JP5224494B2

JP5224494B2 - 突然変異糸状菌の作出方法

Info

Publication number: JP5224494B2
Application number: JP2006052908A
Authority: JP
Inventors: 知子阿部; 豊宮沢; 暢尚福西; 啓充龍頭; 安重矢野; 知次郎小出
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2006-02-28
Filing date: 2006-02-28
Publication date: 2013-07-03
Anticipated expiration: 2026-02-28
Also published as: JP2007228849A

Description

本発明は、重イオンビームを照射することによって突然変異糸状菌を効率よく作出する方法に関する。

紅麹菌（モナスカス・アンカ、モナスカス・ピローサスなど）、黄麹菌（アスペルギルス・オリーゼ）、黒麹菌（アスペルギルス・アワモリ）などの麹菌は、醤油や味噌などの発酵食品製造、日本酒や焼酎などの酒類製造のほか、酵素、医薬品、化成品等の産業においても重要な位置を占める産業上有用な微生物である。特に、紅麹菌はコレステロール低下物質であるモナコリンＫ、血圧低下物質であるγ−アミノ酪酸（ギャバ）、モナスカス色素など、様々な二次代謝物質を生産することが知られており、最近にわかに注目されている機能性食品素材の一つである。このような産業上有用な微生物に、化学物質、紫外線、Ｘ線・γ線などの放射線を突然変異誘発源として用いて変異を誘発させることによって、生理活性物質や酵素の生産量の増大を図り、また、新たな需要に応える特性を付与することが行われている。

これまで紅麹菌に対する変異誘発例はいくつか知られており（特許文献１、非特許文献１〜２）、その変異手段は、主には薬剤処理、紫外線照射、薬剤処理と紫外線照射の併用である。変異株の選出の指標としている形質のほとんどが色素生産能異常（色素高生産またはアルビノ）で、シトリニン(毒素)低生産を指標としたものもある。また、その他の糸状菌の変異誘発に関する報告としては、アスペルギルス属菌に対する薬剤処理（非特許文献３）、アスペルギルス属菌に対するγ線照射（非特許文献４）、エノキタケに対するγ線照射（特許文献２）などがある。しかしながら、薬剤処理や紫外線照射などの従来の変異誘発方法は一般的に変異率が低く、先祖返りが容易に起こるという問題がある。

一方、近年、炭素などのイオン原子を加速器を用いて高速に加速した重イオンビーム（重粒子線）を照射する変異誘発方法が新たに開発され、すでに植物（特許文献３〜５）、動物（特許文献６）、酵母（非特許文献５）については重イオンビーム照射による変異体が作出されている。重イオンビーム照射はいずれも変異誘発率が高く、またγ線より強いエネルギーを持ち、染色体に大きな変化をもたらすため、γ線では得られない突然変異を誘発できる期待がある。また、糸状菌では、黒麹菌（非特許文献６）に対して重イオンビーム照射による変異株作出の報告があるが、変異が誘発されても生存率が０．１％程度と極めて低く、効率が非常に悪い。

特開２００４−０７３１９９号公報特開平０７−２７４７４９号公報特開平０９−２８２２０号公報特開平０９−２２００３５号公報特開２００２−１２５４９６号公報特開２００１−９５４２３号公報 J. Ferment. Technol. (1973) 51(10), 757-759 J. Agric. Food Chem. (2004) 52, 6977-6982 J. Ind. Microbiol. （1991）8:113-120 Agr. Biol. Chem. (1973) 37(4), 789-798 JAERI-Review (2004-025) 565-569 Food Sci. Technol. Res. (1999) 5(2), 153-155

従って、本発明の目的は、従来に比べてより効率的な突然変異糸状菌の作出方法を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討を行った結果、糸状菌の分生子に重イオンビームを照射することによって、生存菌数が多い範囲に極めて高い頻度で変異を糸状菌に誘発できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
(1) 糸状菌の分生子に重イオンビームを照射し、当該照射処理をした分生子を培養して形成した糸状菌の中から変異の生じた糸状菌を選抜することを特徴とする、突然変異糸状菌の作出方法。
(2) 重イオンビームが、アルゴンイオンビームまたは炭素イオンビームである、(1)に記載の方法。
(3) 糸状菌が紅麹菌である、(1)に記載の方法。
(4) 選抜が、糸状菌による有用物質の生産性を指標に行う、（1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5) (1）〜(4)のいずれかに記載の方法により得られた突然変異糸状菌。
(6) 突然変異糸状菌モナスカス・ピローサス(Monascus pilosus)K-69株(FERM P-20784)。

本発明の方法によれば、糸状菌に対して生存菌数が多い範囲に極めて高い頻度で変異を誘発することができ、しかも誘発される変異は遺伝的に安定である。従って、本発明の方法は、従来の方法に比べてより効率的に突然変異糸状菌を作出することを可能にする。また、本発明の方法により得られる、生理活性物質、抗生物質、酵素などの有用物質の生産性が向上した突然変異糸状菌は、医薬、食品、発酵などの各種産業分野において非常に有用である。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明の突然変異糸状菌の作出方法は、糸状菌の分生子に重イオンビームを照射し、当該照射処理をした分生子を培養して形成した糸状菌の中から変異の生じた糸状菌を選抜することを特徴とする。

本明細書において、糸状菌とは、鞭毛菌類、接合菌類、子嚢菌類、担子菌類、不完全菌のすべてを含み、特に、菌体が糸状を呈し、分生子と呼ばれる無性胞子を形成して増殖する、いわゆる「かび」をいう。本発明において使用する糸状菌としては、例えば、モナスカス(Monascus）属、アスペルギルス(Aspergillus)属、ペニシリウム（Penicillium）属、セファロスポリウム（Cephalosporium）属、アクレモニウム（Acremonium）属、フミコーラ（Humicola）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、ムコール（Mucor）属、リゾプス（Rhizopus)属、フザリウム（Fusarium）属、エメリセラ（Emericella）属に属する微生物が挙げられる。なかでも、医薬、食品、発酵、酵素工業で使用する産業上有用な麹菌が好ましく、例えば、モナスカス・ピローサス(Monascus pilosus）、モナスカス・パーパレウス(Monascus purpureus)、モナスカス・アンカ（Monascus anka）、アスペルギルス・オリーゼ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）などが挙げられる。

糸状菌の分生子（無性胞子）は、糸状菌が気中に菌糸を延ばし、その先端がくびれて形成される器官をいい、重イオンビーム照射により変異を高頻度で誘発するためには、生育直後の新鮮な状態の分生子を使用するのが好ましいが、これに限定されない。

重イオンビームの種類としては、糸状菌に変異を誘発できるものであれば特に限定はないが、例えば、アルゴン（Ar）イオンビーム、炭素（C）イオンビーム、窒素(N）イオンビーム、ネオン（Ne）イオンビーム、鉄（Fe）イオンビームなどを用いることができるが、好ましい重イオンビームとしては、アルゴン（Ar）イオンビーム、炭素（C）イオンビームが挙げられる。

重イオンビーム照射におけるLET （Linear Energy Transfer）は、20〜1000keV/μmの範囲が好ましい。重イオンビームの照射線量は、用いるイオンビームの種類、照射する糸状菌の種類などに応じて決めればよく、糸状菌に損傷を与えず、変異を誘発できる範囲内であれば特に限定されないが、生存菌数が多い範囲に高い頻度で変異を誘発する上で、Arイオンビームについては5〜30Gray、好ましくは10〜20Gray、Cイオンビームについては50〜200Gray、好ましくは100〜150Grayの範囲が例示できる。

次に、重イオンビームを照射した分生子を培養してコロニーを形成させ、その中から変異の生じている糸状菌を選抜する。培養は、常法に従えばよく、例えば、分生子を寒天培地などにまき、15〜35℃にて、2〜7日間インキュベートすることによって行う。

選抜する変異の生じている糸状菌はどのようなものでもよいが、産業上有用な物質（例えば、医薬の有効成分となりうる生理活性物質や抗生物質、機能性食品素材、物質生産に関わる酵素など）の生産性の高いものが好ましい。例えば、紅麹菌であれば、モナコリンＫ（コレステロール低下物質）、γ-アミノ酪酸(血圧効果物質）、紅麹色素（モナスカス色素）などの生産性が高いものが好ましい。選抜方法は特に限定されず、例えば、モナコリンＫ生産性を指標とする場合は、モナコリンＫには抗菌活性があるので（Journal of microbiological Methods 2000年 40巻 99-104ページ）、後記実施例に示すような阻止円アッセイによって行うことができる。また、紅麹色素生産であれば外観観察などによっても選抜することができる。

上記の方法により得られる糸状菌のうち、モナコリンＫ高生産の突然変異株であるモナスカス・ピローサス(Monascus pilosus)K-69株は、2006年2月3日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（IPOD）（茨城県つくば市東１−１−３）に受託番号FERM P-20784として寄託されている。

本菌株の寒天培地上の形態は、白色または淡赤色であり、顕微鏡下で2、3個が連結した分生子を有する。本菌株の生育の範囲は、ｐＨ４〜８、温度１５〜３５℃である。本菌株は、後記実施例に示すように、変異処理前の野生株（親株）に比較して、約２倍量のモナコリンＫを生産する。

本発明方法により得られた突然変異糸状菌は、通常の野生型の糸状菌と同様な方法により培養・増殖すればよい。培地としては、通常、糸状菌の培養に使用され、資化可能な炭素源、窒素源、無機塩類及び必要な栄養源を適当に含有する培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。また、培養条件も糸状菌の種類により適宜設定・変更すればよく、例えば紅麹菌の場合、培地のｐＨは４〜８、培養温度は１５℃〜３５℃、好ましくは２０℃〜３０℃、培養日数は２日〜１５日間、好ましくは、５日〜８日間の条件下で行うことが例示できる。

以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものでない。

(実施例１）アルゴンイオンビーム照射による紅麹菌変異株の作出
(1)アルゴンイオンビームの照射
紅麹菌（モナスカス・ピローサス（Monascus pilosus）IFO 4520）の分生子を滅菌した0.7％生理食塩水中に回収し、プラスチックチューブに分注した。これにアルゴンイオンビーム（LET 281.5keV/μm；照射線量5，10，20，50，100（Gy））を照射した。

照射後の分生子をポテトデキストロース寒天培地上にて培養し、形成されたコロニー数を計測した。一方、未照射の分生子を同様してポテトデキストロース寒天培地上にて培養し、このとき形成されたコロニー数を100％として、前記のコロニー数から生存率を算出した。

(2) モナコリンＫ生産性によるスクリーニング
サブローデキストロース寒天培地で１週間培養したアカパンカビ（Neurospora crassa NBRC6067）を白金耳により菌糸ごとかきとり、これを0.85％生理食塩水に回収した。懸濁液をボルテックス後、脱脂綿をつめたロートにて菌糸をろ別し、分生子液を得た。寒天濃度の低いサブローデキストロース寒天培地をオートクレーブし、40℃程度まで度冷ましてから上記の分生子液を加えてシャーレにて固めた。一方、ペーパーディスク上に、(1)のアルゴンイオンビーム照射による生存コロニーを液体培養し、菌体をろ過して得られた培養ろ液を滴下、乾燥させた。このペーパーディスクを前記の固まった寒天培地上に置き、28℃で１晩培養した。この時に形成された阻止円の面積を画像解析ソフトにより算出し、野生株（WT）よりも面積の大きい株を変異株候補とした（これを１次選抜とする）。各々の変異株を継代し、１次選抜と同様の操作をおこなうことで（これを２次選抜とする）変異株を得た。図１に、アルゴンイオンビーム照射による菌の生存率と変異率（モナコリンＫ高生産）を示す。一般に、人為的な変異誘発では、０．１〜１％の生存率の範囲において変異株の出現頻度が大きいとされているのに対し（改訂新版実験農芸化学上巻第268頁、朝倉書店）、本変異方法では、生存率がほぼ１００％（ほとんど死滅していない）の範囲において変異率が高くなった。

(3)紅麹菌変異株のモナコリンＫ生産性
グリセリン7%、グルコース3%、コーンスティープリカー3%、大豆タンパク0.8%、硫酸マグネシウム0.1%、硝酸ナトリウム0.2%（pH6.4)からなる培地をバッフル付き三角フラスコ（300mL容）に50mLずつ分注し、120℃で20分間滅菌した。この培地に、ポテトデキストロース寒天培地で斜面培養した(2)でスクリーングした紅麹菌変異株（K-69株)、または比較として野生株（WT）を接種し、25℃で14日間振とう培養した。培養液から菌体をろ別し、ろ液を以下に示すHPLC分析に供した。

ろ液1.0gを水／アセトニトリル＝50/50(v/v)の溶液で10倍希釈し、孔径0.45μmのフィルターでろ過したものを試料とした。移動相は0.1％(w/v)リン酸／アセトニトリル＝40/60(v/v)を用いた。カラムはシリカ C₁₈ (Wakosil-II 5C18AR 4.6×250mm)を用い、カラム温度は40℃付近で制御し、流速1.5mL/minで分析を行った。検出はPDA検出器にて行い、236nmでモニターした。

上記条件で酸型モナコリンＫの保持時間は４〜５分であった。モナコリンＫ標準品(商品名ロバスタチン；和光試薬工業製)のピーク面積から検量線を作成し、試料中の酸型モナコリンＫを定量した。その結果、モナコリンＫ生産量は、WTは88mg/Lであるのに対し、紅麹菌変異株(K-69株)は150mg/Lであり、生産の向上が顕著に認められた。なお、紅麹菌変異株(K-69株)は、2006年2月3日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（IPOD）（茨城県つくば市東１−１−３）に受託番号FERM P-20784として寄託されている。

(実施例２）炭素イオンビーム照射による紅麹菌変異株の作出
(1)炭素イオンビームの照射
紅麹菌（モナスカス・ピローサス（Monascus pilosus）IFO 4520）の分生子を滅菌した0.7％生理食塩水中に回収し、プラスチックチューブに分注した。これに炭素イオンビーム（LET 22.5keV/μm、照射線量50，100，150，200，300（Gy））を照射した。

(2) 色素生産性によるスクリーニング
炭素（C）イオンビーム照射による生存コロニーを液体培養し、菌体をろ過して得られた培養ろ液の450nmにおける吸光度を測定し、野生株（WT）よりも吸光度の高い株を変異株候補とした。実施例１と同様に２次選抜までおこない、変異株を得た。図２に、炭素イオンビーム照射による菌の生存率と変異率（色素高生産）を示す。本処理では、生存率が２０〜４０％の範囲において変異率が高くなった。

図１は、アルゴンイオンビーム照射による紅麹菌の生存率と変異率を示す。図２は、炭素イオンビーム照射による紅麹菌の生存率と変異率を示す。

Claims

液中に懸濁した糸状菌の分生子に重イオンビームを照射し、当該照射処理をした分生子を培養して形成した糸状菌の中から変異の生じた糸状菌を選抜することを特徴とする、突然変異糸状菌の作出方法。
重イオンビームが、アルゴンイオンビームまたは炭素イオンビームである、請求項１に記載の方法。
糸状菌が紅麹菌である、請求項１に記載の方法。
選抜が、糸状菌による有用物質の生産性を指標に行う、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
突然変異糸状菌モナスカス・ピローサス(Monascus pilosus)K-69株(FERM P-20784)。