JP5224494B2 - 突然変異糸状菌の作出方法 - Google Patents
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(1) 糸状菌の分生子に重イオンビームを照射し、当該照射処理をした分生子を培養して形成した糸状菌の中から変異の生じた糸状菌を選抜することを特徴とする、突然変異糸状菌の作出方法。
(2) 重イオンビームが、アルゴンイオンビームまたは炭素イオンビームである、(1)に記載の方法。
(3) 糸状菌が紅麹菌である、(1)に記載の方法。
(4) 選抜が、糸状菌による有用物質の生産性を指標に行う、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5) (1)〜(4)のいずれかに記載の方法により得られた突然変異糸状菌。
(6) 突然変異糸状菌モナスカス・ピローサス(Monascus pilosus)K-69株(FERM P-20784)。
(1)アルゴンイオンビームの照射
紅麹菌(モナスカス・ピローサス(Monascus pilosus)IFO 4520)の分生子を滅菌した0.7%生理食塩水中に回収し、プラスチックチューブに分注した。これにアルゴンイオンビーム(LET 281.5keV/μm;照射線量5,10,20,50,100(Gy))を照射した。
サブローデキストロース寒天培地で1週間培養したアカパンカビ(Neurospora crassa NBRC6067)を白金耳により菌糸ごとかきとり、これを0.85%生理食塩水に回収した。懸濁液をボルテックス後、脱脂綿をつめたロートにて菌糸をろ別し、分生子液を得た。寒天濃度の低いサブローデキストロース寒天培地をオートクレーブし、40℃程度まで度冷ましてから上記の分生子液を加えてシャーレにて固めた。一方、ペーパーディスク上に、(1)のアルゴンイオンビーム照射による生存コロニーを液体培養し、菌体をろ過して得られた培養ろ液を滴下、乾燥させた。このペーパーディスクを前記の固まった寒天培地上に置き、28℃で1晩培養した。この時に形成された阻止円の面積を画像解析ソフトにより算出し、野生株(WT)よりも面積の大きい株を変異株候補とした(これを1次選抜とする)。各々の変異株を継代し、1次選抜と同様の操作をおこなうことで(これを2次選抜とする)変異株を得た。図1に、アルゴンイオンビーム照射による菌の生存率と変異率(モナコリンK高生産)を示す。一般に、人為的な変異誘発では、0.1〜1%の生存率の範囲において変異株の出現頻度が大きいとされているのに対し(改訂新版 実験農芸化学 上巻 第268頁、朝倉書店)、本変異方法では、生存率がほぼ100%(ほとんど死滅していない)の範囲において変異率が高くなった。
グリセリン7%、グルコース3%、コーンスティープリカー3%、大豆タンパク0.8%、硫酸マグネシウム0.1%、硝酸ナトリウム0.2%(pH6.4)からなる培地をバッフル付き三角フラスコ(300mL容)に50mLずつ分注し、120℃で20分間滅菌した。この培地に、ポテトデキストロース寒天培地で斜面培養した(2)でスクリーングした紅麹菌変異株(K-69株)、または比較として野生株(WT)を接種し、25℃で14日間振とう培養した。培養液から菌体をろ別し、ろ液を以下に示すHPLC分析に供した。
(1)炭素イオンビームの照射
紅麹菌(モナスカス・ピローサス(Monascus pilosus)IFO 4520)の分生子を滅菌した0.7%生理食塩水中に回収し、プラスチックチューブに分注した。これに炭素イオンビーム(LET 22.5keV/μm、照射線量50,100,150,200,300(Gy))を照射した。
炭素(C)イオンビーム照射による生存コロニーを液体培養し、菌体をろ過して得られた培養ろ液の450nmにおける吸光度を測定し、野生株(WT)よりも吸光度の高い株を変異株候補とした。実施例1と同様に2次選抜までおこない、変異株を得た。図2に、炭素イオンビーム照射による菌の生存率と変異率(色素高生産)を示す。本処理では、生存率が20〜40%の範囲において変異率が高くなった。
Claims (5)
- 液中に懸濁した糸状菌の分生子に重イオンビームを照射し、当該照射処理をした分生子を培養して形成した糸状菌の中から変異の生じた糸状菌を選抜することを特徴とする、突然変異糸状菌の作出方法。
- 重イオンビームが、アルゴンイオンビームまたは炭素イオンビームである、請求項1に記載の方法。
- 糸状菌が紅麹菌である、請求項1に記載の方法。
- 選抜が、糸状菌による有用物質の生産性を指標に行う、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 突然変異糸状菌モナスカス・ピローサス(Monascus pilosus)K-69株(FERM P-20784)。
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