CN102165055A - 具有大规模基因组重复的曲霉 - Google Patents
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Abstract
在属于曲霉(Aspergillus)的菌株中引起突变，目的在于不使用重组DNA技术而培育具有多种工业实用性酶的改进生产率的曲霉菌株。所述突变产生具有至少900kb的大规模基因组重复的曲霉菌株，所述菌株具有生产酱油所需的多种酶例如蛋白酶的高生产率。该菌株能够有效生产酱油和多种其他食品。
Description
技术领域
本发明涉及具有900kb或以上的大规模基因组区域的重复的曲霉等。
背景技术
由曲霉所产生的酶已使用在多种工业中。
例如，由曲霉产生的多种酶已用于生产日本的传统食品酱油。为了生产酱油，将曲霉生长在作为原料的大豆与小麦中，并使其产生多种酶。这些由曲霉产生的酶分解蛋白质、糖类、脂类等，并在随后步骤中促进乳酸发酵和酵母发酵。当曲霉在此过程中产生大量分解原料的酶时，可以提高原料的利用率和压缩水平，以大幅提高生产率。此外，因为向乳酸发酵和酵母发酵提供了足够量的基质，发酵适宜地进行。因此使酱油品质大幅提升。
因此，从工业观点来看，具有高的酶生产率的曲霉的育种是非常重要的。为此，到目前为止一直积极地进行育种。因为米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40的全基因组序列已被鉴定(非专利文献1)，该菌株适于育种。
以高的酶生产率为目的的曲霉育种方法，大致分为突变方法和遗传重组方法。
遗传重组方法包括使用转化法将目标基因导入曲霉来育种转化体。通过该方法导入的基因通常大小为5到6kb。10kb或更大基因的导入，由于转化效率显著降低，因此非常难以成功。此外，被导入的区域包括目标基因的启动子区、结构基因区或终止子区、或在某些情况下可以在筛选中用作标志物的基因。因此，在10kb或以下片段中引入多个基因是困难的。因此，基因重组方法只在仅需高效生产单一酶的工业领域例如酶的生产中才是有效的，而在应该同时高效生产用于分解原料的多个酶的工业领域例如食品制造中，遗传重组方法并不有效。在作为食品制造的实例而引用的酱油制造中，需要生产大量各种不同的酶，包括用于提高产率的分解各种原料的酶、用于提高压缩水平的各种酶、用于富集浓郁口味的酶等。为了通过遗传重组方法同时高效生产这些各种不同的酶，应该重复地进行转化。为此，需要构建可以将重组体筛选中使用的标志物循环再利用的系统。但是，构建这种系统是极其困难的。即使假设转化被重复地进行并因此将大量种类的酶的基因插入到基因组中，但由于与基因座和表达控制系统相关的问题，被插入的基因并不总是能够充分发挥作用。此外，因为曲霉的酶生产机制的未知部分仍然很多，所以仅仅通过插入基因并无法保证能够提高目标酶的生产率。
此外，使用基因重组技术进行食品制造，在日本市场上仍未被接受。因此，遗传重组方法应用于食品制造，在实践中存在一些问题。因此，育种通过使用例如紫外线辐照的突变技术进行。但是，该方法引起目标突变之外的伴生突变。因此，在这种情况下，即使能够获得具有所需酶的高生产率的突变体，仍频繁地发生一些问题，例如生长速率缓慢、其他酶的生产率降低等。
此外，曲霉突变体在许多情况下在遗传上不稳定。也就是说，当突变体生长时，经常观察到突变体的性质变得与其亲代菌株的性质相同(在后文中这种现象将被称为“回复突变”)，这在工业应用中引起麻烦。
因此，尽管在工业例如同时需要多种酶的食品工业中需要同时高效生产各种酶的曲霉，但仍存在上面讨论的问题。
使用突变方法对高效生产酶的曲霉进行育种的已知方法的实例如下：包含使用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(在后文中成为NTG)处理米曲霉RIB128以获得具有高植酸酶活性的菌株，并降低清酒中的植酸量并增加生物活性物质肌醇的量的方法(专利文献1)；包含使用NTG处理米曲霉AJ117281以获得具有高蛋白酶活性的突变株，并生产富含氮的蛋白水解物的方法(专利文献2)；包含使用NTG处理米曲霉AJ117290(FERMP-14259)以获得具有高谷氨酰胺酶活性的突变株，并生产具有高谷氨酸含量的蛋白水解物的方法(专利文献3)等。对于突变的诱导来说，用于诱导突变的药剂的实例不仅包括上述的NTG，还包括其他常用的化学物质例如羟胺、乙基甲基磺酸等，或用紫外线、放射线、X-射线等辐照。
使用突变方法的已知育种的其他实例包括：包含使用NTG突变米曲霉O-1013(FERM P-16528)以获得高效生产去铁正铁5，7-二羟基黄酮(Deferriferrichrysin)的突变株的方法(专利文献4)；包含使用紫外线处理酱油曲霉(Aspergillus sojae)以获得具有白色分生孢子的白色曲霉突变株，并获得具有良好色调的日本味噌的方法(专利文献5)；包含使用例如X-射线诱变米曲霉以获得具有降低的异戊醛生产率，用于防止作为清酒变质气味的闷(stuffy)味的发生的方法(专利文献6)；包含用重离子束辐照红曲霉(Monascus)以获得高效生产作为降胆固醇物质的红曲菌素K的曲霉菌株的方法(专利文献7)；包含用赋予线性能量的铁离子束辐照微生物以转移约1.2kb的插入突变和缺失突变的方法(专利文献8)；使用重离子束构建黑曲霉突变株的实例(非专利文献2)等。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：JP-A-6-153896
专利文献2：JP-A-7-274944
专利文献3：JP-A-10-210967
专利文献4：JP-A-2008-054580
专利文献5：JP-A-7-222584
专利文献6：JP-A-9-70287
专利文献7：JP-A-2007-228849
专利文献8：JP-A-2008-306991
非专利文献
非专利文献1：Nature(2005)438，1157-61
非专利文献2：Food Sci.Technol.Res.(1999)5(2)，153-155
发明概述
本发明待解决的问题
本发明的目的是不使用遗传重组方法培育其中多种酶的生产率已被提高的曲霉。
解决问题的手段
为了实现上述目的，本发明的发明人通过对属于曲霉属(Aspergillus)的菌株(例如酱油曲霉(Aspergillus sojae)或米曲霉(Aspergillus oryzae))进行诱变，并筛选其中靶基因和靶基因邻近存在的基因同时变得高活性的突变株，成功获得了具有900kb或以上的大规模基因组区域重复的曲霉，从而完成了本发明。
即，本发明涉及下列[1]到[13]。
[1]一种属于曲霉属(Aspergillus)的菌株，所述菌株具有900kb或900kb以上的基因组区域的重复。
[2][1]中所述的菌株，其中属于曲霉属的菌株是属于米曲霉(Aspergillus oryzae)或酱油曲霉(Aspergillus sojae)的菌株。
[3][1]或[2]中所述的菌株，其具有900到2,400kb的基因组区域的重复。
[4][1]到[3]任一项中所述的菌株，其在重复的基因组区域中包含碱性蛋白酶基因。
[5][1]到[4]任一项中所述的菌株，其在重复的基因组区域中包含α-淀粉酶基因。
[6][1]到[5]任一项中所述的菌株，其具有对应于米曲霉RIB40(NRBC100959)的第二染色体上SC003的A0090003001003-A0090003001259区域的基因组区域的重复。
[7][1]到[6]任一项中所述的菌株，其在麸曲中的传代培养试验中，直至至少第10代为止未显示出回复突变。
[8][1]到[7]任一项中所述的菌株，其与亲代菌株相比蛋白酶活性增加两倍或两倍以上。
[9][1]到[8]任一项中所述的菌株，其与亲代菌株相比α-淀粉酶活性增加两倍或两倍以上。
[10][1]到[9]任一项中所述的菌株，其是NITE ABP-733(NITE BP-733)或NITE ABP-734(NITE BP-734)。
[11][1]到[10]任一项中所述的菌株，其通过诱变获得。
[12]一种酱油曲，其通过使用[1]到[11]任一项中所述的菌株来生产。
[13]一种酱油，其通过使用[12]中所述的酱油曲来生产。
发明优点
根据本发明，可以成功地获得同时高效生产多种酶的曲霉。由于能够同时高效生产多种酶，所述曲霉从工业观点来看非常有用。此外，因为没有使用遗传重组方法，它能够容易地使用在食品制造中。具体来说，该曲霉能够大量生产在制造酱油中所需的分解各种原料的酶(蛋白酶等)，这导致原料利用效率的显著增加。
已知曲霉突变株时常发生回复突变。然而，由于本发明的曲霉菌株具有大规模基因组重复并且不具有小的突变例如点突变，因此它在遗传上稳定并且很少发生回复突变。因此，与常规方法相比能够显著提高产率。不导致回复突变的效果，因为在酱油制造中不仅能够提高原料的利用效率，而且能够大幅减缓管理种曲(曲引)的劳力，大大有助于生产率的提高，因此在工业应用中是特别优越的。
附图简述
图1显示了在麸曲中本发明的菌株S1-1、S1-2和S1-3的蛋白酶活性的测量结果。
图2显示了在麸曲中本发明的菌株S1-1、S1-2和S1-3的α-淀粉酶活性的测量结果。
图3显示了在麸曲中本发明的菌株R40-1的蛋白酶活性的测量结果。
图4显示了在麸曲中本发明的菌株R40-1的α-淀粉酶活性的测量结果。
图5显示了在麸曲中本发明的菌株S1-1、S1-2和S1-3传代培养试验中的蛋白酶活性的测量结果。
图6显示了在酱油曲中本发明的菌株S1-1、S1-2和S1-3的蛋白酶活性的测量结果。
图7显示了在酱油曲中本发明的菌株S1-1、S1-2和S1-3的曲消化水平的测量结果。
图8显示了使用微阵列，通过阵列比较基因组杂交方法(在后文中称为aCGH方法)分析本发明的菌株S1-1、S1-2和S1-3的结果。
图9显示了通过aCGH方法分析本发明的菌株R40-1的结果。
图10显示了通过定量PCR方法对本发明的菌株S1-1进行基因拷贝数验证分析的结果。
图11显示了在麸曲中对应于本发明的菌株S1-1的重复区域的酶与另一种不与其对应的酶的酶活性的测量结果。
实施本发明的最佳方式
在本发明中使用的曲霉的实例包括酱油曲霉(Aspergillus sojae)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)等。其中，属于酱油曲霉和米曲霉的菌株是优选的。
这些菌株的实例包括已被保藏机构保藏并且对于本技术领域的专业人员来说容易获得的菌株，例如酱油曲霉262(FERM P-2188)、酱油曲霉2165(FERM P-7280)、酱油曲霉(ATCC42251)、米曲霉(IAM2638)、米曲霉RIB40(NBRC100959)等。
本发明的菌株的特征在于它具有至少两个重复拷贝的900kb或以上、优选从900到2,400kb的大规模基因组区域重复。这些重复的基因组区域排列在单一染色体上，或位于彼此分离的不同染色体上。
在酱油的制造中，需要能够同时高效生产用于水解蛋白质并产生对浓郁口味有贡献的氨基酸的蛋白酶、以及用于产生在乳酸发酵和酵母发酵中作为替代物的葡萄糖的淀粉酶的曲霉。基于米曲霉RIB40的基因组数据，已经阐明了这些酶的基因位于同一染色体上，没有被着丝粒隔开。通过首先选择蛋白酶生产能力提高两倍以上的突变株，然后从突变株中进一步选择淀粉酶活性提高两倍或两倍以上的菌株，能够有效地获得具有同时显示出这些酶的高活性并具有大规模基因组区域重复的性质稳定的曲霉。尽管在本文中作为实例描述了蛋白酶与淀粉酶的组合，但任何组合都是可能的，只要基因位于同一染色体上并没有被着丝粒隔开即可。
作为这种大规模基因组区域重复的典型实例，可以提到的是源自于(对应于)含有碱性蛋白酶基因和/或α-淀粉酶基因并位于米曲霉RIB40(NBRC100959)的第二染色体上的SC003区域的重复，所述米曲霉RIB40已被国立技术和评估研究所生物资源中心(Biological Resource Center of National Institute of Technology and Evaluation (NITE))(或国立酿造研究所(National Research Institute of Brewing))保藏。“SC003区域”可以通过检索DOGAN(NITE上的已分析基因组数据库)(http://www.bio.nite. go.jp/dogan/Top)指定为(http://www.bio.nite.go.jp/dogan/GeneMap？GENOME_ID＝ao_G2)，所述DOGAN是国立技术和评估研究所(National Institute of Technology and Evaluation(NITE))的基因组分析数据库。此外，SC003区域显示在DNA Res.2008 Aug；15(4)；172-83的图2中。
可选地，作为大规模基因组区域重复的典型实例，可以提到如后文实施例中所显示的第二染色体上的各个区域，即包含碱性蛋白酶基因和α-淀粉酶基因并源自于酱油曲霉的区域，例如约900kb的区域(对应于米曲霉RIB40中A0090003000925-A0090003001259的区域)、约1,500kb的区域(对应于米曲霉RIB40中A0090003001003-A0090003001556的区域)、约2,400kb的区域(对应于米曲霉RIB40中A0090003000654-A0090003001556的区域)以及源自于米曲霉RIB40的2,100kb的区域(A0090003000759-A0090003001558)(图9)。
在这些区域中，作为在本申请中使用的重复区域，对应于米曲霉RIB40(NRBC100959)中第二染色体上SC003的A0090003001003-A0090003001259的区域是特别优选的。对应区域不限于来源于米曲霉RIB40的区域，而是包括源自于可以在本发明中使用的菌株的对应区域。
尽管本发明的菌株不受传代培养中是否发生回复突变的限制，但不发生回复突变的菌株是优选的。本文中使用的术语“回复突变”是指大规模基因组重复的下降。是否引起回复突变如下所述来确定。在将菌株在麸曲中培养4天后，将在菌株的重复中所包含的酶基因的活性(在这里是蛋白酶活性、淀粉酶活性等)或表达量与亲代菌株进行比较。与亲代菌株相比显示出两倍或两倍以上增加的菌株被定义为没有发生回复突变的菌株，而显示出等于或低于亲代菌株的酶活性的菌株被定义为已发生回复突变。此外，菌株是否发生回复突变如下所述来确定。在通过使用麸曲的常规方法进行的传代培养试验中，到至少第10代为止没有显示出回复突变的菌株被称为“不回复突变菌株”，而在第10代之前发生回复突变的菌株被称为“回复突变菌株”。
本发明的菌株可以通过公知的任意诱变方法来构建，例如NTG处理或使用重离子束、紫外线或X-射线辐照。
例如，在使用紫外线辐照的情况下，将上述菌株的约106个分生孢子涂布在酪蛋白培养基[0.4％乳酪蛋白、0.05％酪蛋白氨基酸、0.36％磷酸二氢钾、1.43％；磷酸氢二钠、0.5％硫酸镁、0.002％硫酸亚铁、2％琼脂，pH6.5]上，并将平板在净化操作台中使用紫外线辐照约5至约10分钟。
作为用于筛选诱变菌株的方法的实例，可以提到的是筛选具有高蛋白酶生产率的菌株的方法。方法包括用辐照过的曲霉菌株接种酪蛋白培养基，将菌株在适合于曲霉生长的温度下培养适当时间。在培养完成后，选择在其菌落周围显示出大的透明区的菌株，并检查菌株的酿造性质，以筛选显示出高蛋白酶生产率的突变株。
在紫外线辐照后，可以通过例如下面的方法筛选菌株。通过在30℃下在平板上培养3至5天，使分生孢子固定。然后，通过单菌落分离选择性收集并纯化显示出大的透明区的菌株。收集其他菌株的全部分生孢子，用无菌水适当稀释，然后涂布在酪蛋白平板上。在30℃下培养3至5天后，通过单菌落分离选择性收集并纯化显示出大的透明区的菌株。
作为属于曲霉属的本发明菌株的实例，实施例1中描述的S1-1菌株和实施例2中描述的R40-1菌株于2009年4月6日保藏于独立行政法人产品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(Patent Microorganism Depositary，National Institute of Technology and Evaluation(2-5-8 Kazusakamatari，Kisarazu-shi，Chiba，292-0818 JAPAN))，保藏号分别为NITE P-733和NITE P-734。此外，对于S1-1菌株和R40-1菌株，根据布达佩斯条约向机构提交了向国际保藏转移的请求，并分别被接受为NITE ABP-733和NITE ABP-734。
后文中，将参考下面的实施例对本发明进行详细描述。但是，本发明的技术范围不受所述实施例的限制。
(麸曲制备方法)
通过常规方法评估曲霉的酶活性。即，将其上喷洒有80％水的5g小麦麸装到150ml三角瓶中，并在121℃下灭菌50分钟。然后接种约2铂环曲霉，并在30℃下培养4天。在培养完成后，加入100ml无菌水。然后将培养瓶用橡胶塞密封、充分振摇并使其在室温下静置4小时。在通过2号滤纸(由Advantech公司制造)过滤后，将获得的提取液作为酶样品。
(测量蛋白酶活性的方法)
将获得的酶样品适当稀释，并按照在“Shoyu Shiken-Ho(化验酱油的方法)(Methods for Testing Soy Sauce)”(日本酱油实验室，1985，287页)中描述的下列方法进行测量。
将100mg特级L-酪氨酸溶解在蒸馏水中并定容至1L。在10ml容量瓶中分别导入1、2、3、4和5ml溶液，并加入蒸馏水定容至10ml，以获得10、20、30、40和50μg/ml的酪氨酸标准溶液。在试管中各导入2ml酪氨酸标准溶液，并加入5ml 0.55M的碳酸钠溶液和1ml稀释三倍的福林试剂(Folin reagent)。在恒温水槽中在30℃下维持30分钟后，使用分光光度计在660nm处测量吸光度。作为对照池，使用蒸馏水并进行相同的操作。因此，以酪氨酸含量(μg)为横坐标，660nm处吸光度为纵坐标绘制出标准曲线。将上述酶样品适当稀释，并取其1ml与1ml 1.5％乳酪蛋白溶液混合。在30℃下反应10分钟后，通过加入3ml 0.4M的三氯乙酸溶液终止反应。然后将反应混合物在恒温水槽中在30℃下放置30分钟，将由此形成的沉淀通过2号滤纸(由Advantech公司制造)进行过滤。将2ml滤液导入试管，并测量660nm处的吸光度。作为空白，在加入酶之前加入3ml 0.4M的三氯乙酸溶液并执行同样的步骤。从样品的吸光度中减去空白的吸光度而获得的差值，被称为ΔE。然后从标准曲线和ΔE确定酪氨酸的量。能够在1分钟内释放相当于1μg酪氨酸的非蛋白质物质的酶量被称为1U(单位)，并计算出每克麸曲的值。
(测量α-淀粉酶活性的方法)
将获得的酶样品适当稀释。使用α-淀粉酶测定试剂盒(Kikkoman酿造分析试剂盒，编号60213)，按照试剂盒随附的方案进行测量。α-淀粉酶活性通过将每克麸曲能够在1分钟内释放出1μmol 2-氯-4-硝基苯酚的滴度称为1U(单位)来表示。
(测量CMCase活性的方法)
使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物，通过二硝基水杨酸(DNS)方法进行检测。将1.0g底物溶解在60ml蒸馏水中，并使用0.4M乙酸将pH调整至4.8。接下来，加入25ml 0.4M乙酸缓冲液(pH4.8)，并用蒸馏水将总体积调整至100ml，以获得1％的底物溶液。向该1％底物溶液加入等量酶样品，并在40℃下进行1小时的反应。在通过加热至100℃ 10分钟以终止反应后，取0.75ml液体反应混合物至试管中。向其加入0.75ml DNS反应试剂并将混合物充分振摇。接下来，将试管用玻璃塞密封并煮沸7分钟。冷却后，加入3ml蒸馏水，并测量535nm处的吸光度。能够在1分钟内释放出相当于1mg葡萄糖量的还原糖的酶量，被称为1U(单位)。
实施例1
将属于酱油曲霉的S1菌株(归Kikkoman Corporation所有)的分生孢子，通过以上述方式用紫外线辐照或通过紫外线辐照之外的公知诱变处理方法之一进行诱变。然后将分生孢子涂布在酪蛋白培养基上，并根据透明区大小进行筛选。将显示出比亲代菌株的透明区大1.5倍或以上的菌株，在麸曲中于30℃培养4天，并分别命名为S1-1、S1-2和S1-3。S1-1是经紫外线辐照通过诱变所获得的菌株，而S1-2和S1-3是通过紫外线辐照之外的公知诱变处理方法所获得的菌株。通过上述测量方法对每个菌株进行蛋白酶活性测量。作为测量的结果，S1-1、S1-2和S1-3各自显示出比亲代菌株高两倍或两倍以上的蛋白酶活性和α-淀粉酶活性。
图1显示了在麸曲中每个突变菌株的蛋白酶活性测量结果。
图2显示了在麸曲中每个突变菌株的α-淀粉酶活性测量结果。
实施例2
将米曲霉RIB40(NBRC100959)的分生孢子以与上述相同的方式用紫外线辐照进行诱变。与实施例1中相同，然后将这些分生孢子涂布在酪蛋白培养基上，并根据透明区大小进行筛选。将显示出比亲代菌株的透明区大1.5倍或以上的菌株在麸曲中于30℃培养4天，并命名为R40-1菌株。接下来，通过上述测量方法测量蛋白酶活性。作为测量结果，R40-1菌株显示出比亲代菌株高两倍以上的蛋白酶活性和α-淀粉酶活性。
图3显示了在麸曲中获得的突变菌株的蛋白酶活性测量结果。
图2显示了在麸曲中获得的突变菌株的α-淀粉酶活性测量结果。
实施例3
此外，将获得的突变株S1-1、S1-2和S1-3在麸曲中进行了传代培养试验，并按照上述测量方法测量了蛋白酶活性(图5)。正如图5清楚显示的，所有获得的突变株直到第10代为止稳定地显示出比亲代菌株高(两倍或两倍以上)的蛋白酶活性，表明菌株未发生回复突变。
实施例4
(酱油曲的制造)
向蒸煮过并脱脂的大豆与焙烤并碾碎的小麦粒的混合物加入0.1％(w/w)作为曲引的每种上述菌株，并将得到的混合物进行3天的制曲。然后按照上面的测量方法测量获得的酱油曲的蛋白酶活性(图6)。正如图6清楚显示的，所有S1-1、S1-2和S1-3显示出比亲代菌株高两倍或以上的蛋白酶活性。
实施例5
按照在“Shoyu Shiken-Ho(化验酱油的方法)(Methods for Testing Soy Sauce)”(日本酱油实验室，1985，104页)中描述的下列方法，测量上述酱油曲的曲消化水平。
如下所述测量酱油曲的曲消化水平。在500ml三角瓶中装入100g每种酱油曲，并向其加入200ml 18.5％的氯化钠水溶液。将摇瓶用软木塞密封，然后在37℃下进行1周的自消化。在此期间，将摇瓶中的混合物每天搅拌一次。将如此消化的酱醪(醪液)在混合器中均匀混合，并测量酱醪的总氮含量和氯化钠含量。此外，将搅匀的酱醪过滤，并也测量滤液的总氮含量和氯化钠含量。从测量数据，按照下式确定消化水平(图7)。正如图7清楚显示的，S1-1、S1-2和S1-3都显示出比S1、即亲代菌株更高的消化水平。曲消化水平的提高直接导致酱油制造中原料的利用效率的提高。
曲消化水平(％)＝[(酱醪中的NaCl含量％)/(酱醪中的总N含量％)]×[(滤液中的N含量％)/(滤液中的NaCl含量％)]×100
实施例6
(使用微阵列，通过阵列比较基因组杂交方法(aCGH方法)进行的分析)
使用微阵列(Agilent Technologies)，通过aCGH方法详尽分析了S1-1菌株的基因拷贝数变化。结果发现，包含碱性蛋白酶基因和α-淀粉酶基因的约900kb区域(对应于米曲霉RIB40中A0090003000925-A0090003001259)中存在的基因与亲代菌株相比增加两倍或两倍以上，这表明S1-1菌株具有大规模基因组重复。也通过aCGH分析了其他蛋白酶高产菌株。结果发现，S1-2具有约1,500kb的区域(对应于米曲霉RIB40中A0090003001003-A0090003001556的区域)的大规模基因组重复，S1-3具有约2,400kb的区域(对应于米曲霉RIB40中A0090003000654-A0090003001556的区域)的大规模基因组重复，其中每个区域包含碱性蛋白酶基因和α-淀粉酶基因(图8)。
同样，通过aCGH方法分析了在实施例2中获得的R40-1菌株。结果发现，该菌株与S1-1菌株类似具有约2,100kb的包含碱性蛋白酶基因和α-淀粉酶基因的区域(A0090003000759-A0090003001558)的大规模基因组重复(图9)。
实施例7
(通过定量PCR方法进行的碱性蛋白酶基因拷贝数验证分析)
通过定量PCR方法定量了S1-1菌株的重复区域中每个基因的基因拷贝数，并与亲代菌株S1中的进行比较(M×3000P，Stratagene)(图10)。PCR进行40个循环，每个循环由95℃ 10秒、60℃20秒和72℃15秒构成。作为对照基因，使用了第一染色体中的brlA基因、第三染色体中的flbA基因和第四染色体中的pceB基因。如图10所清楚显示的，S1-1菌株与亲代菌株S1相比，存在于已通过aCGH方法证实为重复的约900kb区域中的碱性蛋白酶基因(alp)、淀粉酶基因(amy)和pceA基因，其每种的量高达两倍，由此验证了aCGH方法的分析结果。使用的引物的碱基序列描述如下(表1)，即brlA-F(SEQ ID NO：1)、brlA-R(SEQ ID NO：2)、alp-F(SEQ ID NO：3)、alp-R(SEQ ID NO：4)、amy-F(SEQ ID NO：5)、amy-R(SEQ ID NO：6)、pceA-F(SEQ ID NO：7)、pceA-R(SEQ ID NO：8)、flbA-F(SEQ ID NO：9)、flbA-R(SEQ ID NO：10)、pceB-F(SEQ ID NO：11)和pceB-R(SEQ ID NO：12)。引物序列不仅可用于酱油曲霉，而且可用于可以使用在本申请中的菌株中重复区域中的各种基因拷贝。
表1：用于定量PCR的引物序列
实施例8
使用S1-1菌株制备麸曲，并通过上述方法测量每种酶的活性。结果，由基因组重复中包含的基因编码的酶(蛋白酶和α-淀粉酶)的活性与亲代菌株相比显著增加，即增加两倍或两倍以上，而未包含在上述区域中的羧甲基纤维素酶(CMCase)活性没有显示出明显变化(图11)。结果表明，蛋白酶和α-淀粉酶活性的增加依赖于重复。
尽管已通过参考具体实施例对本发明进行了详细描述，但本技术领域的专业人员应该理解，可以做出各种修改和改变而不背离本发明的精神和范围。
本申请是基于2009年4月17日提交的日本专利申请(日本专利申请2009-100645)，其公开内容在此引为参考。
工业实用性
通过将本发明的属于曲霉属的菌株接种到酱油原料中并进行培养，能够获得多种酶的生产能力提高的固体曲和液体曲。使用所述曲用醪液生产酱油。通过将本发明的菌株接种到大米原料中并进行培养；可以生产醪糟、醪糟类产品和清酒。此外，通过本发明菌株的液体培养，可以生产包含被消化的谷蛋白的调味液。因此，本发明涉及这样的生产方法以及由此生产的各种食品例如酱油。
序列表公开文本
SEQ ID NO：1表示用于brlA基因的引物序列。
SEQ ID NO：2表示用于brlA基因的引物序列。
SEQ ID NO：3表示用于alp基因的引物序列。
SEQ ID NO：4表示用于alp基因的引物序列。
SEQ ID NO：5表示用于amy基因的引物序列。
SEQ ID NO：6表示用于amy基因的引物序列。
SEQ ID NO：7表示用于pceA基因的引物序列。
SEQ ID NO：8表示用于pceA基因的引物序列。
SEQ ID NO：9表示用于flbA基因的引物序列。
SEQ ID NO：10表示用于flbA基因的引物序列。
SEQ ID NO：11表示用于pceB基因的引物序列。
SEQ ID NO：12表示用于pceB基因的引物序列。
PCT/RO/134表
纸件的扫描件(注意：以电子数据为原本)
纸件的扫描件(注意：以电子数据为原本)
由受理局填写
由国际局填写
Claims (13)
1.一种属于曲霉属(Aspergillus)的菌株，所述菌株具有900kb或900kb以上的基因组区域的重复。
2.权利要求1中所述的菌株，其中属于曲霉属的菌株是属于米曲霉(Aspergillus oryzae)或酱油曲霉(Aspergillus sojae)的菌株。
3.权利要求1或2中所述的菌株，其具有900到2,400kb的基因组区域的重复。
4.权利要求1到3任一项中所述的菌株，其在重复的基因组区域中包含碱性蛋白酶基因。
5.权利要求1到4任一项中所述的菌株，其在重复的基因组区域中包含α-淀粉酶基因。
6.权利要求1到5任一项中所述的菌株，其具有对应于米曲霉RIB40(NRBC100959)的第二染色体上SC003的A0090003001003-A0090003001259区域的基因组区域的重复。
7.权利要求1到6任一项中所述的菌株，其在麸曲的传代培养试验中，直到至少第10代未显示出回复突变。
8.权利要求1到7任一项中所述的菌株，其与亲代菌株相比蛋白酶活性增加两倍或两倍以上。
9.权利要求1到8任一项中所述的菌株，其与亲代菌株相比α-淀粉酶活性增加两倍或两倍以上。
10.权利要求1到9任一项中所述的菌株，其是NITE ABP-733(NITE BP-733)或NITE ABP-734(NITE BP-734)。
11.权利要求1到10任一项中所述的菌株，其通过诱变获得。
12.一种酱油曲，其通过使用权利要求1到11任一项中所述的菌株生产。
13.一种酱油，其通过使用权利要求12中所述的酱油曲生产。
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