CN103013835A - 一种高产凝乳酶的蓝色刺孢霉菌株 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型产生凝乳酶的菌蓝色刺孢霉菌株，以凝乳酶产生菌蓝色刺孢霉为出发菌株，利用紫外线、硫酸二乙酯复合因子诱变处理出发菌株，经过初筛复筛筛选出变异菌株并对其进行遗传稳定性试验，分析发酵液的凝乳酶酶活(MCA)与蛋白水解活性(PA)，得到凝乳酶酶活(MCA)高，MCA/PA比值高的优良高产菌株。

Description

一种高产凝乳酶的蓝色刺孢霉菌株

【技术领域】

本发明涉及蓝色刺孢霉的诱变选育获得的凝乳酶高产菌株，属于生物工程和酶制剂制备技术领域。 

【背景技术】

凝乳酶(chymosin，EC3.4.23.4)是一种从未断奶的小牛皱胃中发现的天门冬氨酸蛋白酶，其主要的生物学功能是有限剪切酪蛋白的κ-酪蛋白中Phe105-Met106连接的肽键，导致牛奶凝结，因此被广泛用于干酪制造业，成为食品领域中重要的酶制剂，其产值占全世界酶制剂的15％。 

目前已有不少国家对凝乳酶产生菌育种进行研究，特别是在自然选育、诱变育种和构建基因工程菌方面选育出了具有应有价值的凝乳酶产生菌。利用微生物纯培养和富集技术，对自然条件下产凝乳酶的菌种进行分离纯化，可筛选产凝乳酶的优良菌种。诱变育种，根据所采用的物理诱变剂和化学诱变剂分为物理诱变育种和化学诱变育种。物理诱变剂常用紫外线、X-射线、γ-射线和快中子等；化学诱变剂则有碱基类似物、烷化剂及脱氨剂等。为使诱变育种获得成功，出发菌株一般是野生菌株，选择合适的诱变剂及剂量处理，诱变筛选出变异菌株，有时还要对目标菌株进行遗传稳定性试验。 

在发酵工程中，菌株的选育是最基础性的研究工作。优良的生产菌种直接决定了产物的质量和产量从而决定该生产工艺是否具有市场意义和经济效益。因此，对生产菌种进行有目的的诱变处理、分离筛选，从中选育出生长速度快、数量多、酶活力高且传代稳定的菌株具有很重要的意义。诱变育种具有极其重要的实践意义，当前发酵工业和其他微生物生产所使用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通过诱变育种从而明显提高其生产性的。诱变育种除能提高代谢产物的产量外，还可达到改进产品质量、扩大品种、简化生产工艺等目的。从方法上来说，它具有简便易行、工作进度快和收效显著等优点，故仍是目前广泛使用的一种微生物育种手段。 

【发明内容】

本发明的目的是通过对蓝色刺孢霉的诱变选育获得凝乳酶高产菌株。主要工艺路线：以蓝色刺孢霉为出发菌株利用紫外线、硫酸二乙酯复合因子诱变处理出发菌株，筛选变异菌株 并对其进行遗传稳定性试验，分析发酵液的凝乳酶酶活(MCA)与蛋白水解活性(PA)，得到凝乳酶酶活(MCA)高，MCA/PA比值高的优良高产菌株。 

本发明技术方案如下： 

1)无菌操作注入10mL无菌水到铺满孢子的PDA斜面，洗下斜面上的孢子，然后振荡使孢子分散，G₃玻璃漏斗过滤，血球板计数并调整孢子浓度为10⁶～10⁷个/mL。 

2)按步骤1)制备的单孢子悬液，梯度稀释并涂布察氏平板，30℃恒温培养使菌落长大。选取较大菌落，接种50mL马铃薯葡萄糖培养基中，同一菌落重复三次，然后调节摇床转速为150r/min，30℃恒温振荡培养96h，测定不同菌落凝乳酶酶活，选酶活最大菌株PDA斜面保藏，并作为诱变出发菌株。 

3)同支灭菌试管中加入5mL pH6.5磷酸缓冲液制备的孢子悬液和5mL 2％硫酸二乙酯溶液，振荡处理30～40min，加入0.5mL灭菌的2％Na₂S₂O₃终止反应。孢子悬液全部倒入含有转子的无菌平皿中，紫外诱变箱内距15W紫外灯30cm处，打开平皿盖磁力搅拌下，紫外线照射180～240s，取1mL于无菌试管，并立即浸入冰水中60min后，30℃避光培养48h，培养液梯度稀释涂布察氏平板，避光培养72h。 

4)随机挑取诱变菌株，接种50mL马铃薯葡萄糖培养基中，1株菌接1瓶，同时以出发菌株做对照。30℃，150r/min，培养96h，测定发酵液凝乳酶活，选择比对照酶活大10％的菌株用于复筛。 

5)将步骤4)中的初筛菌株制10⁶～10⁷个/mL的孢子悬浮液，接种孢子悬浮液，1株菌接种3瓶，30℃，150r/min，培养96h后测定发酵液凝乳酶活。 

6)将步骤5)复筛出的不同菌株转接PDA斜面5代，同5)摇瓶发酵，测定发酵液凝乳酶活，绘制不同菌株的遗传稳定性曲线。 

7)测定步骤6)中遗传稳定好的菌株的凝乳酶酶活(MCA)和蛋白水解活性(PA)。凝乳酶酶活(MCA)高，凝乳酶酶活(MCA)与蛋白水解活性(PA)比值高的为优良高产菌株。 

上述试剂和培养基配方，如无特别说明，均为本领域常规试剂和培养基。 

上述步骤中凝乳酶活力的测定方法为：用0.01mol/L的CaCl₂配制100g/L的脱脂乳，放置40min使所形成的牛乳体系趋于稳定，然后取5mL脱脂乳于试管中36℃保温5min。发酵液5000r/min离心10min使菌丝沉淀，取其上清液0.5mL加入保温的脱脂乳中，漩涡混合器上迅速混合均匀并开始计时，当试管壁上有凝结小块，准确记录发酵上清液使牛乳凝固的时间。定义40min凝固100g/L的脱脂乳1mL所需的凝乳酶量为一个索氏单位(Soxhelt  unit，SU)。 

凝乳酶活公式为： $\mathrm{SU}=\frac{2400\×5\×D}{T\×0.5}$

式中：T-凝乳时间/s；D-稀释倍数。 

上述步骤7)蛋白水解活性的测定采用Folin试剂法，用10mL0.1NNaOH溶解酪蛋白，pH6.2磷缓冲液定容至100mL。发酵液36℃保温，660nm处比色测酶活力。定义36℃、pH6.2每1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量为一个蛋白酶活力单位(U)。 

蛋白水解活性公式为： 

式中：A-蛋白酶活测定时OD值在标准曲线上对应的酪氨酸含量μg/mL。 

酪氨酸标准曲线：不同浓度酪氨酸1mL、福林试剂1mL和0.4mol/L Na₂CO₃ 5mL混匀，36℃水浴显色20min，测660nm处OD值，绘制不同浓度酪氨酸与OD值的标准曲线 

本发明的有益效果： 

1.蓝色刺孢霉是一种新型的凝乳酶产生菌，具有重要的研究意义； 

2.本发明采用紫外线、硫酸二乙酯复合因子诱变处理出发菌株，操作简单，效果好。 

3.通过对蓝色刺孢霉进行诱变选育获得凝乳酶高产菌株，凝乳酶活力与蛋白水解活性比值较高，遗传稳定性好。 

【附图说明】

图1：复合诱变菌株发酵液凝乳酶酶活与传代次数的关系。 

【生物材料保藏信息】 

菌种DU10，分类命名为蓝色刺孢霉(Sporothrix Cyanescens)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC 5423，保藏日期为2011年11月3日。 

【具体实施方式】

下面结合实施例对本发明的方法作进一步说明，但不限于此。实施例中使用的蓝色刺孢霉是我们从红曲米中分离纯化出的产凝乳酶菌株。通过紫外线、硫酸二乙酯复合因子诱变处理出发菌株，初筛出凝乳酶高产菌株，然后再进行复筛。最后对复筛出的菌株进行遗传稳定性和发酵产酶品质分析。 

实施例1 

1)诱变剂的选择 

硫酸二乙酯为单功能烷化剂，易取代DNA分子中活泼的氢原子，引起烷化反应改变DNA分子结构。紫外线是常用的物理诱变剂，可作用于基因使其发生突变，机理可能为：紫外辐射使DNA分子形成嘧啶二聚体，妨碍DNA双螺旋结构解开，影响DNA的复制和转录。 

考虑出发菌株为野生菌株，结合各诱变剂的可操作性及其诱变效果，选择硫酸二乙酯作为化学诱变剂，紫外线作为物理诱变剂，进行探索性诱变。 

1)无菌操作注入10mL无菌水到铺满孢子PDA斜面，洗下斜面上的孢子，然后振荡使孢子分散，G₃玻璃漏斗过滤，血球板计数并调整孢子浓度为10⁶～10⁷个/mL。 

2)按步骤1)制备单孢子悬液，梯度稀释并涂布察氏平板，30℃恒温培养使菌落长大。选取较大菌落，接种50mL马铃薯葡萄糖培养基中，同一菌落重复三次，然后调节摇床转速为150r/min，30℃恒温振荡培养96h，测定不同菌落凝乳酶酶活，选酶活最大菌株PDA斜面保藏，并作为诱变出发菌 

3)同支灭菌试管中加入5mL pH6.5磷酸缓冲液制备的孢子悬液和5mL2％硫酸二乙酯溶液，振荡处理35min，加入0.5mL灭菌2％Na₂S₂O₃终止反应。孢子悬液全部倒入含有转子的无菌平皿中，紫外诱变箱内距15W紫外灯30cm处，打开平皿盖磁力搅拌下，紫外线照射200s，取1mL于无菌试管，并立即浸入冰水中1h后，30℃避光中间培养48h，培养液涂布察氏平板，避光培养72h。 

4)随机挑取诱变菌株，接种50mL马铃薯葡萄糖培养基中，1株菌接1瓶，同时出发菌株做对照。30℃，150/min，培养96h，测定发酵液凝乳酶活，选择比对照酶活大10％的菌株用于复筛。先DES后UV诱变后的正突变株可能为DU10、DU12、DU22、DU23和DU24，它们的凝乳酶活均大于对照10％，转接它们于PDA斜面，以备复筛。 

5)将步骤4)中的初筛菌株制备10⁶～10⁷个/mL的孢子悬浮液，接种孢子悬浮液，1株菌接种3瓶，30℃，150r/min，培养96h测定发酵液凝乳酶活。复合理化因子诱变菌株DU10和DU12，凝乳酶酶活比出发菌株分别提高了105.16％和36.65％，可能为正突变株，为了保留这一意料不到的结果，申请人对于所筛选的菌种DU10在中国普通微生物菌种保藏管理中心进行了保藏，保藏号为CGMCC 5423，并随申请文件提供保藏证明复印件。 

6)将步骤5)复筛出的不同菌株转接PDA斜面5代，同5)摇瓶发酵，测定发酵液凝乳酶活，绘制不同菌株的遗传稳定性曲线，见说明书附图1。以对照菌株为基准，DU10、DU12则整阶段较为平稳。 

7)测定复合诱变菌株DU10和DU12的凝乳酶活力与蛋白水解活力(测定方法同发明内容部分)。与对照菌株相比，复筛菌株凝乳酶酶活有所变化，而蛋白水解活性变化较小，MCA/PA比值的大小将反映发酵液中凝乳酶的好与坏。其中DU10和DU12发酵液的凝乳酶活力高，就发酵液MCA/PA比值而言，DU10和DU12比其他菌株都高。所以，可认为DU10和DU12为变异菌株。就变异菌株发酵液颜色来说，DU10为浅黄色，有别于其他菌株的暗 红色或紫红色，此种情况的出现可能为菌株基因突变所致。 

当理解的是，上述具体实施方式仅仅是举例性说明，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。 

Claims (4)

1.蓝色刺孢霉菌株，其保藏号是CGMCC 5423。

2.权利要求1所述的蓝色刺孢霉菌株在生产凝乳酶中的应用。

3.权利要求1所述的蓝色刺孢霉菌株在制备干酪中的应用。

4.权利要求1所述的蓝色刺孢霉菌株的选育方法，其特征在于以蓝色刺孢霉菌株作为出发菌，通过紫外线和硫酸二乙酯复合因子诱变处理出发菌株，初筛出凝乳酶高产菌株，然后再进行复筛。