CN112646849B - 一种微生物源壳寡糖的制备方法 - Google Patents

一种微生物源壳寡糖的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微生物源壳寡糖的制备方法，其包括壳聚糖酶工程菌BC002菌体培养，壳聚糖溶液的制备，壳聚糖溶液酶解，壳聚糖溶液分离纯化，壳聚糖溶液冷冻干燥等步骤。利用本发明提供的方法制备得到的壳寡糖的收率为43.20％，壳寡糖分子量范围为986‑1114Da，蛋白质含量为0.015％、灰分含量为0.30％。本发明制备的壳寡糖，分子量分布窄、纯度高；对大肠杆菌与铜绿假单胞菌抑制效果好作用；细胞毒性低；拥有较好的抗敏、抗炎活性。

Description

一种微生物源壳寡糖的制备方法
技术领域
本发明涉及一种微生物源壳寡糖的制备方法，属于生物发酵领域。
背景技术
壳聚糖是目前自然界中唯一含有正电荷的碱性多糖，产量仅次于纤维素，居世界第二，来源主要包括两个方面：(1)从虾蟹壳中提取制备动物源壳聚糖(2) 从真菌细胞壁中提取制备微生物源壳聚糖。微生物源壳聚糖具有不受原料地域、季节限制、无动物蛋白过敏源、分子量低、生物活性更高等优点。壳聚糖由于分子量大、粘度高、不溶于水等缺陷限制了其应用范围，降解后的壳寡糖分子量低、水溶性强、生物活性高广泛应用在医药、食品、日化等领域。近年来国内外众多专利及文献显示，壳寡糖具有较高的抑菌活性。如专利CN108185272 A中，利用不同聚合度的动物源壳寡糖混合物与抑菌剂进行复配，复合抑菌剂对大肠杆菌的最小抑菌质量浓度(MIC)为1.05g/L。Liu X F等人发表的文章显示脱乙酰度为90％的壳五糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、酵母菌的抑菌MIC值分别为6.3、 7.39、7.37g/L。张金豫等人从棘孢木霉菌渣中制备的壳寡糖对大肠杆菌MIC为 15.80g/L、对金黄色葡萄球菌MIC为15.57g/L。
目前壳寡糖的制备方法主要包括：物理法、化学法、酶解法。相对于其他两种制备方法，酶解法具有反应条件温和、容易控制、安全性高、环境友好、产品聚合度较集中等优点。
然而，现有酶解法制备壳寡糖的工艺技术与方法依然存在一些问题：(1)分子量分布较宽。如专利CN 109553648 A、CN 110564793 A、CN 110699406 A和 CN 111718972 A中显示，壳寡糖聚合度范围为2-15之间。(2)壳聚糖酶价格较为昂贵，导致生产成本较高。(3)酶的加入使酶解液中蛋白质含量较高，后续去除蛋白工艺较为繁琐，最终导致壳寡糖收率较低。(4)目前市售壳寡糖商品基本为动物来源的壳寡糖，微生物来源壳寡糖的制备技术未见工业化生产实例。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：现有市售壳寡糖商品基本为动物来源的壳寡糖，其存在分子量分布较宽；壳聚糖酶价格较为昂贵，导致生产成本较高；酶的加入使酶解液中蛋白质含量较高，后续去除蛋白工艺较为繁琐，最终导致壳寡糖收率较低层问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种微生物源壳寡糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)：壳聚糖酶工程菌BC002菌体培养；
步骤2)：壳聚糖溶液的制备；
步骤3)：壳聚糖溶液酶解；
步骤4)：壳聚糖溶液分离纯化；
步骤5)：壳聚糖溶液冷冻干燥。
优选地，所述步骤1)具体为：①种子培养：将菌种BC002接种于含有LB 种子培养基中，于37℃，200rpm条件下培养过夜；②发酵培养：将种子液按照体积分数为1％的接种量，接种于含有卡那霉素LB发酵培养基中，于37℃、 200rpm条件下震荡培养2.5h；③诱导：待菌液OD600nm上升至0.60-0.80，加入氨苄青霉素终浓度为0.40mmol/mL，继续培养6h；④菌体收集：将发酵液离心，获得BC002湿菌体。
优选地，所述步骤2)具体为：将壳聚糖用体积浓度0.1-1.5％的乙酸水溶液，在搅拌状态下完全溶解，壳聚糖浓度为10-50g/L，并用质量浓度30％的氢氧化钠溶液，调节pH至4-6。
更优选地，所述壳聚糖的制备方法为将曲霉菌种接种于液体培养基中，发酵培养一段时间，微滤得到发酵后菌体，依次经过盐酸破壁、强碱除蛋白和脱乙酰得到底物壳聚糖。
进一步地，所述曲霉菌种所采用的曲霉(分类名：褚曲霉Aspergillusochraceus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种保藏编号为：CGMCC No.15668，保藏日期：2018年04月25日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
优选地，所述步骤3)具体为：向所述壳聚糖溶液中加入壳聚糖酶工程菌 BC002湿菌体，壳聚糖与湿菌体的质量比为0.2:1-4:1，酶解的工艺参数为：转速 100-300rpm、酶解温度40-65℃、酶解时间2-20h、灭酶温度100℃，灭酶时间 30-60min。
优选地，所述步骤4)具体为：①微滤：酶解液通过0.22μm水相膜微滤除杂；②树脂吸附：向酶解液中加入弱阴型树脂进行静态吸附，树脂加入量为固液比1:1-1:10，吸附时间为1-2h；③超滤：将酶解液，抽滤去除树脂，再依次通过 5.0×104Da、5.0×103Da板式膜超滤；④纳滤：将超滤后的酶解液继续进行纳滤除盐，纳滤膜的孔径范围为200-300nm的卷式膜，过滤压力为2.0-3.0×105Pa。
更优选地，所述树脂采用OH-型的D303。
优选地，所述步骤5)具体为：将壳寡糖溶液置于冷冻干燥机中，冻干48h，获得白色雪花状粉末即为微生物源壳寡糖成品。
优选地，所述壳聚糖酶工程菌BC002菌体的GenBank为No.CP019663.1。
优选地，所述步骤2)、步骤3)、步骤4)、步骤5)壳聚糖溶液制备、酶解及分离纯化工艺同时适合动物源、微生物源壳聚糖酶解；其中动物源壳聚糖购自郑州奇华顿化工有限公司。
所述工程菌BC002的保藏信息为工程菌BC002为一种表面展示体系，此表面展示体系将编码壳聚糖酶的基因csn和负责跨膜转运及锚定功能的冰核蛋白N 端结构域的基因inaQN融合得到融合后的基因片段，融合后的基因片段表达在宿主细胞大肠杆菌表面，得到的壳聚糖酶细胞表面展示体系，壳聚糖酶GenBank No.CP019663.1。此菌编号为BC002保藏于上海应用技术大学实验室；
本发明以曲霉来源的壳聚糖为底物，结合新的酶解方法，此酶解方法使用的壳聚糖酶是一种通过基因工程表面展示技术表达在大肠杆菌表面的鳌合酶，其最大的优势为，酶解液通过简单的过滤去除菌体的同时即可将酶蛋白去除。通过此酶解工艺所获得的酶解液具有蛋白含量较低、后续分离纯化步骤简单、产品收率较高的优点。利用本发明所制备的壳寡糖分子量分布窄，其在抑菌、抗敏、抗炎等生理活性方面较动物源壳寡糖具有一定优势。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
①酶解原料质量稳定。曲霉源壳聚糖与动物源壳聚糖相比不受时间、地域限制、环境友好、无海洋重金属污染等优点。
②生理活性较高。该工艺所制备的壳寡糖为一种分子量分布范围较窄的微生源壳寡糖，其生理活性较动物源壳寡糖高。
③酶解液中蛋白去除工艺简单。该工艺使用的壳聚糖酶是一种通过基因工程表面展示技术表达在大肠杆菌表面的鳌合酶，其最大的优势为，酶解液通过简单的过滤即可去除菌体与大部分酶蛋白。
附图说明
图1为壳五糖标准品GPC图谱；
图2为实施例1制备的壳寡糖冻干粉GPC图谱；
图3为实施例1制备的壳寡糖冻干粉；
图4为两种来源壳寡糖X-射线衍射图。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
实施例1
步骤1：微生物源壳聚糖制备：将曲霉菌种接种于液体培养基中，发酵培养一段时间，微滤得到发酵后菌体，依次经过盐酸破壁、强碱除蛋白和脱乙酰得到底物壳聚糖；
步骤2：壳聚糖酶工程菌BC002菌体培养：从菌种BC002保存平板中挑起单菌落，接种于含有卡那霉素抗生物的培养基中，摇床震荡过夜培养。菌液离心，去除上清液，得到BC002菌体；
步骤3：壳聚糖溶液制备：将壳聚糖用体积分数为0.1％的乙酸水溶液，在搅拌状态下完全溶解，壳聚糖浓度为10g/L，并用质量分数为30％的氢氧化钠溶液，调节pH至4.5；
步骤4：酶解：向上述壳聚糖溶液中加入壳聚糖酶工程菌BC002湿菌体，壳聚糖质量浓度与湿菌体的质量比为0.2:1，酶解转速150rpm、酶解温度45℃、酶解时3h、灭酶温度100℃，时间30-60min；
步骤5：分离纯化酶解液：将步骤4制备的酶解液经过①-④进行分离纯化具体步骤如下，①微滤：酶解液通过0.22um水相膜微滤除杂；②树脂吸附：向上述酶解液中加入弱阴型树脂进行静态吸附，树脂加入量为固液比1:8，吸附时间为1h；③超滤：将上述②中酶解液，抽滤去除树脂，再依次通过5.0×104Da、 5.0×103Da板式膜超滤；④纳滤：将上述③中超滤后的酶解液继续进行纳滤除盐，纳滤膜的孔径范围为200-300nm的卷式膜，过滤压力为2.0-3.0×105Pa；
步骤6：将上述步骤5纳滤后获得的壳寡糖溶液置于冷冻干燥机中，冻干48h，获得白色雪花状粉末即为壳寡糖成品；
壳寡糖总收率为23.14％，分子量范围为547-685Da。
实施例2
步骤1：微生物源壳聚糖制备：将曲霉菌种接种于液体培养基中，发酵培养一段时间，微滤得到发酵后菌体，依次经过盐酸破壁、强碱除蛋白和脱乙酰得到底物壳聚糖；
步骤2：壳聚糖酶工程菌BC002菌体培养：从菌种BC002保存平板中挑起单菌落，接种于含有卡那霉素抗生物的培养基中，摇床震荡过夜培养。菌液离心，去除上清液，得到BC002菌体；
步骤3：壳聚糖溶液制备：将壳聚糖用体积分数为1.0％的乙酸水溶液，在搅拌状态下完全溶解，壳聚糖浓度为30g/L，并用质量分数为30％的氢氧化钠溶液，调节pH至5.0；
步骤4：酶解：向上述壳聚糖溶液中加入壳聚糖酶工程菌BC002湿菌体，壳聚糖与湿菌体的质量比为2:1，酶解转速200rpm、酶解温度50℃、酶解时间10h、灭酶温度100℃，时间30-60min；
步骤5：分离纯化酶解液：将步骤4制备的酶解液经过①-④进行分离纯化具体步骤如下，①微滤：酶解液通过0.22um水相膜微滤除杂；②树脂吸附：向上述酶解液中加入弱阴型树脂进行静态吸附，树脂加入量为固液比1:5，吸附时间为1.5h；③超滤：将上述②中酶解液，抽滤去除树脂，再依次通过5.0×104Da、 5.0×103Da板式膜超滤；④纳滤：将上述③中超滤后的酶解液继续进行纳滤除盐，纳滤膜的孔径范围为200-300nm的卷式膜，过滤压力为2.0-3.0×105Pa；
步骤6：将上述步骤5纳滤后获得的壳寡糖溶液置于冷冻干燥机中，冻干48h，获得白色雪花状粉末即为壳寡糖成品。
壳寡糖总收率为43.20％，分子量范围为986-1114Da。
实施例3
步骤1：微生物源壳聚糖制备：将曲霉菌种接种于液体培养基中，发酵培养一段时间，微滤得到发酵后菌体，依次经过盐酸破壁、强碱除蛋白和脱乙酰得到底物壳聚糖；
步骤2：工程菌BC002菌体培养：从菌种BC002保存平板中挑起单菌落，接种于含有卡那霉素抗生物的培养基中，摇床震荡过夜培养。菌液离心，去除上清液，得到BC002菌体；
步骤3：壳聚糖溶液制备：将壳聚糖用体积分数为1.5％的乙酸水溶液，在搅拌状态下完全溶解，壳聚糖浓度为50g/L，并用质量分数为30％的氢氧化钠溶液，调节pH至5.5；
步骤4：酶解：向上述壳聚糖溶液中加入工程菌BC002湿菌体，壳聚糖与湿菌体的质量比为4:1，酶解转速250rpm、酶解温度55℃、酶解时间18h、灭酶温度100℃，时间30-60min；
步骤5：分离纯化酶解液：将步骤4制备的酶解液经过①-④进行分离纯化具体步骤如下，①微滤：酶解液通过0.22um水相膜微滤除杂；②树脂吸附：向上述酶解液中加入弱阴型树脂进行静态吸附，树脂加入量为固液比1:3，吸附时间为2h；③超滤：将上述②中酶解液，抽滤去除树脂，再依次通过5.0×104Da、 5.0×103Da板式膜超滤；④纳滤：将上述③中超滤后的酶解液继续进行纳滤除盐，纳滤膜的孔径范围为200-300nm的卷式膜，过滤压力为2.0-3.0×105Pa；
步骤6：将上述步骤5纳滤后获得的壳寡糖溶液置于冷冻干燥机中，冻干48h，获得白色雪花状粉末即为壳寡糖成品；
壳寡糖总收率为33.00％，分子量范围为5387-5451Da。
将实施例中1-3中制备的两种来源平均分子量范围为986-1114Da壳寡糖进行相关测试，检测方法如下：
一、壳寡糖对大肠杆菌、铜绿假单胞菌最小抑菌质量浓度(MIC测定)
步骤1：菌种活化
细菌大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌采用大豆酪蛋白胨琼脂培养基；将上述菌种在固体斜面培养基中活化5-10代得到活化后的种子；受试菌大肠杆菌编号为 8099，铜绿假单胞菌编号为ATCC-15442。
步骤2：菌悬液的制备
称取大豆蛋白胨0.3g、氯化钠0.05g、磷酸二氢钾0.3g、磷酸氢二钠0.68g、葡萄糖0.4g、溶解于100mL去离子水中，高压蒸汽灭菌15min后冷却至室温，接入步骤1活化后的大肠杆菌、铜绿假单胞菌培养；
大肠杆菌、铜绿假单胞菌在37℃恒温摇床中培养，用无菌生理盐水将培养后的菌悬液稀释104-105倍，取200μL稀释后菌悬液用涂布棒均匀涂布于固体培养皿中，培养24h，计数不同稀释倍数对应菌落数，每个样品三个平行，结果取平均值；
优选地，大肠杆菌、铜绿假单胞菌在37℃恒温摇床中培养时间为4-12h，摇床转速为150-250rpm；所制备的菌悬液中细菌个数107-108cfu/mL；所用液体培养基pH分别为4.5、5、5.5，步骤1中培养基用体积分数为0.5-1.5％盐酸调pH；
步骤3：MIC测定操作步骤
在无菌3.3μL96孔板的每排第2孔中加入壳寡糖溶液和液体培养基；壳寡糖溶液配置方法为：取一定量壳寡糖冻干粉溶解于无菌去离子水中，终浓度为 200-400g/L；每排第2孔中加入不同体积壳寡糖溶液和不同体积液体培养基使每孔总体积共计300μL；
在第3孔到第11孔中加入150μL步骤2)中培养基；利用两倍稀释法，在每排中，用200μL移液器从每排第2孔中移出150μL液体加入到各排的第3 孔中进行稀释混匀，然后向后依次进行稀释混匀，直到每排的第11孔，每稀释混匀一孔，换一次枪头；
在每排第1孔中加入150μL步骤2中培养基作为阴性对照；
在每排第12孔中加入150μL步骤2中培养基和1.5μL步骤2)中菌液作为正常生长对照孔；
再在每排第2孔到第11孔中每孔加入1.5μL步骤2)中菌液，接种量为1.5 μL；
步骤4：培养箱孵育
将步骤3中的3.3mL96孔板放入恒温培养箱中，37℃培养24h；
步骤5：数据分析
通过酶标仪设定OD600nm，读取数据，进行数据处理用第2个孔到第12个孔的数值减去第1个孔(阴性对照)的数值；
步骤6：绘制折线图确定最小抑制浓度
拐点值即为最小抑制质量浓度。
二、两种来源壳寡糖对HaCaT细胞最小毒性质量浓度测定
步骤1：细胞培养
HaCaT细胞培养于含体积分数为10％的胎牛血清的DMEM细胞培养液中，置于37℃含体积分数为5％的CO2的细胞培养箱中，每1-2天换液一次。用0.25％胰酶消化传代，1000rpm离心1-10min后，弃上清液，加入新鲜培养基传代培养；所述DMEM细胞培养液是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，购自上海浩然生物技术有限公司；HaCaT细胞株系原代细胞购自普如汀生物技术(北京)有限公司；
步骤2：壳寡糖样液的配置
分别用细胞培养液(与步骤1中培养基一致)溶解配置100μg/mL的微生物来源壳寡糖及动物来源壳寡糖，滤菌膜过滤后，按比例将其分别稀释为1、5、 10、20、30、50、75μg/mL的样液；
步骤3：最小毒性质量浓度测定
将HaCaT细胞以105cell/mL的浓度接种于96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液。然后将96孔板放在培养箱中孵育24小时(37℃，5％CO2)使细胞贴壁生长。加入10μL不同浓度(1、5、10、20、30、50、75、100μg/mL)的微生物来源及动物来源壳寡糖，对照组加入10μL空白细胞培养液，每个组做4 个重复，结果取平均值。继续将96孔板放在培养箱(37℃，5％CO2)中孵育48 小时后取出。向每孔加入10μLCCK溶液。再将96孔板放在培养箱(37℃， 5％CO2)中孵育2小时后取出；所用试剂盒为CCK8试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司；
步骤4：数据处理
用酶标仪测定在450nm处的吸光度。根据下列公式计算细胞活性，绘制折线图确定两种不同来源壳寡糖对HaCaT细胞无明显毒性作用的最高浓度，拐点值即为最高无毒性作用最大浓度。
透明质酸酶抑制率测定(壳寡糖抗敏活性测定)
试剂配置
乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH＝5.6，100mL)：量取1.155mL冰乙酸稀释至100mL, 混匀后取其中4.8mL为A液体，称取2.72g乙酸钠结晶溶解定容至100mL,混匀后取其中45.2mL为B液，混合A.B以水定容至100mL,用pH仪器精明测定 pH,A.B调至5.6；
透明质酸酶溶液(乙酸缓冲盐溶液配制)：50mg透明质酸酶加缓冲溶液 20mL，2.5mg/mL，临用时取其中1mL加2mL缓冲溶液，稀释三倍；
氯化钙溶液(乙酸缓冲盐溶液配制)：12.5mmol/L；
透明质酸钠溶液(乙酸缓冲盐溶液配制)：2mg/mL，一次配制，多次使用；
氢氧化钠溶液：0.4mol/L；
对二甲氨基苯甲醛溶液：1.5g对二甲氨基苯甲醛溶于43.75mL冰醋酸 +6.25mL10mol/L浓盐酸。
抗敏实验操作步骤如表1所示。
表1
5-LOX抑制率测定(壳寡糖抗炎活性测定)
试剂配置：
Assay Buffer
0.1moL/L Tris-HCI pH＝7.5；
5-LOX(1MU)
原液分装36μg/mL，用前将其稀释10倍；
花生四烯酸(AA)
取原液63.95μL用乙醇稀释至1000μL，用前稀释30倍；
辣根过氧化酶(HPR)
配制13.9mg/mL储存液于低温保存；临用时稀释20倍；
3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)
TMB溶解于二甲基亚砜，配制浓度7.4g/L，临用时稀释10倍；
2mol/L硫酸
将浓硫酸稀释至2mol/L。
抗炎实验步骤操作如表2所示。
表2
抑制率计算公式：
上述测试的具体结果如下表
动物源壳寡糖不同pH对大肠杆菌、铜绿假单胞菌抑菌MIC测定结果见表3。
表3
pH 大肠杆菌MIC(g/L) 铜绿假单胞菌MIC(g/L)
pH4.5 1.00 5.00
pH5.0 1.00 6.00
pH5.5 4.00 16.00
微生物源壳寡糖不同pH对大肠杆菌、铜绿假单胞菌抑菌MIC测定结果见表4。
表4
pH 大肠杆菌MIC(g/L) 铜绿假单胞菌MIC(g/L)
pH4.5 0.25 1.00
pH5.0 0.40 1.50
pH5.5 0.50 3.00
两种来源壳寡糖最小毒性浓度测定见表5。
表5
5g/L两种来源壳寡糖抗敏、抗炎活性测定结果见表6。
表6
活性测定 微生物源壳寡糖活性(％) 动物源壳寡糖活性(％)
抗敏 88.57 62.75
抗炎 69.20 37.00

Claims (4)

1.一种微生物源壳寡糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)：壳聚糖酶工程菌BC002菌体培养：①种子培养：将菌种BC002接种于含有LB种子培养基中，于37℃，200rpm条件下培养过夜；②发酵培养：将种子液按照体积分数为1％的接种量，接种于含有卡那霉素LB发酵培养基中，于37℃、200rpm条件下震荡培养2.5h；③诱导：待菌液OD600nm上升至0.60-0.80，加入氨苄青霉素终浓度为0.40mmol/mL，继续培养6h；④菌体收集：将发酵液离心，获得BC002湿菌体；所述壳聚糖酶工程菌BC002菌体的GenBank为No.CP019663.1；
步骤2)：壳聚糖溶液的制备：将壳聚糖用体积浓度0.1-1.5％的乙酸水溶液，在搅拌状态下完全溶解，壳聚糖浓度为10-50g/L，并用质量浓度30％的氢氧化钠溶液，调节pH至4-6；所述壳聚糖的制备方法为将曲霉菌种接种于液体培养基中，发酵培养一段时间，微滤得到发酵后菌体，依次经过盐酸破壁、强碱除蛋白和脱乙酰得到底物壳聚糖；所述曲霉菌种所采用的曲霉(Aspergillus ochraceus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种保藏编号为：CGMCC No.15668，保藏日期：2018年04月25日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
步骤3)：壳聚糖溶液酶解：向所述壳聚糖溶液中加入壳聚糖酶工程菌BC002湿菌体，壳聚糖质量与湿菌体的质量比为0.2:1-4:1，酶解的工艺参数为：转速100-300rpm、酶解温度40-65℃、酶解时间2-20h、灭酶温度100℃，灭酶时间30-60min；
步骤4)：壳聚糖溶液分离纯化；
步骤5)：壳聚糖溶液冷冻干燥。
2.如权利要求1所述的微生物源壳寡糖的制备方法，其特征在于，所述步骤4)具体为：①微滤：酶解液通过0.22μm水相膜微滤除杂；②树脂吸附：向酶解液中加入弱阴型树脂进行静态吸附，树脂加入量为固液比1:1-1:10，吸附时间为1-2h；③超滤：将酶解液，抽滤去除树脂，再依次通过5.0×104Da、5.0×103Da板式膜超滤；④纳滤：将超滤后的酶解液继续进行纳滤除盐，纳滤膜的孔径范围为200-300nm的卷式膜，过滤压力为2.0-3.0×105Pa。
3.如权利要求2所述的微生物源壳寡糖的制备方法，其特征在于，所述树脂采用OH-型的D303。
4.如权利要求1所述的微生物源壳寡糖的制备方法，其特征在于，所述步骤5)具体为：将壳寡糖溶液置于冷冻干燥机中，冻干48h，获得白色雪花状粉末即为微生物源壳寡糖成品。
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