CN103602652A - 一种食品级中性蛋白酶的提纯方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种食品级中性蛋白酶的提纯方法，包括如下步骤：1）采用枯草芽孢杆菌AS1.398菌种发酵，得到中性蛋白酶发酵液；往发酵液中添加絮凝剂；<b/>2 ）板框过滤：将中性蛋白酶发酵液进行板框过滤收集滤液；3）离心：将板框过滤收集的滤液进行高速离心；4）粗滤：将收集的离心液进行粗滤；5）精滤：采用聚砜超滤膜进行过滤浓缩；6）添加酶活保护剂：添加海藻糖和 β - 环状糊精；7）沉淀:添加食用乙醇，收集中性蛋白酶沉淀部分；8）真空干燥：真空干燥，即可得到食品级中性蛋白酶。本发明能有效的解决中性蛋白酶活损失问题，酶活收率明显提高，成品提取总收率达到70%以上，卫生指标符合食品级要求，可应用于食品加工行业。

Description

一种食品级中性蛋白酶的提纯方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种食品级中性蛋白酶的提纯方法。

背景技术

目前，工业上采用枯草芽孢杆菌AS1.398生产中性蛋白酶已有多年的历史,是一类被广泛应用于工业生产的酶类,在洗涤剂、制革、丝绸、食品加工等多种行业上有着广泛的用途。目前我国发酵生产中性蛋白酶工艺主要是发酵液直接喷雾干燥或盐析沉淀后再烘干，此类产品由于生产工艺过程的局限性，酶活在高温环境损失较大，酶活收率低，产品杂质多，微生物等卫生指标不符合食品行业要求，应用范围受限制，因此对发酵液中性蛋白酶的分离、提纯很有必要。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种食品级中性蛋白酶的提纯方法，能有效的解决中性蛋白酶活损失问题，酶活收率明显提高，提取总收率达到70%以上；所得到的食品级中性蛋白酶的纯度和酶活都比工业用酶高，卫生指标符合食品级要求，可应用于食品加工行业，产品附加值得到提升。

实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：

一种食品级中性蛋白酶的提纯方法,其特征在于包括如下步骤：

1）采用枯草芽孢杆菌AS1.398菌种进行发酵，得到中性蛋白酶发酵液；然后往发酵液中添加絮凝剂，搅拌均匀，静置30分钟，使杂质与絮凝剂结合成团状；有利于过滤;

2）板框过滤：将絮凝反应完成后的中性蛋白酶发酵液进行板框过滤，过滤压力控制在0.6-0.8MPa，收集滤液;

3）离心：将板框过滤收集的滤液进行高速离心，转速为：10000rpm,进料流速为80L/h，收集离心液;

4）粗滤：将收集的离心液进行粗滤，采用聚偏氟乙烯滤膜进行过滤，聚偏氟乙烯滤膜的孔径为0.22um和0.1um（天津爱生膜过滤技术有限公司生产，型号分别MFOc和MFIb1），操作压力0.1MPa；

5）精滤：将经过粗滤后的料液采用聚砜超滤膜进行过滤浓缩，

聚砜超滤膜的截留分子量为10K（天津爱生膜过滤技术有限公司生产，滤膜型号USIb1），操作压力0.1MPa；得到中性蛋白酶浓缩液；目的是过滤除去大部分水和小分子盐类等物质，截留中性蛋白酶分子，起到提纯作用;

6）添加酶活保护剂：往步骤5）得到的中性蛋白酶浓缩液中添加酶活保护剂，搅拌均匀；其中，所述酶活保护剂包括海藻糖和β-环状糊精，所述海藻糖的重量为中性蛋白酶浓缩液的重量的0.4-1.2%，β-环状糊精的重量为中性蛋白酶浓缩液的重量的0.2-0.6%;

7）沉淀:往经过步骤6）处理后的中性蛋白酶浓缩液中添加食用乙醇，边添加边缓慢搅拌，使得中性蛋白酶分子结晶沉淀出来，收集絮状的中性蛋白酶沉淀部分;

8）真空干燥：将步骤7）收集得到的絮状的中性蛋白酶沉淀部分进行真空干燥，即可得到食品级中性蛋白酶。

实现本发明的目的还可以通过采取如下技术方案达到：

实现本发明的一种实施方式是：在步骤1）中，所述絮凝剂是阴离子聚丙烯酰胺；添加絮凝剂时，需先将絮凝剂按重量比为1:1000的比例溶解于水中，得到预溶絮凝液，然后将预溶絮凝液按重量比为1:100的比例添加到中性蛋白酶发酵液中，缓慢搅拌10分钟。

实现本发明的一种实施方式是：在步骤4）中，要求料液经过两次过滤，滤膜孔径分别为0.22um和0.1um。以达到最佳的除杂效果。

实现本发明的一种实施方式是：在步骤6）中，所述海藻糖的重量为中性蛋白酶浓缩液的重量的0.8-1.2%，β-环状糊精的重量为中性蛋白酶浓缩液的重量的0.5%。

实现本发明的一种实施方式是：在步骤6）中，所述海藻糖的重量为中性蛋白酶浓缩液的重量的0.8%，β-环状糊精的重量为中性蛋白酶浓缩液的重量的0.5%。

实现本发明的一种实施方式是：在步骤7）中，所述食用乙醇的浓度为90%；添加定量的浓度为90%的食用乙醇，使得最终的中性蛋白酶浓缩液中含食用乙醇的重量百分含量为50%。

本发明的有益效果在于：

本发明将菌种AS1.398发酵液中的中性蛋白酶分离、提纯，达到食品行业应用的卫生标准，扩大了中性蛋白酶的使用范围，提高中性蛋白酶的使用价值，为大量生产食品级中性蛋白酶提供技术支持。本发明工艺中采用两次逐级粗滤，可以将发酵液中的微生物和杂质完全过滤除去，超滤浓缩后的中性蛋白酶溶液，通过添加适当酶活保护剂，减少酶活损失，用乙醇沉淀中性蛋白酶，收集沉淀物，再进行真空干燥，即可得到精制中性蛋白酶产品。通过该工艺处理得到的中性蛋白酶产品，纯度和酶活都比工业用酶高，卫生指标符合食品级要求，可应用于食品加工行业，产品附加值得到提升。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述：

实施例1：

一种食品级中性蛋白酶的提纯方法,包括如下步骤：

1）采用枯草芽孢杆菌AS1.398菌种进行发酵，发酵罐为1000L，取出料发酵液600kg，检测发酵液酶活为6800U/g，得到中性蛋白酶发酵液；然后往发酵液中添加絮凝剂，搅拌均匀，静置30分钟，使杂质与絮凝剂结合成团状；有利于过滤;所述絮凝剂是阴离子聚丙烯酰胺；添加絮凝剂时，需先将絮凝剂按重量比为1:1000的比例溶解于水中，得到预溶絮凝液，然后将预溶絮凝液按重量比为1:100的比例添加到中性蛋白酶发酵液中，即将6kg预溶絮凝液添加到600kg中性蛋白酶发酵液中，缓慢搅拌10分钟。

2）板框过滤：将絮凝反应完成后的中性蛋白酶发酵液进行板框过滤，过滤压力控制在0.6-0.8MPa，共收集滤液525kg。

3）离心：将板框过滤收集的滤液进行高速离心，转速为：10000rpm,进料流速为80L/h，收集离心液,得到离心液509kg。

4）粗滤：将收集的离心液进行粗滤，采用聚偏氟乙烯滤膜进行过滤，聚偏氟乙烯滤膜的孔径分别为0.22um和0.1um，操作压力0.1MPa；要求料液经过两次过滤。以达到最佳的除菌效果。聚偏氟乙烯滤膜选用型号为MFOc和MFIb1。

5）精滤：将经过粗滤后的料液采用聚砜超滤膜进行过滤浓缩，

聚砜超滤膜的截留分子量为10K，操作压力0.1MPa；得到中性蛋白酶浓缩液115kg，酶活检测为2.7万U/g，酶活收率为76.1%。目的是过滤除去大部分水和小分子糖类、盐类等物质，截留中性蛋白酶分子，起到提纯作用;聚砜超滤膜选用型号为USIb1。

6）添加酶活保护剂：往步骤5）得到的中性蛋白酶浓缩液中添加酶活保护剂，搅拌均匀；其中，所述酶活保护剂包括海藻糖和β-环状糊精，所述海藻糖的重量为中性蛋白酶浓缩液的重量的1%,即1.15kg，β-环状糊精的重量为中性蛋白酶浓缩液的重量的0.5%,即0.575kg;

7）沉淀:往经过步骤6）处理后的中性蛋白酶浓缩液中添加浓度为90%的食用乙醇，使得最终的中性蛋白酶浓缩液中含食用乙醇的重量百分含量为50%，经计算需添加浓度为90%的食用乙醇145.9kg；边添加边缓慢搅拌，使得中性蛋白酶分子结晶沉淀出来，收集絮状的中性蛋白酶沉淀部分。

8）真空干燥：将步骤7）收集得到的絮状的中性蛋白酶沉淀部分进行真空干燥，即可得到粉末状的食品级中性蛋白酶,重量为3.53kg，酶活为82.4万U/g,酶活总收率为71.3%。

9）中性蛋白酶检测方法按照国标GB/T23527-2009附录C紫外分光光度法检测。蛋白酶活力定义为：1g固体酶粉（或1ml液体酶），在一定温度和PH值下，1分钟水解酪蛋白产生1ug酪氨酸，即为1个酶活力单位，以U/g或u/ml表示。

10）微生物指标检测：细菌总数检测按照食品安全国家标准GB4789.2-2010菌落总数测定，大肠菌群检测按照食品安全国家标准GB4789.3-2010第一法大肠菌群MPN计数法检测。

测试实施例1：添加海藻糖在乙醇沉淀对酶活保护试验。

取100kg发酵液（酶活力：6800U/g）实验，按实施例1所述的技术方案操作，乙醇沉淀前添加不同量的海藻糖，搅拌均匀，然后再加乙醇沉淀，取沉淀物真空干燥，干燥品检测酶活及微生物指标,具体结构见表1。

表1

由表1可知，添加海藻糖能够在乙醇沉淀时减少乙醇对酶活的破坏，当添加量大于1.0%时，真空干燥品酶活达到80万U/g以上，添加量为1.2%以上对酶活收率提高不显著。

测试实施例2：添加β-环状糊精对在乙醇沉淀时酶活保护试验。

取100kg发酵液（酶活力：6800U/g）实验，按实施例1所述的技术方案操作，乙醇沉淀前添加不同量的β-环状糊精，搅拌均匀，然后再加乙醇沉淀，取沉淀物真空干燥，干燥品检测酶活及微生物指标,具体结果见表2。

表2

由表2可知，添加β-环状糊精在乙醇沉淀时对酶活有一定的保护作用，添加量达0.6%以上保护效果提高不显著，实际应用中，选用添加0.5%即可。

测试实施例3：海藻糖和β-环状糊精两种保护剂结合在乙醇沉淀时对酶活保护作用。

取100kg发酵液（酶活力：6800U/g）实验，实施例1所述的技术方案操作，乙醇沉淀前添加海藻糖和β-环状糊精，海藻糖选用不同比例添加，β-环状糊精按0.5%添加，搅拌均匀，然后再加乙醇沉淀，取沉淀物真空干燥，干燥品检测酶活及微生物指标,具体结果见表3。

表3

由表3可知，海藻糖和β-环状糊精两种保护剂结合使用比单一使用效果更好，当添加海藻糖0.8%和β-环状糊精0.5%，干燥品酶活即可达到酶活80万U/g，总收率70%以上。实际生产考虑海藻糖使用成本，综合考虑按0.8%比例添加即可。

参照表4，按照本发明生产工艺操作，与常规喷雾干燥生产的工业级中性蛋白酶比较，经过提纯后的中性蛋白酶纯度高，成品酶活力大于80万U/g，各项卫生指标符合食品级的技术标准。生产技术要求在实际生产中易操作控制，实用性强，能将工业用中性蛋白酶提高为食品级中性蛋白酶，达到食品行业的应用标准，如焙烤、各种肉类水解生产香精香料的原料要求，提高和延伸了中性蛋白酶应用价值。

表4实施例1所述的精制提取法与常规喷雾干燥法比较表

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种食品级中性蛋白酶的提纯方法, 其特征在于包括如下步骤：

1）采用枯草芽孢杆菌 AS1.398菌种进行发酵，得到中性蛋白酶发酵液；然后往发酵液中添加絮凝剂，搅拌均匀，静置30分钟，使杂质与絮凝剂结合成团状； 

2）板框过滤：将絮凝反应完成后的中性蛋白酶发酵液进行板框过滤，过滤压力控制在0.6-0.8MPa，收集滤液;

3）离心：将板框过滤收集的滤液进行高速离心，转速为：10000rpm,进料流速为80L/h，收集离心液;

4）粗滤：将收集的离心液进行粗滤，采用聚偏氟乙烯滤膜进行过滤，聚偏氟乙烯滤膜的孔径为0.22um和0.1um，操作压力0.1MPa；

5）精滤：将经过粗滤后的料液采用聚砜超滤膜进行过滤浓缩，聚砜超滤膜的截留分子量为10K，操作压力0.1MPa；得到中性蛋白酶浓缩液；

6）添加酶活保护剂：往步骤5）得到的中性蛋白酶浓缩液中添加酶活保护剂，搅拌均匀；其中，所述酶活保护剂包括海藻糖和β-环状糊精，所述海藻糖的重量为中性蛋白酶浓缩液的重量的0.4-1.2%，β-环状糊精的重量为中性蛋白酶浓缩液的重量的0.2-0.6%;

7）沉淀:往经过步骤6）处理后的中性蛋白酶浓缩液中添加食用乙醇，边添加边缓慢搅拌，使得中性蛋白酶分子结晶沉淀出来，收集絮状的中性蛋白酶沉淀部分;

8）真空干燥：将步骤7）收集得到的絮状的中性蛋白酶沉淀部分进行真空干燥，即可得到食品级中性蛋白酶。

2.根据权利要求1所述的食品级中性蛋白酶的提纯方法，其特征在于:在步骤1）中，所述絮凝剂是阴离子聚丙烯酰胺；添加絮凝剂时，需先将絮凝剂按重量比为1:1000的比例溶解于水中，得到预溶絮凝液，然后将预溶絮凝液按重量比为1:100的比例添加到中性蛋白酶发酵液中，缓慢搅拌10分钟。

3.根据权利要求1所述的食品级中性蛋白酶的提纯方法，其特征在于:在步骤4）中 ，要求料液经过两次膜过滤，膜孔径分别为0.22um和0.1um，除去杂质和细菌。

4.根据权利要求1所述的食品级中性蛋白酶的提纯方法，其特征在于:在步骤6）中 ，所述海藻糖的重量为中性蛋白酶浓缩液的重量的0.8-1.2%，β-环状糊精的重量为中性蛋白酶浓缩液的重量的0.5%。

5.根据权利要求1所述的食品级中性蛋白酶的提纯方法，其特征在于:在步骤6）中 ，所述海藻糖的重量为中性蛋白酶浓缩液的重量的0.8%，β-环状糊精的重量为中性蛋白酶浓缩液的重量的0.5%。

6.根据权利要求1所述的食品级中性蛋白酶的提纯方法，其特征在于:在步骤7）中，所述食用乙醇的浓度为90%；当添加定量的浓度为90%的食用乙醇后，能够使最终的中性蛋白酶浓缩液中含食用乙醇的重量百分含量为50%。