2h后酶解体系变为液液双相体系；将搅拌转速调至80-100rpm，然后与超滤系统联用，采用截留分子量为3kDa的膜包，边超滤边酶解，直至所有透明质酸分子量均降至3kDa以下；超滤时控制超滤滤出液流速，使超滤滤出的清液的量为550L。
固液双相酶解和超滤酶解总耗时约10h。合并超滤系统滤出的清液及截留液（即剩余的酶解液），混合料液中透明质酸浓度（以双糖计）约20%；将温度升高至90℃，维持15min，加入80kg 活性炭，维持10min，然后先用板框过滤机过滤，再用0.22μm聚丙烯滤膜过滤，所得滤液进行喷雾干燥，喷雾干燥设定进风温度165℃，设定出风温度90℃，设定进料速度30L/h。喷雾干燥得到的透明质酸寡糖镁盐为白色粉末，含量99.0%，分子量2.6kDa，pH6.3，其红外图谱与欧洲药典标准图谱一致。
实施例6
向1m3不锈钢溶解罐中加入1m3纯化水，升温至48℃，调节pH为9.0，边搅拌边向该溶解罐中加入2.5×108IU的芽孢杆菌透明质酸酶，搅拌5min后，加入直径1.8-2.0mm的氧化锆分散珠2kg，调整搅拌速度为30-40rmp，然后加入分子量为40kDa的透明质酸钙250kg，加入时间为2-3min，加入后继续在此速度下搅拌3-5min，然后将搅拌转速调整至15-20rpm，搅拌均匀，得透明质酸固液双相酶解体系；在15-20rpm下酶解1h后，再次调整转速为30-40rmp，加入分子量为40kDa的透明质酸钙200kg，加入时间为3-4min，加入后搅拌3-5min，将搅拌转速调整至15-20rpm，搅拌均匀，得透明质酸固液双相酶解体系；在15-20rpm下酶解1h后酶解体系变为液液双相体系；将搅拌转速调至80-100rpm，然后与超滤系统联用，采用截留分子量为3kDa的膜包，边超滤边酶解，直至所有透明质酸分子量均降至3kDa以下；超滤时控制超滤滤出液流速，使超滤滤出的清液的量为480L。
固液双相酶解和超滤酶解总耗时约7h。合并超滤系统滤出的清液及截留液（即剩余的酶解液），混合料液中透明质酸浓度（以双糖计）约40%；将温度升高至85℃，维持60min，加入70kg 活性炭，维持50min，然后先用板框过滤机过滤，再用0.22μm聚丙烯滤膜过滤，所得滤液进行喷雾干燥，喷雾干燥设定进风温度150℃，设定出风温度70℃，设定进料速度38L/h。喷雾干燥得到的透明质酸寡糖钙盐为白色粉末，含量99.7%，分子量1.75kDa，pH5.6，其红外图谱与欧洲药典标准图谱一致。
实施例7
向1m3不锈钢溶解罐中加入1m3纯化水，升温至44℃，调节pH为6.0，边搅拌边向该溶解罐中加入1.4×108IU的芽孢杆菌透明质酸酶， 搅拌5min后，加入直径1.8-2.0mm的氧化锆分散珠1.7kg，调整搅拌速度为30-40rmp，然后加入分子量为800kDa的透明质酸钠170kg，加入时间为5-7min，加入后继续在此速度下搅拌3-5min，然后将搅拌转速调整至15-20rpm，搅拌均匀，得透明质酸固液双相酶解体系；在15-20rpm下酶解1.5h后，再次调整转速为30-40rmp，加入分子量为800kDa的透明质酸钠170kg，加入时间为6-8min，加入后搅拌3-5min，将搅拌转速调整至15-20rpm，搅拌均匀，得透明质酸固液双相酶解体系；在15-20rpm下酶解1.5h后酶解体系变为液液双相体系；将搅拌转速调至80-100rpm，然后与超滤系统联用，采用截留分子量为3kDa的膜包，边超滤边酶解，直至所有透明质酸分子量均降至3kDa以下；超滤时控制超滤滤出液流速，使超滤滤出的清液的量为580L。
固液双相酶解和超滤酶解总耗时约9h。合并超滤系统滤出的清液及截留液（即剩余的酶解液），混合料液中透明质酸浓度（以双糖计）约34%；将温度升高至58℃，维持30min，加入45kg 活性炭，维持25min，然后先用板框过滤机过滤，再用0.22μm聚丙烯滤膜过滤，所得滤液进行喷雾干燥，喷雾干燥设定进风温度175℃，设定出风温度80℃，设定进料速度42L/h。喷雾干燥得到的透明质酸寡糖钠盐为白色粉末，含量99.3%，分子量2.75kDa，pH6.5，其红外图谱与欧洲药典标准图谱一致。
比较例1
向1m3不锈钢溶解罐中加入1m3纯化水，升温至44℃，调节pH为6.0，加入直径1.8-2.0mm的氧化锆分散珠1.7kg，调整搅拌速度为30-40rmp，边搅拌边向该溶解罐中加入80kg分子量为800kDa的透明质酸钠，加入时缓慢少量加入，建议每次0.1-0.12kg，耗时约5-8h，搅拌速度为40rpm，直至完全溶解，耗时约3-5h。边搅拌边向该溶解罐中加入4×107IU的芽孢杆菌透明质酸酶，将搅拌转速调至80-100rpm，酶解约2-3h后与超滤系统联用，采用截留分子量为3kDa的膜包，边超滤边酶解，直至所有透明质酸分子量均降至3kDa以下；超滤时控制超滤滤出液流速，使超滤滤出的清液的量为580L。
整个酶解过程耗时约16-20h。收集超滤系统滤出液及循环体系的截留液混合，最终料液浓度约8%；将温度升高至58℃，维持30min，加入20kg 活性炭，维持25min，用0.22μm聚丙烯滤膜过滤酶解液。喷雾干燥设定进风温度175℃，设定出风温度80℃，进料速度42L/h。该透明质酸寡糖钠盐为白色粉末，含量98.7%，分子量2.84kDa，pH6.5，其红外图谱与欧洲药典标准图谱一致。
比较例2
向1m3不锈钢溶解罐中加入1m3纯化水，升温至44℃，调节pH为6.0，加入直径1.8-2.0mm的氧化锆分散珠1.7kg，调整搅拌速度为30-40rmp，边搅拌边向该溶解罐中加入80kg分子量为800kDa的透明质酸钠，加入时缓慢少量加入，加入耗时约5-6h，加入过程中形成大量致密的透明质酸包块，搅拌至完全溶解，耗时约15-24h。边搅拌边向该溶解罐中加入4×107IU的芽孢杆菌透明质酸酶，将搅拌转速调至80-100rpm，酶解约2-3h后与超滤系统联用，采用截留分子量为3kDa的膜包，边超滤边酶解，直至所有透明质酸分子量均降至3kDa以下；超滤时控制超滤滤出液流速，使超滤滤出的清液的量为580L。
整个酶解过程耗时约30-40h。收集超滤系统滤出液及循环体系的截留液混合，最终料液浓度约8%；将温度升高至58℃，维持30min，加入20kg 活性炭，维持25min，用0.22μm聚丙烯滤膜过滤酶解液。喷雾干燥设定进风温度175℃，设定出风温度80℃，进料速度42L/h。该透明质酸寡糖钠盐为白色粉末，含量98.7%，分子量2.79kDa，pH6.5，其红外图谱与欧洲药典标准图谱一致。
比较例3
向1m3不锈钢溶解罐中加入1m3纯化水，升温至44℃，调节pH为6.0，边搅拌边向该溶解罐中加入2.2×108IU的芽孢杆菌透明质酸酶， 搅拌5min后，加入直径1.8-2.0mm的氧化锆分散珠1.7kg，调整搅拌速度为30-40rmp，然后加入分子量为800kDa的透明质酸钠170kg，加入时间为5-7min，加入后继续在此速度下搅拌3-5min，然后将搅拌转速调整至15-20rpm，搅拌均匀，得透明质酸固液双相酶解体系；在15-20rpm下酶解1.5h后，再次调整转速为30-40rmp，加入分子量为800kDa的透明质酸钠170kg，加入时间为6-8min，加入后搅拌3-5min，将搅拌转速调整至15-20rpm，搅拌均匀，得透明质酸固液双相酶解体系；在15-20rpm下酶解1.5h后酶解体系变为液液双相体系。将搅拌转速调至80-100rpm，继续酶解至3kDa以下，整个酶解工艺耗时约14h。将温度升高至58℃，维持30min，加入45kg 活性炭，维持25min，用0.22μm聚丙烯滤膜过滤酶解液。喷雾干燥设定进风温度175℃，设定出风温度80℃，进料速度42L/h。该透明质酸寡糖钠盐为白色粉末，含量99.5%，分子量2.92kDa，pH6.5，其红外图谱与欧洲药典标准图谱一致。
本发明所得超低分子量的透明质酸寡糖及其盐为白色粉末或颗粒，分子量为≤3kDa，含量大于95%，其0.1%水溶液的pH在6~8之间，红外图谱与欧洲药典标准图谱一致，性能良好，结构未被破坏。该产品抗炎、透皮吸收性好，纯度高、无细胞毒性、抗氧化能力强，具有皮肤细胞损伤修复等优点，下面以实施例2、3、7所得的透明质酸寡糖盐为例，说明本发明产品的部分性能。
一、透明质酸寡糖及其盐的细胞毒性研究
试验采用人角质形成细胞HaCaT作为观察细胞，DMEM培养基（Gibco）添加10%胎牛血清作为完全培养基，阴性对照为不添加任何供试样品的完全培养基，阳性对照为5g/L苯酚溶液（溶于完全培养基），空白对照为无细胞完全培养基，供试品为完全培养基加实施例3或7所得的透明质酸寡糖钠盐样品。按下式计算相对增殖率（RGR）。
式中：
RGR——相对增殖率，%；
A——供试品组（阴性、阳性组）吸光度，扣除空白；
A 0 ——阴性对照组吸光度，扣除空白。
细胞毒性根据RGR按表1分级标准确定级别。测试结果如表2所示，阳性对照组至少为3级反应，供试品细胞毒性反应程度不大于2级时，认为其细胞毒性可接受。
结果表明，本发明方法制备的透明质酸寡糖及其盐在在0.25%～3.0%的浓度下，对人表皮角质形成细胞HaCaT的细胞毒性均质可接受的范围内，即可以认为没有明显细胞毒性，在低浓度下，反而有一定的促进表皮角质形成增殖的作用。
二、透明质酸寡糖及其盐的抗炎效果研究
以Balbc3T3小鼠胚胎成纤维细胞为模式细胞，通过LPS刺激，使其分泌炎性因子，用不同分子量的HA进行处理，通过定量检测培养上清中炎性因子的表达，考察不同分子量的HA对炎性因子释放的抑制作用。考察的因子包括： IL-6、TGF-β1。检测方法为ELISA法。
实验样品有透明质酸二糖（实验室制备20151129），实施例2样品（透明质酸寡糖钙盐，1.7kDa），实施例7样品（透明质酸寡糖钠盐，2.75kDa），纳诺HA（miniHA，1605121，8.5kDa），寡聚HA（oligoHA, 酸降解，1606214，7.7kDa），HA（380kDa，1511233）。
用无血清1640（Gibco）培养液配制浓度为50万单位/mL的LPS（sigma，025M4040V）母液，0.22µm滤膜过滤除菌，-20℃冰箱保存，临用前稀释成1万单位/mL 的作用液。将实验样品用LPS作用液配制为0.4%的浓度，0.22µm滤膜过滤除菌。将3T3细胞以1×105/ml接种于24孔板，采用1640培养基加10%的胎牛血清（Gibco），在 37℃、5% CO2条件下培养24h，加入实验样品，同时以LPS作为模型对照，继续培养24h，用Mouse IL-6 ELISA Kit（北京四正柏生物科技有限公司，20160519）Mouse TGF-β1 ELISA Kit（北京四正柏生物科技有限公司，20160519）试剂盒检测炎性因子。操作过程按照试剂盒说明书进行。以未加实验样品的炎性因子量为100%。
结果表明，对于IL-6和TGF-β1，分子量越低，抑制效果越好，透明质酸寡糖及其盐具有明显的优势，而纳诺HA（miniHA）与寡聚HA（oligoHA）之间没有明显差异。
Claims (12)
1.一种固液双相酶解与超滤联用制备超低分子量透明质酸寡糖及其盐的方法，其特征是包括以下步骤：
（1）酶解缓冲液准备：调节纯化水pH为4~9、温度为20~48℃，然后加入芽孢杆菌透明质酸酶，配成酶解缓冲液；
（2）固液双相酶解：在搅拌下向酶解缓冲液中加入氧化锆分散珠，再快速加入高分子量的透明质酸或其盐固体至其质量体积浓度为5~25%，搅拌混匀，得到透明质酸-酶解液固液双相酶解体系；在搅拌下酶解至至固液双相酶解体系转变为液液单相酶解体系后，再次快速加入高分子量的透明质酸或其盐固体至其质量体积浓度为5~25%，搅拌混匀形成透明质酸-酶解液固液双相酶解体系，继续搅拌酶解，直至固液双相酶解体系转变为液液单相酶解体系；
（3）超滤：酶解体系变为液液单相酶解体系时，将酶解反应液与超滤系统连接，边超滤边酶解，直至酶解反应液中的透明质酸或其盐的分子量≤3kDa，控制超滤条件使酶解结束时超滤滤出的清液体积为酶解反应液的40-60%；
（4）后处理：合并超滤滤出的清液和剩余的酶解反应液，进行灭活、活性炭吸附、过滤处理，过滤所得滤液进行喷雾干燥，得到分子量≤3kDa的超低分子量透明质酸寡糖及其盐。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述芽孢杆菌透明质酸酶为芽孢杆菌（Bacillus sp.）A50 CGMCC NO.5744发酵得到；酶解液中芽孢杆菌透明质酸酶的用量与步骤（2）中加入的高分子量的透明质酸或其盐固体的总质量的关系为：每1kg高分子量的透明质酸或其盐固体需要4×105~1×106IU的芽孢杆菌透明质酸酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述高分子量的透明质酸及其盐固体的分子量大于10kDa；所述高分子量的透明质酸盐为透明质酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐或锌盐。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述高分子量的透明质酸及其盐固体的分子量为100kDa~1000kDa。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤（2）中，在30-40rmp的搅拌速度下加入高分子量的透明质酸及其盐固体，加入后再在此速度下搅拌3-5min，然后将搅拌速度调整为15-20rpm，进行固液双相酶解；当超滤与酶解反应液连接后，酶解搅拌速度调整为80-100rpm。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征是：步骤（2）中，每次加入高分子量的透明质酸及其盐固体时，加入时间控制在5-15min内。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤（2）中，每次加入的高分子量的透明质酸及其盐固体在体系中的质量体积浓度为10~18%；步骤（3）中，超滤系统中的超滤膜的截留分子量为3kDa。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤（2）中，酶解温度为20~48℃，酶解pH为4-9。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征是：步骤（2）中，酶解温度为30~45℃，酶解pH为5.5~7.5。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤（2）中，由固液双相酶解体系转变为液液单相酶解体系所需的酶解时间为0.5-2h；超滤与酶解联合的酶解时间为1-6h。
11.根据权利要求1-5、7-10中任一项所述的方法，其特征是：
（1）灭活的操作为：合并超滤滤出的清液和剩余的酶解反应液，在50~90℃下保持10~60min，对芽孢杆菌透明质酸酶进行灭活；
（2）活性炭吸附的操作为：向灭活的料液中加入质量体积浓度为0.1~10%的活性炭，在50~90℃下搅拌10~60min；
（3）过滤的操作为：将活性炭吸附后的料液先用板框过滤机过滤，再用孔径为0.22µm的聚丙烯滤芯过滤，得滤液；
（4）喷雾干燥的条件为：进风温度设定值：150℃~180℃；出风温度设定值：70℃~90℃；进料速度：30L/h~50L/h。
12.根据权利要求1-5、7-10中任一项所述的方法，其特征是：所得超低分子量透明质酸寡糖及其盐含量大于95%。
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