CN101993846A - 一株枯草芽孢杆菌及用该菌株发酵生产凝乳酶的方法 - Google Patents
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Abstract
一株枯草芽孢杆菌及用该菌株发酵生产凝乳酶的方法，属于微生物发酵技术领域。本发明公开了一株产凝乳酶的菌株，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)T，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2010259。应用该菌株通过液体发酵生产凝乳酶，步骤为(1)斜面培养；(2)种子培养；(3)液体发酵培养：将培养好的种子接入发酵培养基中，接种量为0.1%~0.2%，在32~36℃培养96~136h，摇床转速150rpm。本发明的优点在于：枯草芽孢杆菌是常见的非致病菌，适合凝乳酶的生产；利用枯草芽孢杆菌CCTCCNO：M2010259液体发酵生产凝乳酶具有产酶水平高，生产周期短，生产成本低，易于控制生长条件，酶提取方便等诸多优点，完全具有工业化生产的潜力。
Description
技术领域
一株枯草芽孢杆菌及用该菌株发酵生产凝乳酶的方法，具体的说是一种枯草芽孢杆菌株，以及利用该菌株发酵生产凝乳酶的方法。本发明属于微生物发酵技术领域。
背景技术
凝乳酶是乳酪生产中的关键酶，它使原奶凝固分为两个阶段：酪蛋白微胶粒中α-酪蛋白和β-酪蛋白在κ-酪蛋白作用下不会发生自发凝结，首先凝乳酶专一性的将κ-酪蛋白分解为p-κ-酪蛋白和一种巨肽，使酪蛋白的微胶粒失去稳定性；然后在Ca2+作用下p-κ-酪蛋白及α-酪蛋白和β-酪蛋白之间形成化学键从而形成沉淀。
凝乳酶传统上利用牛犊第四胃(皱胃)提取制作，随着乳酪产业不断扩大，单纯靠宰杀幼畜的方法来生产凝乳酶已经不能满足现代工业对凝乳酶的需求。上世纪五十年代以来，研究者一直努力寻求新的凝乳酶来源，目前除动物凝乳酶外，还有植物凝乳酶(无花果树液和菠萝果实)和微生物凝乳酶(主要来源于真菌)。微生物的生长特性使得微生物凝乳酶具有广阔的发展前景，关于微生物凝乳酶的研究主要集中在霉菌如米黑毛霉(Mucor miehei)和微小毛霉(Mucor pusillus)的固态发酵产酶方面，而关于细菌液态发酵的研究报道较少。
与霉菌固体发酵相比，细菌液体发酵生产凝乳酶具有生长周期短、生产成本低、易于控制生长条件等诸多优点，近几年得到研究者更多的关注。但是，细菌生产的凝乳酶活性和霉菌相比，还具有一定的差距。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有高产凝乳酶活性的枯草芽孢杆菌菌株，以及利用该菌株液体发酵生产凝乳酶的方法。
本发明的技术方案：一株产凝乳酶的菌株，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)T，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2010259。
用所述的枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M 2010259发酵生产凝乳酶的方法，通过以下步骤实现： (1)斜面培养：将枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M 2010259接种于斜面培养基上，在33℃下培养24小时；(2)种子培养：将斜面长好的菌种接入种子培养基中，在33℃培养18小时，摇床转速150转/分钟；(3)液体发酵培养：将培养好的种子接入发酵培养基中，接种量为体积百分比0.1％～0.2％，在32～36℃培养96～136小时，摇床转速150转/分钟；发酵培养基组成，单位为克/升：葡萄糖0～20，麸皮15～30，氯化钠5，七水硫酸镁5，磷酸二氢钾2，碳酸钙3，用自来水配制，pH自然，121℃灭菌30min。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CCTCC NO：M 2010259筛选、分离与鉴定详见实施例1。
上述技术方案中所述的斜面培养基为(单位为克/升)：葡萄糖20，酵母膏10，琼脂20，用自来水配制，pH自然，115℃灭菌20min。
上述技术方案中所述的种子培养基为(单位为克/升)：麸皮30，氯化钠5，七水硫酸镁5，磷酸二氢钾2，碳酸钙3，用自来水配制，pH自然，121℃灭菌30min。
凝乳酶活力的测定：用0.01mol/L氯化钙溶液配制质量浓度12％脱脂奶粉溶液，室温放置40min后使用，当天配制。取5mL 12％的脱脂奶粉溶液在35℃水浴锅中保温10min，加适量35℃预热10min的酶液(发酵液5000rpm离心5min获得之清液)，立即摇匀，开始计时，把试管倾斜45°，旋转试管，观察壁上出现絮状沉淀时为凝乳终点，记录凝乳时间。40min凝固1mL脱脂乳的酶量定义为一个索氏单位(Soxhlet Unit，SU)。 
本发明的有益效果：枯草芽孢杆菌是常见的非致病菌，适合凝乳酶的生产；利用枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M 2010259液体发酵生产凝乳酶具有产酶水平高，生产周期短，生产成本低，易于控制生长条件，酶提取方便等诸多优点，完全具有工业化生产的潜力。
生物材料样品保藏：一株产凝乳酶的菌株，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)T，该菌株已在中国典型培养物保藏中心保藏，简称CCTCC，保藏日期 2010年9月30日，保藏编号为CCTCC NO：M 2010259。
具体实施方式
在下面所述的所有具体实施例中，如无特殊说明，均为本领域常用方法。
实施例1枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CCTCC NO：M 2010259筛选分离与鉴定一、枯草芽孢杆菌T(Bacillus subtilis T)筛选分离枯草芽孢杆菌T菌株是从无锡市三里桥粮油市场购买的麸皮中分离筛选得到的。取6克麸皮到含有10粒小玻璃珠的250毫升灭菌三角瓶中，加入100毫升无菌生理盐水，在摇床上150转/分钟振荡培养20分钟，静置2小时；然后再将10毫升的上述混合液转入装有90毫升的营养肉汤培养基(蛋白胨5g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠5g/L)的三角瓶中，在33℃、150转/分钟的条件下培养12小时；取上述培养液，将其稀释成10-6、10-7、10-8倍稀释液，各浓度稀释液取100微升涂布在牛奶培养基平板(脱脂奶粉25g/L，琼脂16g/L)上，每个浓度三次重复，33℃培养24小时。
产凝乳酶菌株可水解培养基形成透明圈。挑选透明圈较大的单个菌落多次纯化，将纯化后的菌株接种到斜面培养基(葡萄糖20g/L，酵母浸出液10g/L，琼脂20g/L)上，33℃培养24小时后放于4℃冰箱保存待用。将4℃冰箱保存待用的菌株接种到营养肉汤培养基中，33℃培养144小时，并检测培养过程中凝乳酶活的变化，从结果中筛选出一株产凝乳酶活性最高的菌株，定名为T。
二、枯草芽孢杆菌T(Bacillus subtilis T)鉴定(1)形态特征在牛奶培养基平板上培养菌体成杆状，芽孢中生，椭圆形，包囊不膨大。35℃培养36小时，菌落表面干燥有褶皱，直径2～5毫米，不透明，无光泽，边缘不整齐有伞状皱褶，可扩散生长，微黄色，无伴孢晶体。
(2)16S rDNA测定利用PCR技术扩增该菌的16S rDNA序列，其寡核苷酸引物为：5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(上游引物)和5’-CGGTTACC TTGTTACGACTT-3’(下游引物)。
通过DNA自动测序仪(美国Applied Biosystems公司，型号ABI 3130) 测定扩增的16S rDNA序列，其序列如SEQ ID NO：1。
将测序结果与GeneBank中已知的16S rDNA序列进行同源性比较，发现与Bacillus subtilis strain BG-B38(登入号为EU869257.1)的同源性最高，为99％。
(3)生理生化特征根据《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠、蔡妙英编，科学出版社，2001)对菌株T进行生理生化鉴定(如下表)，其生理生化特征与枯草芽孢杆菌相吻合。 
根据菌体革兰氏染色、菌落形态观察、生理生化测试及16S rDNA序列的比对结果，该菌株与枯草芽孢杆菌相吻合，因此将其鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
实施例2枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M 2010259液体发酵生产凝乳酶(1)斜面培养：将枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M 2010259接种于斜面培养基上，在33℃下培养24小时。所用斜面培养基为(单位为克/升)：葡萄糖20，酵母膏10，琼脂条20，pH自然，115℃灭菌20分钟。
(2)种子培养：将斜面长好的菌种用接种环取一环接入种子培养基中， 在33℃培养18小时，摇床转速150转/分钟。所用种子培养基为(单位为克/升)：麸皮30，氯化钠5，七水硫酸镁5，磷酸二氢钾2，碳酸钙3，pH自然；每250毫升三角瓶装30毫升种子培养基，121℃灭菌30分钟。
(3)液体发酵培养：所用发酵培养基为(单位为克每升)：麸皮30，氯化钠5，七水硫酸镁5，磷酸二氢钾2，碳酸钙3，pH自然，121℃灭菌30min。将培养好的种子接入500毫升三角瓶中，其中发酵培养基为50毫升，接种量为50微升，摇床转速150转/分钟，在32℃培养136小时。培养结束，发酵液的凝乳酶酶活为880SU/毫升。
实施例3枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M 2010259液体发酵生产凝乳酶将培养好的种子接入500毫升三角瓶中，其中发酵培养基为50毫升，接种量为100微升，在32℃培养96小时，摇床转速150转/分钟。所用发酵培养基为(单位为克/升)：葡萄糖20麸皮15，氯化钠5，七水硫酸镁5，磷酸二氢钾2，碳酸钙3，pH自然，121℃灭菌30min。其他条件同实施例2，培养结束，发酵液的凝乳酶酶活为841SU/毫升。
实施例4枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M 2010259液体发酵生产凝乳酶将培养好的种子接入500毫升三角瓶中，其中发酵培养基为50毫升，接种量为65微升，在35℃培养120小时，摇床转速150转/分钟。所用发酵培养基为(单位为克/升)：葡萄糖16麸皮20，氯化钠5，七水硫酸镁5，磷酸二氢钾2，碳酸钙3，pH自然，121℃灭菌30min。其他条件同实施例2，培养结束，发酵液的凝乳酶酶活为1229SU/毫升。
实施例5枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M 2010259液体发酵生产凝乳酶将培养好的种子接入500毫升三角瓶中，其中发酵培养基为50毫升，接种量为70微升，在36℃培养96小时，摇床转速150转/分钟。所用发酵培养基为(单位为克/升)：葡萄糖20麸皮25，氯化钠5，七水硫酸镁5，磷酸二氢钾2，碳酸钙3，pH自然，121℃灭菌30min。其他条件同实施例2，培养结束，发酵液的凝乳酶酶活为1054SU/毫升。
实施例6枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M 2010259液体发酵生产凝乳酶将培养好的种子接入500毫升三角瓶中，其中发酵培养基为50毫升，接种量为100微升，在36℃培养136小时，摇床转速150转/分钟。所用发酵培养基为(单 位为克/升)：葡萄糖20麸皮30，氯化钠5，七水硫酸镁5，磷酸二氢钾2，碳酸钙3，pH自然，121℃灭菌30min。其他条件同实施例2，培养结束，发酵液的凝乳酶酶活为955SU/毫升。
实施例7枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M 2010259液体发酵生产凝乳酶将培养好的种子接入500毫升三角瓶中，其中发酵培养基为50毫升，接种量为50微升，在33℃培养124小时，摇床转速150转/分钟。所用发酵培养基为(单位为克/升)：麸皮15，氯化钠5，七水硫酸镁5，磷酸二氢钾2，碳酸钙3，pH自然，121℃灭菌30min。其他条件同实施例2，培养结束，发酵液的凝乳酶酶活为895SU/毫升以上已详细描述了本发明的实施方案，对本领域技术人员来说很显然可以做很多改进和变化而不会背离本发明的基本精神。所有这些变化和改进都在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一株产凝乳酶的菌株，命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）T，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2010259。
2.用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M 2010259发酵生产凝乳酶的方法，其特征在于通过以下步骤实现：
（1）斜面培养：将枯草芽孢杆菌 CCTCC NO：M 2010259接种于斜面培养基上，在33℃下培养24小时；
（2）种子培养：将斜面长好的菌种接入种子培养基中，在33℃培养18小时，摇床转速150转/分钟；
（3）液体发酵培养：将培养好的种子接入发酵培养基中，接种量为体积百分比0.1%~0.2%，在32~36℃培养96~136小时，摇床转速150转/分钟；
发酵培养基组成，单位为克/升：葡萄糖 0~20，麸皮 15~30，氯化钠5，七水硫酸镁5，磷酸二氢钾2，碳酸钙3，pH自然，121℃灭菌30 min。
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