TWI503412B - 保持大規模基因組重複之麴菌及其應用 - Google Patents

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Description

保持大規模基因組重複之麴菌及其應用
本發明係關於保持900kb以上之大規模基因組區域之重複的麴菌等。
麴菌所產生之酵素係被利用於各種產業上。
例如，即使是在日本傳統食品之醬油製造上，亦利用麴菌所產生之多種酵素。醬油製造中，係使麴菌在原料之黃豆與小麥上生長，而使其產生多種酵素。於此，麴菌所產生之多種酵素，係將大豆或小麥之蛋白質、糖質、脂質等分解，而促進次一步驟的乳酸醱酵、酵母醱酵。此過程中，若麴菌大量產生原料分解酵素，則原料利用率或壓榨性上升而可使生產性大幅提升。此外，由於對於乳酸醱酵、酵母醱酵的基質供給充足，適當地進行醱酵，而使醬油品質大幅提升。
由此等事實可知，育種出高酵素產生性之麴菌係對產業極為重要，而目前仍致力於以此為目標的育種。又，米麴菌(Aspergillus oryzae)RIB40之總基因組序列亦完成定序(非專利文獻1)，而已應用於育種上。
在以酵素高生產為目的之麴菌育種方法中，大致可分為突變法與基因重組法。
基因重組法係利用轉殖而目標基因組合至麴菌中而藉此進行育種的方法。依此方法所組合入之基因尺寸通常為5~6kb，若欲組合入10kb以上，則其轉殖效率顯著降低，故非常難以成功。又，由於必須在組合區域中放入目標基因之啟動子區域、構造基因區域、終端子區域、視情況之選殖時之成為標記的基因，故難以在10kb以內放入複數之目標基因。因此，在如酵素製造般之僅使單獨酵素進行高生產即可的產業中，基因重組手法即為有效，但在如食品製造般為了使原料分解而必須使複數種酵素同時高生產的產業中，則並不有效。若列舉醬油製造業作為食品製造業之例，適合釀造的麴菌必須高生產出用於提升產率的各種原料分解酵素、用於提升壓榨性之各種酵素、用於製造出甘味的酵素等各式各樣的酵素。在藉基因重組法使此等各式各樣酵素同時高生產時，必須重複進行轉殖。因此，必須建構出可將轉殖體選殖時所使用之標記回收的系統，但此極為困難。假設即使重複轉殖而將多種酵素基因插入至宿主基因組中，仍因基因座或表現控制系統之問題而所插入之基因無法充分作用。又，由於麴菌之酵素生產機制的未知部分仍很多，故僅僅插入基因並無法保證可提升目標之酵素生產性。
再者，利用了基因重組技術之食品製造，在日本市場尚未被接受，故在實際使用於食品製造上仍有問題。因此，雖進行以紫外線照射等之突變法的育種，但此方法將發生目的以外的隨附變異，故即使得到目的之酵素生產性變高的變異株，仍頻繁地發生其他之酵素生產性降低等問題。
另外，麴菌之變異株在遺傳上不穩定的情況較多，時常見到在生育的同時而回復為母株性質之株種(以下稱為「回復變異」)，於產業利用上造成問題。
如此，在如食品製造業般同時需要多種酵素的產業中，雖要求能同時高生產出多種酵素的麴菌，但仍有上述之問題。
尚且，迄今利用突變法之酵素高生產麴菌的育種，有如：對米麴菌RIB128進行N-甲基-N’-硝基-亞硝基胍(以下稱為NTG)處理以製作植酸酶高活性株，減低清酒中之植酸量並使生理活性物質之肌醇量增加的方法(專利文獻1)；對米麴菌AJ117281株進行NTG處理以製作蛋白分解酵素高活性變異株，而製造高氮蛋白水解物之方法(專利文獻2)；對米麴菌AJ117290株(FERM P-14259)進行NTG處理以製作麩胺酸酶高活性變異株，而製造麩胺酸含有率較高之蛋白水解物之方法(專利文獻3)等。關於突變之誘發，不僅止於以上述NTG作為變異劑，亦包括羥基胺、乙基甲基磺酸等一般所使用之其他化學物質，或紫外線、放射線、X射線等之照射。
另外，利用突變法之其他育種，已知有：對米麴菌O-1013株(FERM P-16528)進行NTG變異處理，得到高生產出去鐵鐵金黃酮(Deferriferrichrysin)之變異株的方法(專利文獻4)；對醬油麴菌(Aspergillus sojae)進行紫外線處理以製作分生子為白色的白色麴變異株，而得到色相良好之味噌的方法(專利文獻5)；對米麴菌實施X射線等之突變處理，以製作異戊醛低生產麴菌，而防止清酒劣化臭之悶味發生的方法(專利文獻6)；對紅麴菌(Monascus菌)照射重離子束而製作高生產出膽固醇降低物質之莫那可林(monacolin K)之麴菌株的方法(專利文獻7)；對微生物照射具有射線能量賦予之鐵離子束，藉此導入1.0~1.2kb左右之插入變異及缺失變異的方法(專利文獻8)；以及，利用重離子束作出黑麴菌變異株之例子(非專利文獻2)等。
[專利文獻1]日本專利特開平06-153896號公報
[專利文獻2]日本專利特開平07-274944號公報
[專利文獻3]日本專利特開平10-210967號公報
[專利文獻4]日本專利特開2008-054580號公報
[專利文獻5]日本專利特開平07-222584號公報
[專利文獻6]日本專利特開平09-70287號公報
[專利文獻7]日本專利特開2007-228849號公報
[專利文獻8]日本專利特開2008-306991號公報
[非專利文獻1]Nature(2005) 438,1157-61
[非專利文獻2]Food Sci. Technol. Res.(1999) 5(2),153-155
本發明係以不使用基因重組法，而育種出同時提升多種酵素生產能力之麴菌為課題。
為了解決上述課題，本發明者係對屬於麴菌(Aspergillus)屬之菌株(例如醬油麴菌及米麴菌)實施突變處理，並選殖出使目標基因與目標基因附近之基因同時變成高活性的變異株，而成功得到具有900kb以上之大規模基因組區域重複的麴菌，遂完成本發明。
亦即，本發明係關於以下[1]~[13]。
[1]一種菌株，係屬於麴菌屬之菌株，並保持900kb以上之基因組區域之重複。
[2]如[1]之菌株，其中，屬於麴菌屬之菌株為屬於米麴菌或醬油麴菌之菌株。
[3]如[1]或[2]之菌株，其中，保持900~2,400kb之基因組區域之重複。
[4]如[1]至[3]中任一項之菌株，其中，重複之基因組區域中包含鹼性蛋白酶(alkaline protease)基因。
[5]如[1]至[4]中任一項之菌株，其中，重複之基因組區域中包含α-澱粉酶基因。
[6]如[2]至[5]中任一項之菌株，其中，保持著包括下述基因組區域之重複的基因組：米麴菌RIB40(NBRC100959)中，第2染色體上之SC003之相當於A0090003001003~A0090003001259區域之基因組區域之重複。
[7]如[1]至[6]中任一項之菌株，其中，其係在麩麴之繼代培養試驗中，於至少第10代為止未發生回復變異的株。
[8]如[1]至[7]中任一項之菌株，其中，相較於母株，其蛋白酶活性增加2倍以上。
[9]如[1]至[8]中任一項之菌株，其中，相較於母株，其α-澱粉酶之活性增加2倍以上。
[10]如[1]至[9]中任一項之菌株，其中，菌株為NITE ABP-733(NITE BP-733)或NITE ABP-734(NITE BP-734)。
[11]如[1]至[10]中任一項之菌株，其中，係實施突變處理而獲得。
[12]一種醬油麴，係使用[1]~[11]中任一項之菌株而製造。
[13]一種醬油，係使用[12]之醬油麴所製造。
根據本發明，成功地得到同時高生產出多種酵素的麴菌。此麴菌除了由於同時高生產出多種酵素而對產業極為有用，且因為不使用基因重組法而容易利用於食品製造上。尤其是在醬油製造中，藉由使所需之蛋白酶等各種原料分解酵素變成高生產性，而可使原料利用率飛躍性地提升。
另外，已知麴菌之變異株時常發生回復變異，但具有基因組之大規模重複的本發明麴菌株，由於並非點變異般之小變異，故遺傳性穩定而不易發生回復變異。因此，相較於習知，可格外地提升產率。尤其是不發生回復變異的效果，不僅提升了醬油製造時之原料利用率，亦大幅減輕種麴管理勞力， 故非常有助於生產性提升，而在產業利用上相當有利。
本發明所使用之麴菌，可舉例如醬油麴菌、米麴菌、黑麴菌(Aspergillus niger)、泡盛麴菌(Aspergillus awamori)等之任意菌株，其中較佳為屬於醬油麴菌及米麴菌的菌株。
作為此種菌株，可舉例如：醬油麴菌262(FERM P-2188)、醬油麴菌2165(FERM P-7280)、醬油麴菌(ATCC42251)、米麴菌(IAM2638)及米麴菌RIB40(NBRC100959)等之公家寄存機關所保存、從業者可輕易取得的各種菌株等。
本發明之菌株的特徵在於，重複了至少900kb以上、較佳900~2,400kb之大規模基因組區域並保持至少2個複製以上。此種重複之基因組區域係排列於相同染色體上，或分離存在於不同染色體上。
在醬油製造時，較佳係使分解蛋白質、製造屬於甘味成分之胺基酸的蛋白酶，與製造成為乳酸醱酵‧酵母醱酵基質之葡萄糖的澱粉酶同時高生產出的麴菌。又，由米麴菌RIB40之基因組資訊可得知，此等之基因存在於同一染色體之不挾持中節的位置。為了得到此等酵素活性同時較高、且重複大規模基因組區域的麴菌，首先選出蛋白酶生產能成為2倍以上之變異株，再由其中選擇澱粉酶活性成為2倍以上之變異株，藉此可效率佳地得到性質穩定的目標株。於此，雖以蛋白酶與澱粉酶為例，但只要是該基因組合為其基因彼此在同一染色體上且存在於不挾持中節之位置上的基因組合，則亦可為任意組合。
從而，此種重複之大規模基因組區域的代表例，可舉例如包括鹼性蛋白酶基因及/或α-澱粉酶基因，來自(相當於)獨立行政法人製品評價技術基盤機構(NITE)Biological Resource Center(或獨立行政法人酒類總合研究所)所保存之米麴菌RIB40(NBRC100959)之第2染色體上之SC003區域者。又，所謂「SC003區域」，係指獨立行政法人製品評價技術基盤機構(NITE)之基因組解析資料庫的DOGAN(Database Of the Genomes Analyzed at NITE)(http：//www.bio.nite.go.jp/dogan/Top)之檢索所定序(http：//www.bio.nite.go.jp/dogan/GeneMap？GENOME_ID=ao_G2)。又，SC003區域係記載於DNA Res. 2008 Aug；15(4)：173-83之圖2。
或者，作為重複之大規模基因組區域的代表例，可舉例如：以下實施例所示之第2染色體上之各區域，亦即含包鹼性蛋白酶基因與α-澱粉酶基因之來自醬油麴菌的約900kb之區域(相當於米麴菌RIB40中之A0090003000925~A0090003001259之區域)的區域，約1,500kb之區域(相當於米麴菌RIB40中之A0090003001003~A0090003001556之區域)，以及2,400kb之區域(相當於米麴菌RIB40中之A0090003000654~A0090003001556之區域)，再者為來自米麴菌RIB40之2,100kb之區域(A0090003000759~A0090003001558)(圖9)。
此等區域中，特佳係將相當於米麴菌RIB40(NBRC100959)之第2染色體上之SC003之A0090003001003~A0090003001259區域的區域，作為本案所使用之重複區域。相當之區域並不僅限定於來自米麴菌RIB40之區域，尚包括來自本發明可使用之菌株的區域。
再者，作為本發明之菌株，雖不限制在繼代培養中有無發生回復變異，但較佳為不發生回復變異之菌株。於此所謂回復變異，係指基因組大規模重複之脫落。是否發生回復變異的判定係如以下般進行。判定基準係將以麩麴培養4天之菌株之重複所含的各酵素基因的活性(於此為蛋白酶活性或澱粉酶等)或表現量與母株相比較，若維持2倍以上之增加則屬於未發生回復變異。在相較於母株之下為同等或其以下時，則為發生了回復變異。又，是否發生回復變異之菌株的判定係如以下般進行。在以麩麴進行之定法的繼代培養試驗中，在至少第10代為止未發生回復變異者視為「不回復變異的菌株」，在至少第10代前發生了回復變異者視為「回復變異的菌株」。
本發明之菌株可藉由NTG處理、重離子束、紫外線及X射線等習知公知的任意之突變處理方法予以製造。
例如，在照射紫外線時，係將上述菌株之分生子依106 左右塗佈於酪蛋白培養基(牛奶酪蛋白0.4%、酪蛋白胺基酸0.05%、磷酸一鉀0.36%、磷酸二鈉1.43%、硫酸鎂0.5%、硫酸鐵0.002%、洋菜2%、pH6.5)(%表示w/w%)上，於無塵菌工作檯內以同一培養盤照射適當量之紫外線5~10分鐘。
作為選擇發生變異之菌之情況的例子，可舉例如選擇蛋白酶生產能較高之變異株的方法。此方法係依下述方法進行：於酪蛋白培養基上，接種經照射之麴菌株，以麴菌之生長適溫培養適當時間，培養後，選擇在菌落周圍所出現之透明環(clear zone)較大的株，針對其株調查釀造特性，而選殖出蛋白酶生產能高的變異株。
紫外線照射後之菌的選擇，係例如以下般進行。於同一培養盤依30℃進行培養3~5天而使分生子著生，於此時點選擇性地回收透明環較大之株，以單菌落分離進行純化。其餘株則回收所有分生子，以滅菌水予以適當稀釋後，塗佈於酪蛋白培養盤上。以30℃培養3~5日後，選擇性回收透明環較大之株，以單菌落分離進行純化。
作為本發明中屬於麴菌屬之菌株的一例子，係將實施例1記載之S1-1株及實施例2記載之R40-1株，於2009年4月6日寄存於獨立行政法人製品評價技術基盤機構專利微生物寄存中心(〒292-0818千葉縣木更津市Kazusa鎌足2-5-8)，分別取得受託編號：NITE P-733及受託編號：NITE P-734。又，根據布達佩斯條約，向同一中心申請國際寄存之移管手續，針對S1-1株及R40-1株，分別依NITE ABP-733及NITE ABP-734受理了移管請求。
以下，根據實施例更詳細說明本發明，但本發明之技術性範圍並不限定於此等實施例。
(麩麴之製作法)
依定法進行麴菌之酵素活性評價法。亦即，將灑水80%之小麥麩5g置入於150ml容量之三角燒瓶中，以121℃、50分鐘滅菌後，將麴菌接種2鉑圈並以30℃培養4日。培養後，置入滅菌水100ml並加上橡膠栓予以充分振盪，再靜置於室溫下4小時，以No.2濾紙(ADVANTEC公司製)予以過濾並將所得萃取液作為酵素樣本。
(蛋白酶活性之測定法)
將所得之酵素樣本適當稀釋，依「醬油試驗法」(財團法人日本醬油研究所昭和60年、287頁)記載之以下方法進行測定。
將特級L-酪胺酸100mg溶解於蒸餾水中作成1L。將其之1、2、3、4、5ml分別採集於10ml容量量瓶中，加入蒸餾水作成10ml，調製成酪胺酸10、20、30、40、50μg/ml的標準溶液。分別於試管中採集此等之酪胺酸標準溶液2ml，加入0.55M碳酸鈉溶液5ml，接著加入稀釋3倍的Folin試藥1ml，於30℃恆溫水槽中保持30分鐘後，以分光光度計測定660nm的吸光度。對照槽係使用蒸餾水而進行相同操作者。以橫軸為酪胺酸量(μg)、縱軸為660nm之吸光度而作成標準曲線。
將上述酵素樣本適當稀釋，加入1.5%牛奶酪蛋白溶液1ml予以混合。以30℃進行反應10分鐘後，加入0.4M三氯乙酸溶液3ml，使反應停止。於30℃恆溫水槽中放置30分鐘，將生成之沉澱以No.2濾紙(ADVANTEC公司製)過濾。於試管中取濾液2ml，測定660nm之吸光度。空白組係在酵素添加前加入0.4M三氯乙酸溶液3ml，並進行同樣操作者。將由試料吸光度減去空白組吸光度的值作為⊿E。藉由標準曲線與⊿E，求取酪胺酸量。將於1分鐘內使相當於酪胺酸1μg之非蛋白性物質遊離的酵素量設為1U(單位)，依麩麴每1g予以算出。
(α-澱粉酶活性之測定法)
將所得之酵素樣本適當稀釋，使用α-澱粉酶測定套組(KIKKOMAN釀造分析套組，編碼60213)，依套組之規定進行測定。α-澱粉酶活性係以麩麴每1g於1分鐘內使1μ莫耳之2-氯-4-硝基酚遊離之力價作為1U(單位)而表示。
(CMCase活性之測定法)
以羧基甲基纖維素(CMC作為基質)，依二硝基水楊酸(DNS)法進行檢測。將基質1.0g溶解於60ml蒸餾水中，以0.4M乙酸調整為pH4.8後，加入0.4M乙酸緩衝液(pH4.8)25ml並以蒸餾水作成100ml，將此作為1%基質溶液。加入此1%基質溶液與等量之酵素樣本，於40℃反應1小時。以100℃、10分鐘使反應停止後，取反應液0.75ml至試管中，加入DNS試劑0.75ml並均勻混合，以玻璃珠加栓並煮沸7分鐘。冷卻後，加入蒸餾水3ml，測定535nm之吸光度，以1分鐘內使相當於葡萄糖1mg之還原等進行遊離的酵素量作為1U(單位)而表示。
[實施例1]
對屬於醬油麴菌之菌株的S1株(龜甲萬股份有限公司所有)之分生子依上述方法實施紫外線照射之突變處理或紫外線照射以外之上述公知突變處理後，將該分生子塗佈於酪蛋白培養基上，依透明環尺寸進行選殖。將透明環之尺寸較母株大1.5倍以上的株，以麩麴依30℃培養4日，分別命名為S1-1、S1-2、S1-3。S1-1係藉由紫外線照射之突變處理而得之株，S1-2及S1-3係藉由紫外線照射以外之公知突變處理而得之株。針對各株依上述測定法測定蛋白酶活性。測定之結果，係S1-1、S1-2、S1-3均較母株顯示出2倍以上的蛋白酶活性與α-澱粉酶活性。
將各變異株之於麩麴中之蛋白酶活性測定結果示於圖1。
將各變異株之於麩麴中之α-澱粉酶活性測定結果示於圖2。
[實施例2]
對屬於米麴菌RIB40(NBRC100959)之分生子依相同方法實施紫外線照射之突變處理後，與實施例1相同地塗佈於酪蛋白培養基上，依透明環尺寸進行選殖。將透明環之尺寸較母株大1.5倍以上的株，以麴麴依30℃培養4日，分別命名為R40-1株。依上述測定法測定蛋白酶活性。測定之結果，係R40-1株較母株顯示出2倍以上的蛋白酶活性與α-澱粉酶活性。
將所得變異株之麩麴中之蛋白酶活性測定結果示於圖3。
將所得變異株之麩麴中之α-澱粉酶活性測定結果示於圖4。
[實施例3]
再者，針對所得變異株之S1-1、S1-2、S1-3進行麩麴之繼代試驗，並依上述測定法測定蛋白酶活性(圖5)。由圖5明顯可知，所得變異株均在第10代為止較母株顯示出較高的蛋白酶活性(達2倍以上)，可知其為未發生回復變異之株。
[實施例4] (醬油麴之製造)
再者，針對此等菌株，將經蒸煮之脫脂黃豆與炒熬割碎小麥依50：50之比例混合，於其中加入種麴0.1%(w/w)，以3日麴進行製麴，依上述測定法測定所得之醬油麴的蛋白酶活性(圖6)。由圖6明顯可知，S1-1、S1-2、S1-3之任一株均較母株顯示出2倍以上的蛋白酶活性。
[實施例5]
依「醬油試驗法」(財團法人日本醬油研究所昭和60年、104頁)記載之以下方法測定上述醬油麴之麴消化度。
醬油麴之麴消化度係如以下般測定。於500ml三角燒瓶中取醬油麴100g，加入18.5%食鹽水200ml，加上橡膠栓並於37℃進行自我消化1周。此期間每日攪拌一次。將此消化醱酵液以混合器均勻混合，測定醱酵液之總氮份及食鹽份。另一方面，將混合之醱酵液過濾，對濾液亦測定總氮份及食鹽份。將此等測定值使用以下算式求得消化度(圖7)。由圖7可知，S1-1、S1-2、S1-3之任一株均較母株S1株顯示出較高的麴消化度。麴消化度的提升係與醬油製造時之原料利用率提升有直接關連。
麴消化度(%)={(醱酵液食鹽%)/(醱酵液總氮%)}×{(液汁氮%)/(液汁食鹽%)}×100
[實施例6] (使用微陣列之比較基因組雜合法(aCGH法)的解析)
使用微陣列(Agilent Technologies公司)，藉aCGH法網羅性地解析S1-1株之基因複製數變化，結果，含有鹼性蛋白酶基因與α-澱粉酶基因之約900kb之區域(相當於米麴菌RIB40中之A0090003000925~A0090003001259之區域)中所存在的基因，係相較於母株，增加了2倍以上。由此可知，S1-1株具有大規模的基因組重複。同樣地，其他之蛋白酶高生產株亦進行了aCGH解析，結果可知，S1-2具有約1,500kb之區域(相當於米麴菌RIB40中之A0090003001003~A0090003001556之區域)、S1-3具有約2,400kb之區域(相當於米麴菌RIB40中之A0090003000654~A0090003001556之區域)的含有蛋白酶基因與α-澱粉酶基因的大規模基因組重複(圖8)。
針對實施例2所得之R40-1株，與上述同樣地進行aCGH解析，結果可知，此株亦與S1-1株同樣地具有含鹼性蛋白酶基因與α-澱粉酶基因之2,100kb之區域(A0090003000759~A0090003001558之區域)的大規模基因組重複(圖9)。
[實施例7] (定量PCR法之鹼性蛋白酶基因複製數變異解析)
藉定量PCR法對S1-1株之重複區域中之各種基因複製數進行定量，與母株之S1株比較(Mx3000P，Stratagene公司)(圖10)。PCR條件設為40個循環的95℃-10秒、60℃-20秒、72℃-15秒。控制組基因係使用存在於第1染色體之br1A 基因、存在於第3染色體之f1bA 基因、存在於第4染色體之pceB 基因。由圖10明顯可知，S1-1株具有S1株之2倍的屬於第2染色體中之以aCGH法確認了重複之約900kb之區域中之基因的鹼性蛋白酶基因(alp )、澱粉酶基因(amy )、pceA 基因，此可證明aCGH法之解析結果為正確。所使用之引子鹼基序列br1A-F (序列編號1)、br1A-R (序列編號2)、alp-F (序列編號3)、alp-R (序列編號4)、amy-F (序列編號5)、amy-R (序列編號6)、pceA-F (序列編號7)、pceA-R (序列編號8)、f1bA-F (序列編號9)、f1bA-R (序列編號10)、pceB-F (序列編號11)及pceB-R (序列編號12)係記錄於下(表1)。此等引子序列不僅止於醬油麴菌，亦使用於本案中可使用之菌株中的重複區域之各種基因複製。
[實施例8]
針對S1-1株製作麩麴，如上述測定各種酵素活性。其結果，由基因組重複區域所含之基因所轉譯出的酵素(蛋白酶與α-澱粉酶)之活性，係相較於母株，有意義地增加了2倍以上；相對於此，該區域所不含之酵素的羧基甲基纖維素酶(CMCase)之活性並無有意義之變化(圖11)。由此可知，蛋白酶與α-澱粉酶之活性上升係依存於重複。
以上雖詳細地並參照特定實施態樣說明本發明，但在不脫離本發明之精神與範圍之下，從業者當知可進行各種變更或修正。
本申請案係根據2009年4月17日申請之日本專利申請(特願2009-100645)，取其內容作為參照。又，此處所引用之所有參照內容係加入作為整體。
(產業上之可利用性)
藉由將本發明之屬於麴菌屬之菌株接種培養至醬油麴原料，則可得到提升多種酵素生產能力之固體麴或液體麴，而使用此麴進行填裝以製造醬油。又，藉由將本發明菌株接種培養於米原料上，則可製造味醂、味醂類、酒。又，藉由將本發明菌株進行液體培養，亦可製造使麵筋分解之調味液。因此，本發明係與此種各製造方法及藉其所製造之醬油等之各種食品相關。
序列編號1：對br1A 基因之引子序列。
序列編號2：對br1A 基因之引子序列。
序列編號3：對alp 基因之引子序列。
序列編號4：對alp 基因之引子序列。
序列編號5：對amy 基因之引子序列。
序列編號6：對amy 基因之引子序列。
序列編號7：對pceA 基因之引子序列。
序列編號8：對pceA 基因之引子序列。
序列編號9：對f1bA 基因之引子序列。
序列編號10：對f1bA 基因之引子序列。
序列編號11：對pceB 基因之引子序列。
序列編號12：對pceB 基因之引子序列。
<110> Kikkeman Corporation
<120> Aspergillus having large scale genomio duplication
<130> K423-695
<150> JP2009-100645
<151> 2009-04-17
<160> 12
<170> PatentIn version 3.1
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圖1表示本發明菌S1-1、S1-2、S1-3株之麩麴之蛋白酶活性測定結果。
圖2表示本發明菌S1-1、S1-2、S1-3株之麩麴之α-澱粉酶活性測定結果。
圖3表示本發明菌R40-1株之麩麴之蛋白酶活性測定結果。
圖4表示本發明菌R40-1株之麩麴之α-澱粉酶活性測定結果。
圖5表示本發明菌S1-1、S1-2、S1-3株之麩麴之繼代試驗中蛋白酶活性測定結果。
圖6表示本發明菌S1-1、S1-2、S1-3株之醬油麴中之蛋白酶活性測定結果。
圖7表示本發明菌S1-1、S1-2、S1-3株之醬油麴中之麴消化度測定結果。
圖8表示使用了本發明菌S1-1、S1-2、S1-3株之微陣列的比較基因組雜合法(以下稱為aCGH法)的解析結果。
圖9表示本發明菌R40-1株之aCGH法的解析結果。
圖10表示本發明菌S1-1株之定量PCR法的基因複製數變異解析結果。
圖11表示本發明菌S1-1株在麩麴中相當於重複區域之酵素與不相當之酵素的活性測定結果。

Claims (9)

  1. 一種菌株，係屬於米麴菌(Aspergillus oryzae)或醬油麴菌(Aspergillus sojae)之菌株，上述菌株為BCRC930135或BCRC930136，並保持著包括下述基因組區域之重複的基因組：米麴菌RIB40(NBRC100959)中，第2染色體上之SC003之相當於A0090003001003~A0090003001259區域之基因組區域之重複。
  2. 如申請專利範圍第1項之菌株，其中，保持900~2,400kb之基因組區域之重複。
  3. 如申請專利範圍第1項之菌株，其中，重複之基因組區域中包含鹼性蛋白酶(alkaline protease)基因。
  4. 如申請專利範圍第1項之菌株，其中，重複之基因組區域中包含α-澱粉酶基因。
  5. 如申請專利範圍第1項之菌株，其中，其係在麩麴之繼代培養試驗中，於至少第10代為止未發生回復變異的株。
  6. 如申請專利範圍第1項之菌株，其中，相較於母株，其蛋白酶活性增加2倍以上。
  7. 如申請專利範圍第1項之菌株，其中，相較於母株，其α-澱粉酶之活性增加2倍以上。
  8. 如申請專利範圍第1項之菌株，其中，係實施突變處理而獲得。
  9. 一種醬油麴，係使用申請專利範圍第1項之菌株而製造。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011158623A1 (ja) 2010-06-17 2011-12-22 キッコーマン株式会社 麹菌染色体における大領域重複の作製方法
JP2013034416A (ja) * 2011-08-05 2013-02-21 Kikkoman Corp 重複ゲノム領域を有する菌
JP6081245B2 (ja) 2012-04-07 2017-02-15 キッコーマン株式会社 麹菌染色体における任意領域の重複転座の作製方法
CN103333806B (zh) * 2013-06-25 2015-06-03 浙江正味食品有限公司 一种蛋白酶高产米曲霉及其产生的蛋白酶和应用
JP6612548B2 (ja) 2015-07-29 2019-11-27 花王株式会社 糸状菌変異株及びその利用
CN105754876B (zh) * 2016-04-10 2020-03-17 蒋川湘 一种青稞米曲、青稞米曲产品及其制备方法
CN113308383B (zh) * 2021-06-29 2022-10-25 佛山市海天(高明)调味食品有限公司 一株米曲霉za223及其应用
CN113444652B (zh) * 2021-08-04 2022-08-16 佛山市海天(高明)调味食品有限公司 米曲霉菌株za185及其应用
WO2023039012A1 (en) * 2021-09-07 2023-03-16 The Regents Of The University Of California Expression of heme biosynthesis and heme proteins in edible filamentous fungi

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6830905B2 (en) * 1998-05-15 2004-12-14 Ajinomoto Co., Inc. Glutaminase, its gene and a method of producing it

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57174087A (en) * 1981-04-21 1982-10-26 Higeta Shoyu Kk Breeding method of koji mold
JPS60188057A (ja) 1984-03-09 1985-09-25 Kikkoman Corp 高いプロテアーゼ生産能及び高いグルタミナーゼ生産能を有する麹菌の育種法
JPH06153896A (ja) 1992-08-27 1994-06-03 Nishinomiya Shuzo Kk 清酒の製造方法
JP3101140B2 (ja) 1994-02-08 2000-10-23 長野県味噌工業協同組合連合会 味噌麹用菌株及び味噌用麹並びに味噌
JPH07274944A (ja) 1994-04-14 1995-10-24 Ajinomoto Co Inc 新規変異株及び蛋白加水分解物の製造法
JPH0970287A (ja) 1995-09-05 1997-03-18 Hakutsuru Shuzo Kk 麹菌株
JPH10210967A (ja) 1996-11-29 1998-08-11 Ajinomoto Co Inc 高活性変異株及びそれを用いる蛋白加水分解物の製造法
DE69729085T2 (de) * 1997-07-05 2005-04-21 Nestle Sa Gesteigerte Expression proteolytischer Enzyme in ...
EP1132461A1 (en) * 2000-03-09 2001-09-12 Kikkoman Corporation A multiply transformed Aspergillus (koji) mold and a method of manufacturing a flavor enhancer using the same
JP5224494B2 (ja) 2006-02-28 2013-07-03 独立行政法人理化学研究所 突然変異糸状菌の作出方法
CN100455653C (zh) * 2006-06-06 2009-01-28 李怀宝 一株米曲霉菌及其应用
JP4901372B2 (ja) 2006-08-31 2012-03-21 月桂冠株式会社 デフェリフェリクリシン高生産変異株、シデロフォア生産用の液体培地、シデロフォアの製造方法
JP5257875B2 (ja) 2007-06-15 2013-08-07 独立行政法人理化学研究所 微生物に対する突然変異誘発方法
JP5326411B2 (ja) 2007-09-25 2013-10-30 Ｔｄｋ株式会社 スイッチング電源
JP2009095279A (ja) 2007-10-17 2009-05-07 Kikkoman Corp 麹菌、その育種法及び醤油の製造法
JP5582628B2 (ja) 2008-09-29 2014-09-03 ヤマサ醤油株式会社 ｃｒｅＣをコードする遺伝子の機能が欠損した調味料の製造に利用可能な麹菌及びその利用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6830905B2 (en) * 1998-05-15 2004-12-14 Ajinomoto Co., Inc. Glutaminase, its gene and a method of producing it

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Carrie A. Smith et al., "Silencing of the Aflatoxin Gene Cluster in a Diploid Strain of Aspergillus flavus Is Suppressed by Ectopic aflR Expression", Genetics 176: 2077–2086 (August 2007). *
Masayuki Machida1 et al., "Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae", Vol 438|22/29 December 2005,p1157-1161. *

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Publication number Publication date
JP2010246481A (ja) 2010-11-04
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