CN103211035A

CN103211035A - 一种液态型凝乳酶制剂的制备方法

Info

Publication number: CN103211035A
Application number: CN2013101256627A
Authority: CN
Inventors: 丁明亮; 王博达; 王楠; 王清伟; 丁重阳; 顾正华; 张梁; 石贵阳
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Sichuan Shengliyuan Bioengineering Co ltd
Priority date: 2013-04-12
Filing date: 2013-04-12
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2033-04-12
Also published as: CN103211035B

Abstract

本发明公开一种液态型凝乳酶制剂的制备方法。包括以下步骤：（1）以解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO：M2011045或枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M2010259为发酵菌株制备发酵液；（2）板框压滤，固液分离；（3）蒙脱石吸附；（4）微滤；（5）超滤浓缩；（6）向浓缩酶液中添加终浓度20～40%（w/v）的蔗糖或海藻糖，终浓度10～30%（w/v）的甘油或山梨醇以及终浓度0.01～0.05%（w/v）的氯化钙，混匀，制得成品。本发明方法凝乳酶活力回收率高，同时能有效去除酶液中的蛋白酶等杂质和残留菌体，所制酶制剂具有良好的品质和稳定性，酶专一性强，保存期长，安全无毒。

Description

一种液态型凝乳酶制剂的制备方法

技术领域

本发明属于生物发酵工程和酶制剂技术领域，具体涉及一种从解淀粉芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌发酵液中提取制备液态型凝乳酶制剂的方法。

背景技术

凝乳酶是乳酪生产中的关键酶，它使原奶凝固的过程分为两个阶段：酪蛋白微胶粒中α-酪蛋白和β-酪蛋白在κ-酪蛋白作用下不会自发凝结，首先，凝乳酶专一性地将κ-酪蛋白分解成p-κ-酪蛋白和一种巨肽，使酪蛋白的微胶粒失去稳定性；然后，在Ca²⁺作用下，p-κ-酪蛋白、α-酪蛋白和β-酪蛋白之间形成化学键从而产生沉淀。

传统的凝乳酶制备方法是利用牛犊第四胃（皱胃）提取制作，但随着乳酪产业不断扩大，单纯依靠宰杀幼畜来生产凝乳酶已经不能满足现代工业生产的需求。上世纪五十年代以来，国内外研究者一直努力寻求新的凝乳酶来源，目前除动物凝乳酶外，还发现了植物凝乳酶（无花果树液、菠萝果实等）和微生物凝乳酶（主要来源于真菌、细菌），其中，微生物的生长特性使得微生物凝乳酶具有广阔的发展前景，得到越来越多研究者的关注。本申请人在前期研究中获得两株凝乳酶高产菌株（参见《一株枯草芽孢杆菌及用该菌株发酵生产凝乳酶的方法》，申请号：CN 201010504167.3；《一株解淀粉芽孢杆菌及用该菌株发酵生产凝乳酶的方法》，申请号：CN 201110091892.7），并且对产酶工艺进行了优化（参见《一种基于两阶段溶氧控制策略生产凝乳酶的方法》，申请号：CN 201110420007.5），获得较高的产酶水平。

在微生物发酵产凝乳酶过程中，凝乳酶直接由生产菌株分泌至发酵液。现有工艺大多是通过真空或冷冻干燥将凝乳酶制成固态剂型，虽稳定性较好，但上述干燥方法耗能耗时，还易造成凝乳酶失活，此外，固态型酶制剂在保存过程中不易控制杂菌污染，使用时还需进行复溶。液态型酶制剂不仅可避免上述不利因素，且使用更为方便。

但是，现有液态型凝乳酶提取与制备工艺尚存在以下不足之处：凝乳酶活力回收率不高，所制酶制剂活力偏低；发酵同时常常产生其他活力较高的蛋白酶杂质，在产品保存过程中，这些蛋白酶的存在不仅会导致凝乳酶降解，使其液态剂型难以在室温条件下长久保持高凝乳酶活力，酶活半衰期短，稳定性较差，而且在实际应用过程中还会造成凝乳酶专一性不强，水解凝固过快，蛋白质过度水解，可溶性小分子物质增多，苦味物质产生等缺陷，从而降低奶酪的出品率，严重影响奶酪口感和品质，在一定程度上限制了液态型凝乳酶的应用。因此，开发一种高效、高收率的凝乳酶制备工艺以获得高品质液态型凝乳酶制剂具有十分重要的生产应用价值。

发明内容

针对现有凝乳酶制备工艺存在的上述缺陷，本申请人经过研究改进，提供一种液态型凝乳酶制剂的制备方法。本发明方法凝乳酶活力回收率高，同时能有效去除酶液中的蛋白酶等杂质和残留菌体，所制酶制剂具有良好的品质和稳定性，酶专一性强，保存期长，安全无毒。

本发明的技术方案如下：

一种液态型凝乳酶制剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）制备发酵液：以解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO：M 2011045或枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M 2010259为发酵菌株，通过液态发酵制得发酵液。

（2）固液分离：将步骤（1）所得发酵液用625~1250目滤布的板框压滤，取滤液，所述压滤速率为3~6吨/小时，此步的目的是除去发酵液中的菌体及固形物。

（3）蒙脱石吸附：向步骤（2）所得滤液中添加终浓度0.5~5%（w/v）的蒙脱石，充分混匀，室温静置10~30min，离心除去蒙脱石及部分悬浮物，收集上清液；优选的，所述蒙脱石的添加终浓度为2%（w/v）；此步的目的是进一步除去粗酶液中的残余菌体、部分大分子杂质及蛋白酶，降低粘度。

（4）微滤：将步骤（3）所得上清液经孔径0.5μm或1.0μm微孔滤膜错流过滤，操作压力0.2~0.3MPa，收集滤液，此步的目的是截留滤除酶液残留悬浮物、菌体及大分子量胶体。

（5）超滤浓缩：将步骤（4）所得滤液经孔径0.002μm（截留分子量约为30KDa）超滤膜错流过滤，操作压力0.3~0.5 MPa，收集滤液即为浓缩酶液，此步的目的是截留滤除酶液部分蛋白酶。

（6）稳定剂稳定：向步骤（5）所得浓缩酶液中添加终浓度20~40%（w/v）的蔗糖或海藻糖，终浓度10~30%（w/v）的甘油或山梨醇以及终浓度0.01~0.05%（w/v）的氯化钙，混匀，即得液态型凝乳酶制成品；优选的，所述各稳定剂的添加终浓度（w/v）为：蔗糖35%、山梨醇30%、氯化钙0.05%。

具体地，步骤（3）所述离心转速为10000转/分，离心温度4℃，离心时间15min。

本发明的有益技术效果在于：

本发明在制备得到凝乳酶高产菌株解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO：M 2011045（或枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M 2010259）发酵液的基础上，首先采用625~1250目板框压滤进行固液分离，初步除去发酵液中的菌体和固形物，得到粗酶液；再选用终浓度0.5~5%（w/v）的蒙脱石作为吸附剂，进一步除去粗酶液中的残余菌体、部分大分子杂质以及蛋白酶，从而有效降低粗酶液粘度，检测表明，相对于凝乳酶而言，蒙脱石对蛋白酶的吸附作用更为特异，经处理的凝乳酶活力损失极低，此外，蒙脱石作为食品安全级物质完全满足生产食品用酶的特殊要求；进一步采用微滤技术（孔径0.5μm或1.0μm的微孔滤膜）滤除悬浮物、菌体及大分子量胶体，再结合超滤浓缩技术（孔径0.002μm的超滤膜，截留分子量约为30KDa）截留分离部分蛋白酶杂质，从而有效降低酶液蛋白酶活力；最后添加经有效比例复配而成的稳定剂，制成可在常温下长期保存的适于奶酪加工生产的液态型凝乳酶制剂。

上述“板框压滤-蒙脱石吸附-微滤-超滤-稳定剂稳定”各工序之间层层递进、协同增效。与现有凝乳酶制备工艺相比，本发明凝乳酶活力回收率高（可达91.4%），同时能有效去除蛋白酶杂质，明显降低酶液蛋白酶活力，从而大大提升酶制剂的品质和稳定性，延长保存期，酶专一性强；本发明可有效而彻底地除去酶液残留菌体，故无需添加防腐剂，只需添加安全无毒的稳定剂即可获得长久的保质期。

具体实施方式

以下结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步的说明。

以下实施例所使用实验器材如下：微孔滤膜购自三达膜科技(厦门)有限公司（孔径0.5μm和1.0μm），超滤膜购自三达膜科技(厦门)有限公司（孔径0.002μm）；所述各原料试剂均为国产或进口分析纯成产品；所使用各仪器设备均为本领域常规设备；所述试验方法如无特殊说明均为本领域常用方法。

实施例1

（1）制备发酵液

以解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO：M 2011045为发酵菌株，通过液态发酵获得含凝乳酶的发酵液（具体发酵方法参见《一种基于两阶段溶氧控制策略生产凝乳酶的方法》，专利号：CN 201110420007.5）；测得发酵液中凝乳酶活力为6549 SU/ml，蛋白酶活力为812U/ml。

（2）固液分离

将步骤（1）所得发酵液用800目滤布的板框压滤，滤除发酵液中的菌体和固形物，压滤速率为4吨/小时，收集滤液。

（3）蒙脱石吸附

向步骤（2）所得滤液中添加终浓度0.5%（w/v）的蒙脱石，充分混匀，室温静置15min，于4℃以10000转/分的转速离心15min，除去蒙脱石及部分悬浮杂质，收集上清液。

（4）微滤

将步骤（3）所得上清液经孔径1.0μm的微孔滤膜错流过滤，截留滤除悬浮物、细菌及大分子量胶体物质，操作压力0.2 MPa，收集滤液。

（5）超滤浓缩

将步骤（4）所得滤液经孔径0.002μm（截留分子量约30KDa）的超滤膜错流过滤，截留滤除分子量大于30KDa的杂质（包括一种胞外主要的蛋白酶），操作压力0.5 MPa，收集滤液即得浓缩4倍的酶液；测得浓缩酶液凝乳酶活力为22840SU/ml，总凝乳酶活力回收率为87.2%，浓缩酶液蛋白酶活力1598 U/ml，总蛋白酶活力回收率49.2%。

实施例2

（1）制备发酵液

以解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO：M 2011045为发酵菌株，通过液态发酵获得含凝乳酶的发酵液（具体发酵方法参见《《一种基于两阶段溶氧控制策略生产凝乳酶的方法》，申请号：CN 201110420007.5）；测得发酵液中凝乳酶活力为6549 SU/ml，蛋白酶活力为812U/ml。

（2）固液分离

（3）蒙脱石吸附

向步骤（2）所得滤液中添加终浓度2%（w/v）的蒙脱石，充分混匀，室温静置15min，于4℃以10000转/分的转速离心15min，除去蒙脱石及部分悬浮杂质，收集上清液。

（4）微滤

将步骤（3）所得上清液经孔径0.5μm的微孔滤膜错流过滤，截留滤除悬浮物、细菌及大分子量胶体物质，操作压力0.3 MPa，收集滤液。

（5）超滤浓缩

将步骤（4）所得滤液经孔径0.002μm（截留分子量约30KDa）的超滤膜错流过滤，截留滤除分子量大于30KDa的杂质（包括一种胞外主要的蛋白酶），操作压力0.4 MPa，收集滤液即得浓缩2倍的酶液；测得浓缩酶液凝乳酶活力为11972 SU/ml，总凝乳酶活力回收率为91.4%，浓缩酶液蛋白酶活力709U/ml，总蛋白酶活力回收率43.7%。

实施例3

（1）制备发酵液

以枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M 2010259为发酵菌株，通过液态发酵获得含凝乳酶的发酵液（具体发酵方法参见《一株枯草芽孢杆菌及用该菌株发酵生产凝乳酶的方法》，专利号：CN 201010504167.3）；测得发酵液中凝乳酶活力为1229 SU/ml，蛋白酶活力为148U/ml。

（2）固液分离

将步骤（1）所得发酵液用625目滤布的板框压滤，滤除发酵液中的菌体和固形物，压滤速率为6吨/小时，收集滤液。

（3）蒙脱石吸附

向步骤（2）所得滤液中添加终浓度5%（w/v）的蒙脱石，充分混匀，室温静置30min，于4℃以10000转/分的转速离心15min，除去蒙脱石及部分悬浮杂质，收集上清液。

（4）微滤

将步骤（3）所得上清液经孔径0.5μm的微孔滤膜错流过滤，截留滤除悬浮物、细菌及大分子量胶体物质，操作压力0.3MPa，收集滤液。

（5）超滤浓缩

将步骤（4）所得滤液经孔径0.002μm（截留分子量约30KDa）的超滤膜错流过滤，截留滤除分子量大于30KDa的杂质（包括一种胞外主要的蛋白酶），操作压力0.4 MPa，收集滤液即得浓缩2倍的酶液；测得浓缩酶液凝乳酶活力为2067 SU/ml，总凝乳酶活力回收率为84.1%，浓缩酶液蛋白酶活力152 U/ml，总蛋白酶活力回收率51.4%。

实施例4

向实施例2所得4倍浓度酶液中添加多种稳定剂，各稳定剂的添加终浓度（w/v）为：海藻糖20%，甘油10%，氯化钙0.01%，混合均匀制成液态型凝乳酶制剂成品。经检测，该酶制剂在室温下放置6个月，凝乳酶活力保存率为76.2%，放置9个月，凝乳酶活力保存率为61.4%。

实施例5

向实施例2所得4倍浓度酶液中添加多种稳定剂，各稳定剂的添加终浓度（w/v）为：海藻糖30%，山梨醇15%，氯化钙0.01%，混合均匀制成液态型凝乳酶制剂成品。经检测，该酶制剂在室温下放置6个月，凝乳酶活力保存率为81.4%，放置9个月，凝乳酶活力保存率为68.7%。

实施例6

向实施例2所得4倍浓度酶液中添加多种稳定剂，各稳定剂的添加终浓度（w/v）为：海藻糖40%，山梨醇15%，氯化钙0.02%，混合均匀制成液态型凝乳酶制剂成品。经检测，该酶制剂在室温下放置6个月，凝乳酶活力保存率为87.2%，放置9个月，凝乳酶活力保存率为71.8%。

实施例7

向实施例2所得4倍浓度酶液中添加多种稳定剂，各稳定剂的添加终浓度（w/v）为：海藻糖35%，山梨醇30%，氯化钙0.05%，混合均匀制成液态型凝乳酶制剂成品。经检测，该酶制剂在室温下放置6个月，凝乳酶活力保存率为89.6%，放置9个月，凝乳酶活力保存率为78.3%。

综上所述，与现有凝乳酶制备工艺相比，本发明凝乳酶活力回收率高，同时能有效去除蛋白酶杂质，明显降低酶液蛋白酶活力，从而大大提升酶制剂的品质和稳定性，延长保存期。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，均应认为包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1. 一种液态型凝乳酶制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）制备发酵液：以解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO：M 2011045或枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M 2010259为发酵菌株，通过液态发酵制得发酵液；

（2）固液分离：将步骤（1）所得发酵液用625~1250目滤布的板框压滤，取滤液，所述压滤速率为3~6吨/小时；

（3）蒙脱石吸附：向步骤（2）所得滤液中添加终浓度0.5~5%（w/v）的蒙脱石，充分混匀，室温静置10~30min，离心除去蒙脱石，收集上清液；

（4）微滤：将步骤（3）所得上清液经孔径0.5μm或1.0μm微孔滤膜错流过滤，操作压力0.2~0.3MPa，收集滤液；

（5）超滤浓缩：将步骤（4）所得滤液经孔径0.002μm超滤膜错流过滤，操作压力0.3~0.5 MPa，收集滤液即为浓缩酶液；

（6）稳定剂稳定：向步骤（5）所得浓缩酶液中添加终浓度20~40%（w/v）的蔗糖或海藻糖，终浓度10~30%（w/v）的甘油或山梨醇以及终浓度0.01~0.05%（w/v）的氯化钙，混匀，即得液态型凝乳酶制成品。

2.根据权利要求1所述液态型凝乳酶制剂的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述蒙脱石的添加终浓度为2%（w/v）。

3.根据权利要求1所述液态型凝乳酶制剂的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述离心转速为10000转/分，离心温度4℃，离心时间10min。

4.根据权利要求1所述液态型凝乳酶制剂的制备方法，其特征在于：步骤（6）所述各稳定剂的添加终浓度（w/v）为：蔗糖35%、山梨醇30%、氯化钙0.05%。