JP6081245B2 - 麹菌染色体における任意領域の重複転座の作製方法 - Google Patents
麹菌染色体における任意領域の重複転座の作製方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6081245B2 JP6081245B2 JP2013052795A JP2013052795A JP6081245B2 JP 6081245 B2 JP6081245 B2 JP 6081245B2 JP 2013052795 A JP2013052795 A JP 2013052795A JP 2013052795 A JP2013052795 A JP 2013052795A JP 6081245 B2 JP6081245 B2 JP 6081245B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- region
- chromosome
- strain
- translocation
- transformant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 title claims description 179
- 230000005945 translocation Effects 0.000 title claims description 127
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 47
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 title description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 128
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 68
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 63
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 57
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 34
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 32
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 32
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 31
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 claims description 27
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 claims description 23
- 101150054232 pyrG gene Proteins 0.000 claims description 19
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 claims description 18
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 15
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 claims description 10
- 241000131386 Aspergillus sojae Species 0.000 claims description 8
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 8
- 230000008263 repair mechanism Effects 0.000 claims description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 3
- 101150095344 niaD gene Proteins 0.000 claims description 3
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000036086 Chromosome Duplication Diseases 0.000 description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 32
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 18
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 18
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 18
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 12
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 12
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 12
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 11
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 11
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 11
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 11
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 8
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 8
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 8
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 8
- 101150115781 prtT gene Proteins 0.000 description 8
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 235000013555 soy sauce Nutrition 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 7
- 240000001009 Aspergillus oryzae RIB40 Species 0.000 description 6
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 6
- 101100438857 Bacillus subtilis (strain 168) ccpA gene Proteins 0.000 description 5
- 101100355599 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) mus-11 gene Proteins 0.000 description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 4
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 4
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 3
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 3
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 3
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 3
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 241001513093 Aspergillus awamori Species 0.000 description 2
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 2
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 102100036973 X-ray repair cross-complementing protein 5 Human genes 0.000 description 2
- 101710124921 X-ray repair cross-complementing protein 5 Proteins 0.000 description 2
- 102100036976 X-ray repair cross-complementing protein 6 Human genes 0.000 description 2
- 101710124907 X-ray repair cross-complementing protein 6 Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 235000019992 sake Nutrition 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 description 2
- BOFRXDMCQRTGII-UHFFFAOYSA-N 619-08-9 Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1Cl BOFRXDMCQRTGII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 101000942941 Arabidopsis thaliana DNA ligase 6 Proteins 0.000 description 1
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 description 1
- 235000013023 Aspergillus oryzae RIB40 Nutrition 0.000 description 1
- 102100033195 DNA ligase 4 Human genes 0.000 description 1
- 230000008265 DNA repair mechanism Effects 0.000 description 1
- 102100027828 DNA repair protein XRCC4 Human genes 0.000 description 1
- 101100191383 Dictyostelium discoideum dnapkcs gene Proteins 0.000 description 1
- 101100108660 Escherichia coli (strain K12) alpA gene Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 208000034951 Genetic Translocation Diseases 0.000 description 1
- 101000927810 Homo sapiens DNA ligase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000649315 Homo sapiens DNA repair protein XRCC4 Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 244000294411 Mirabilis expansa Species 0.000 description 1
- 235000015429 Mirabilis expansa Nutrition 0.000 description 1
- 101100003994 Mus musculus Atrnl1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 101100324525 Rattus norvegicus Asrgl1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100409457 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) CDC40 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100156959 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) XRS2 gene Proteins 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 101150024193 alp1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000020054 awamori Nutrition 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 210000001726 chromosome structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000005251 gamma ray Effects 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 238000010884 ion-beam technique Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000013536 miso Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 101150071637 mre11 gene Proteins 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 101150010682 rad50 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000014233 sulfur utilization Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 235000021404 traditional food Nutrition 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
- A23L27/50—Soya sauce
Description
本発明は、アスペルギルス属に属する菌の染色体において、或る染色体における任意の大領域を、別の染色体の任意の位置に重複転座させる技術に関する。
アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae ）及びアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）等の麹菌は、醤油、酒、味噌などの伝統的な食品の醸造や酵素の生産等のために工業的に広く用いられている、また近年の麹菌（アスペルギルス・オリゼ）の全ゲノム配列の決定やマイクロアレイを用いた網羅的な遺伝子発現解析などの進展に伴い、遺伝子工学的な改変、特に染色体レベルの改変により酵素等の生産性や増殖速度の改良などの効果が期待される糸状菌である。
アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、ニガー（niger）、フミガタス（fumigatus）、アワモリ（awamori）などのアスペルギルス属菌が単核の世代を持つのに対し、アスペルギルス・ソーヤ及びアスペルギルス・オリゼ等の麹菌は分生子の状態も含めてその生活環において常に多核の状態を保ち、これまでのところ有性世代が確認されておらず、親細胞から娘細胞への核の分配機構についても解明されていない。そのために、菌株間の交配やＲＩＰ（repeat induced mutation）等の手段によって新たな変異株を作成することが出来ず、遺伝学的研究が困難であり、上記のように産業的に極めて有用な菌であるにもかかわらず、遺伝的解析は遅れていた。
これらのことから、多種の酵素の生産性が高い等の有用な麹菌を育種することは産業上極めて重要であり、これを目的とした育種が現在までに精力的に行なわれている。このような麹菌の育種方法には、大きく分けて突然変異法と遺伝子組換え法がある。
突然変異法にはX線、紫外線、重イオンビーム等の各種変異処理が用いられ、そこから有用な性質を指標としたスクリーニングを行うことにより、様々な酵素活性や、醸造特性等の優れた株が作出されてきた。近年、ゲノム情報を利用してこれらの有用な形質を持つ菌株を解析し、得られた知見により染色体の重複が麹菌に好ましい性質を付与するのに重要であることが判明しており、突然変異処理によって９００ｋｂ以上の大規模なゲノム領域の重複をもつ麹菌が得られている（特許文献１）。又、最近の研究により、ガンマ線照射により得られた酵母を解析すると、染色体の重複領域の境界領域に高頻度で共通の繰り返し配列が存在することが報告された（非特許文献１）。
しかしながら、このような染色体の重複のメカニズムは解明されていない。従って、変異処理を用いた従来の方法では、酵素活性等を指標としてスクリーニングを行った際に、たまたまその活性に関係のある染色体上の領域に重複を持つ菌株が得られるだけで、実際には様々な染色体上の部位でランダムに変異が起こるため、麹菌の染色体上の特定の箇所を狙って重複させることは不可能であった。又、このような変異を利用して得られた染色体の重複株の場合には、それらの間の相同配列間の組換えにより復帰変異（すなわち染色体重複の脱落）が高い頻度で生じることも知られている。
一方、遺伝子組換え法に関しては、これまでに、麹菌の染色体上の任意の領域を広範囲に亘ってタンデムに重複させる方法として、麹菌染色体における大領域重複の作製方法（特許文献２）が開発されている。この方法では、麹菌の染色体上において数十〜数百ｋｂ（例えば、約２００ｋｂ〜約７００ｋｂ）に及ぶ任意の大きな領域の重複を起こさせることが可能となった。
Argueso et al. (2008) Proc Natl Acad Sci U S A. 105:11845-11850.
この方法では染色体上の７００ kb以上に渡る領域をタンデムに重複させることが可能である。しかしながら、以下にあげるような改善点を有している。
まず、タンデムの重複では、重複した配列が同一の染色体上に存在しているため、形質転換マーカーに基づく選択圧がない状態ではタンデムに並んだ相同領域間の組換えにより重複領域の脱落が起きる可能性があり、特定の栄養要求性が実質的に意味を持たない冨栄養状態においては安定性に懸念がある。そのために安定的に重複状態を維持するためには、使用できる培地が制限される。
更に、タンデムの重複株では、重複を保持したまま安定的にマーカー部分のみを除くことが技術的に困難であるため、該重複株の染色体に組み込まれている形質転換マーカーとは異なる、新たなマーカーを使用しない限り、コピー数をこれ以上増やすことは難しい。
本発明は上記の問題点を解決し、麹菌の染色体上の任意の大領域を広範囲に亘って重複転座させる技術を提供し、従来は取得不能であった新たな形質を持つ麹菌の取得を安定的・計画的に可能にすることを目的とする。
即ち、本発明者は、アスペルギルス属に属する菌を用い、染色体の任意の領域を広範囲に亘って重複転座させる方法の開発を試みた。
即ち、本発明は以下の各態様に係る。
［態様１］
アスペルギルス属に属する菌において、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域のセントロメア側の外側にコード領域の５’ 末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が該遺伝子の５’末端がセントロメア側に位置するように組み込まれ、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域のセントロメア側の外側にコード領域の３’ 末端の一部が欠損した該形質転換マーカー遺伝子が該遺伝子の５’末端がセントロメア側に位置するように組み込まれていることを特徴とする、形質転換体。
［態様２］
アスペルギルス属に属する菌において、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域のセントロメア側の外側にコード領域の３’ 末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が該遺伝子の３’末端がセントロメア側に位置するように組み込まれ、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域のセントロメア側の外側にコード領域の５’ 末端の一部が欠損した該形質転換マーカー遺伝子がその３’末端がセントロメア側に位置するように組み込まれていることを特徴とする、形質転換体。
［態様３］
コード領域の５’又は３’末端の一部が欠損した２つの形質転換マーカー遺伝子に共通して存在する該遺伝子のコード領域の中間部分が約１００ｂp〜約２ｋｂの塩基を有する、態様１又は２に記載の形質転換体。
［態様４］
形質転換マーカー遺伝子が、pyrG、sC及びniaDから成る群から選択される、態様１ないし３のいずれか一項に形質転換体。
［態様５］
形質転換マーカー遺伝子のいずれか一方又はその両方のコード領域の中間部分に存在する相同配列領域に予め制限酵素認識部位が導入されている、態様１ないし４のいずれか一項に記載の形質転換体。
［態様６］
制限酵素がI-sceI、I-ceuI、PI-pspI及びPI-sceIから成る群から選択される、態様５記載の形質転換体。
［態様７］
制限酵素認識部位が相同組換えによって導入されたものである、態様５又は６に記載の形質転換体。
［態様８］
アスペルギルス属に属する菌がアスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼである、態様１ないし７のいずれかに記載の形質転換体。
［態様９］
アスペルギルス属に属する菌の染色体上の任意の領域を重複転座させる方法であって、
（１）態様１ないし８のいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、
（２）２つの異なる染色体に組み込まれた夫々の形質転換マーカー遺伝子のコード領域の中間部分に共通して存在する相同配列領域間における二重鎖切断時の修復機構を介した、該形質転換体における２つの異なる染色体の間での相同組換えによって、該ターゲット領域が重複転座された菌株を得、
（３）上記の相同組換えによってコード領域の完全長が構築された該形質転換マーカー遺伝子に基づく形質によって、該ターゲット領域が重複された菌株を選択することから成る、前記方法。
［態様１０］
形質転換体が多核の状態にあることを特徴とする、態様９記載の方法。
［態様１１］
形質転換体に紫外線照射することによって、２つの異なる染色体の間での相同組換えを促進させることを特徴とする、態様９又は１０記載の方法。
［態様１２］
制限酵素の作用下に形質転換体を培養して相同組換えを生起させる、態様９ないし１１のいずれか一項に記載の方法。
［態様１３］
態様９〜１２のいずれか一項に記載の方法で得られた、染色体上に重複転座領域を有するアスペルギルス属に属する菌。
［態様１４］
アスペルギルス属に属する菌がアスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼである、態様１３記載の形質転換体。
［態様１５］
重複転座領域が千ｋｂ以上である、態様１３又は１４記載のアスペルギルス属に属する菌。
［態様１６］
態様１４ないし１５のいずれか一項に記載のアスペルギルス属に属する菌を用いて製造される醤油。
［態様１］
アスペルギルス属に属する菌において、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域のセントロメア側の外側にコード領域の５’ 末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が該遺伝子の５’末端がセントロメア側に位置するように組み込まれ、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域のセントロメア側の外側にコード領域の３’ 末端の一部が欠損した該形質転換マーカー遺伝子が該遺伝子の５’末端がセントロメア側に位置するように組み込まれていることを特徴とする、形質転換体。
［態様２］
アスペルギルス属に属する菌において、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域のセントロメア側の外側にコード領域の３’ 末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が該遺伝子の３’末端がセントロメア側に位置するように組み込まれ、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域のセントロメア側の外側にコード領域の５’ 末端の一部が欠損した該形質転換マーカー遺伝子がその３’末端がセントロメア側に位置するように組み込まれていることを特徴とする、形質転換体。
［態様３］
コード領域の５’又は３’末端の一部が欠損した２つの形質転換マーカー遺伝子に共通して存在する該遺伝子のコード領域の中間部分が約１００ｂp〜約２ｋｂの塩基を有する、態様１又は２に記載の形質転換体。
［態様４］
形質転換マーカー遺伝子が、pyrG、sC及びniaDから成る群から選択される、態様１ないし３のいずれか一項に形質転換体。
［態様５］
形質転換マーカー遺伝子のいずれか一方又はその両方のコード領域の中間部分に存在する相同配列領域に予め制限酵素認識部位が導入されている、態様１ないし４のいずれか一項に記載の形質転換体。
［態様６］
制限酵素がI-sceI、I-ceuI、PI-pspI及びPI-sceIから成る群から選択される、態様５記載の形質転換体。
［態様７］
制限酵素認識部位が相同組換えによって導入されたものである、態様５又は６に記載の形質転換体。
［態様８］
アスペルギルス属に属する菌がアスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼである、態様１ないし７のいずれかに記載の形質転換体。
［態様９］
アスペルギルス属に属する菌の染色体上の任意の領域を重複転座させる方法であって、
（１）態様１ないし８のいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、
（２）２つの異なる染色体に組み込まれた夫々の形質転換マーカー遺伝子のコード領域の中間部分に共通して存在する相同配列領域間における二重鎖切断時の修復機構を介した、該形質転換体における２つの異なる染色体の間での相同組換えによって、該ターゲット領域が重複転座された菌株を得、
（３）上記の相同組換えによってコード領域の完全長が構築された該形質転換マーカー遺伝子に基づく形質によって、該ターゲット領域が重複された菌株を選択することから成る、前記方法。
［態様１０］
形質転換体が多核の状態にあることを特徴とする、態様９記載の方法。
［態様１１］
形質転換体に紫外線照射することによって、２つの異なる染色体の間での相同組換えを促進させることを特徴とする、態様９又は１０記載の方法。
［態様１２］
制限酵素の作用下に形質転換体を培養して相同組換えを生起させる、態様９ないし１１のいずれか一項に記載の方法。
［態様１３］
態様９〜１２のいずれか一項に記載の方法で得られた、染色体上に重複転座領域を有するアスペルギルス属に属する菌。
［態様１４］
アスペルギルス属に属する菌がアスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼである、態様１３記載の形質転換体。
［態様１５］
重複転座領域が千ｋｂ以上である、態様１３又は１４記載のアスペルギルス属に属する菌。
［態様１６］
態様１４ないし１５のいずれか一項に記載のアスペルギルス属に属する菌を用いて製造される醤油。
本発明によって、アスペルギルス属に属する菌の染色体上において、特許文献２において重複が得られた領域よりもより大きな領域、例えば、染色体のセントロメア近傍からテロメア近傍領域に亘るアーム全体の領域であって千ｋｂ以上（例えば、約１４００ｋｂ）に及ぶ任意の大きな領域の重複転座を起こさせることが可能となった。
重複転座の対象となるターゲット領域として、本明細書の実施例に記載されているように、アスペルギルス属に属する各菌において有用物質（例えば、各種酵素類）をコードする遺伝子が多数含まれている第２番の染色体のセントロメア近傍からテロメア近傍領域に亘るアーム全体を用いることによって、本発明方法で得られた染色体上に重複転座領域を有するアスペルギルス属に属する菌は、プロテアーゼ及びα―アミラーゼ等の酵素活性が数倍増加していることが確認された。
更に、本発明によって得られる重複転座株においては、重複転座した相同領域が、別々の染色体にあるため、選択圧がない状態でも重複転座した領域の脱落の恐れはなく、安定している。
又、本発明の重複転座株においては、形質転換マーカー部分のみを除去することが可能であるため、該マーカーをリサイクルして使うことで、さらにコピー数を増やすことが可能であり、理論的には重複転座領域のコピー数を染色体の末端の数、すなわち16コピーまで増やすことが可能である。
本発明は宿主に内在性の遺伝子しか使用しておらず、作出した重複転座株中にも外来遺伝子が残らないセルフクローニング株であることから、醤油の醸造等、食品製造に使用する微生物（例えば、醤油麹）の育種法としても極めて優れた方法である。
外来ＤＮＡの染色体への組込みは染色体DNAの二重鎖切断時の修復機構を介して行われることが知られており、このDNA修復機構には相同組換えと非相同組換え（非相同末端結合）の２種類の機構が存在する。相同組換えの場合には外来ＤＮＡと相同性のある領域を介して組込みが起こるが、非相同組換えの場合には外来ＤＮＡの配列には関係なく染色体上のランダムな位置への組込みが起こり、これら２つの組換え機構は平衡して作用していると考えられている（Ristic et al. Nucl. Acids Res. (2003) 31: 5229-5237）。
相同組換え機構の中心をなす遺伝子はrad52グループと呼ばれる一連の遺伝子でその中にrad50、51、52、54、Mre11、XRS2等が含まれる（Kooistra et al. 2004）。相同組換え機構はバクテリアから真核生物まで多くの生物種で存在が確認され、Aspergillus属の実験室株であり単核分生子を持つAspergillus nidulansにおいてもuvsC遺伝子がクローニングされ研究が進められており(van Heemst et al. Mol. Gen. Genet. (1997)254: 654-64)、発現頻度を一定レベル上昇させることで相同組換頻度が向上することが報告されている（Natsume et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. (2004) 68: 1649-1656）。
一方で、非相同組換え機構は相同組換えとは全く異なる非相同末端結合（Non-Homologous End Joining）によることが明らかとなっており、この機構の中心になる遺伝子としてはKu70、Ku80、Xrcc4、LIG4、DNAPKcsなどが知られている。Ku70およびKu80はヘテロダイマーとして機能し、ヌクレオチドキナーゼ(XRCC4)およびDNA LigaseVIとともに複合体を形成して、ＤＮＡ二重鎖切断（DSB）時にその修復のためにDNA末端に結合してNon-Homologous End Joiningを促進することが知られている。（Walker et al. Nature (2001) 412: 607-614）。このKuを介した非相同組換え機構に関しては真核生物でのみ存在が確認されている。
本発明における麹菌染色体重複転座株の作製の概略について以下に述べる。
染色体の重複は染色体中に生じた二重鎖切断を修復する過程で生じると考えられているが、その詳しいメカニズムは判っていない。しかしながら２倍体酵母においてガンマ線照射により取得された変異株の染色体を解析すると染色体の重複あるいは転座が起きた領域の境界付近に繰り返し配列が存在することが報告されている（非特許文献１）。
染色体の重複は染色体中に生じた二重鎖切断を修復する過程で生じると考えられているが、その詳しいメカニズムは判っていない。しかしながら２倍体酵母においてガンマ線照射により取得された変異株の染色体を解析すると染色体の重複あるいは転座が起きた領域の境界付近に繰り返し配列が存在することが報告されている（非特許文献１）。
以上のことから、例えば、内部に相同な領域を保持させた状態で、５’ 末端を部分的に欠損させることにより遺伝子機能を失わせた５’ΔpyrGを転座により重複させたい領域の元の染色体部位に組込み、同様に３’ 末端を部分的に欠損させることにより遺伝子機能を失わせた３’ΔpyrGを、上記の重複させたい領域を転座させたい別の染色体上の境界部分に組み込んだ形質転換体を作製し、この形質転換体の培養過程において、相同配列内部で二重鎖切断が引き起こされた後に相同領域間の組換えを介した修復により目的部位での転座により完全型のpyrGが再構成された株、即ち、最小培地上で生育可能になった株を選択することで、染色体上の狙った部位での染色体重複転座株が作製出来るのではないかと考えられる（図１）。
本発明の形質転換体の親株として使用するアスペルギルス属に属する菌に属する菌株としては、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ等の任意の菌株が挙げられるが、そのうちアスペルギルス・ソーヤ及びアスペルギルス・オリゼに属する菌株が好ましい。
このような菌株としては、例えば、アスペルギルス・ソーヤ ２６２（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８８）、アスペルギルス・ソーヤ ２１６５（ＦＥＲＭ Ｐ−７２８０）、アスペルギルス・ソーヤ （ＡＴＣＣ４２２５１）、アスペルギルス・オリゼ（ＩＡＭ２６３８）、及びアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０（ＮＢＲＣ１００９５９）等の公的寄託機関で保存されており当業者には容易に入手可能であるような各菌株等を挙げることができる。
本発明の形質転換体を使用して、アスペルギルス属に属する菌の染色体上において千kb以上に及ぶ任意の大きな領域を重複転座させることが可能である。
即ち、本発明の形質転換体の第一の型においては、アスペルギルス属に属する菌において、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域の外側にコード領域の５’ 末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が組み込まれ、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域の外側には、３’ 末端の一部が欠損した該形質転換マーカー遺伝子が組み込まれていることを特徴とする。
より具体的には、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域のセントロメア側の外側にコード領域の５’ 末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子がその５’末端がセントロメア側に位置するように組み込まれ、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域のセントロメア側の外側にコード領域の３’ 末端の一部が欠損した該形質転換マーカー遺伝子がその５’末端がセントロメア側に位置するように組み込まれている。
本発明の形質転換体の第二の型においては、アスペルギルス属に属する菌において、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域の外側にコード領域の３’ 末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が組み込まれ、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域の外側には、５’ 末端の一部が欠損した該形質転換マーカー遺伝子が組み込まれていることを特徴とする。
より具体的には、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域のセントロメア側の外側にコード領域の３’ 末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子がその３’末端がセントロメア側に位置するように組み込まれ、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域のセントロメア側の外側にコード領域の５’ 末端の一部が欠損した該形質転換マーカー遺伝子がその３’末端がセントロメア側に位置するように組み込まれている、ことを特徴とする。
上記の第一又は第二のいずれの型の形質転換体においても、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域は、該染色体の長腕又は短腕のいずれの側に位置していても良い。更に、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域も該別の染色体の長腕又は短腕のいずれの側に位置していても良い。尚、本明細書においては、染色体上の短腕側のテロメア末端を上流側とし、長腕側のテロメア末端を下流側と定義する。その結果、重複転座の対象となるターゲット領域及び該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域が夫々の染色体において長腕又は短腕のいずれの側に位置するかによって、以下の４つの場合が考えられる。
従って、本発明の形質転換体の第一の型には以下の４つの場合がある。
即ち、第１例として、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域及び該ターゲット領域と置き換えられる領域が共に夫々の染色体の長腕に位置するような場合には、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域の５’ 末端の外側にコード領域の５’ 末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が５’側を上流にして組み込まれ、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域の５’末端の外側にコード領域の３’ 末端の一部が欠損した該形質転換マーカー遺伝子が５’側を上流にして組み込まれている。
即ち、第１例として、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域及び該ターゲット領域と置き換えられる領域が共に夫々の染色体の長腕に位置するような場合には、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域の５’ 末端の外側にコード領域の５’ 末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が５’側を上流にして組み込まれ、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域の５’末端の外側にコード領域の３’ 末端の一部が欠損した該形質転換マーカー遺伝子が５’側を上流にして組み込まれている。
第２例として、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域及び該ターゲット領域と置き換えられる領域が共に夫々の染色体の短腕に位置するような場合には、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域の３’ 末端の外側にコード領域の５’ 末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が３’を上流にして逆向きで組み込まれ、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域の３’末端の外側にコード領域の３’ 末端の一部が欠損した該形質転換マーカー遺伝子が３’側を上流にして逆向きで組み込まれている。
第３例として、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域が染色体の長腕に位置し、一方、該ターゲット領域と置き換えられる領域が染色体の短腕に位置するような場合には、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域の５’ 末端の外側にコード領域の５’ 末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が５’側を上流にして組み込まれ、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域の３’末端の外側にコード領域の３’ 末端の一部が欠損した該形質転換マーカー遺伝子が３’側を上流にして逆向きで組み込まれている。
更に、第４例として、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域が染色体の短腕に位置し、一方、該ターゲット領域と置き換えられる領域が染色体の長腕に位置するような場合には、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域の３’ 末端の外側にコード領域の５’ 末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が３’を上流にして逆向きで組み込まれ、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域の５’末端の外側にコード領域の３’ 末端の一部が欠損した該形質転換マーカー遺伝子が５’側を上流にして組み込まれている。
同様に、本発明の形質転換体の第二の型にも以下の４つの場合がある。
即ち、第１例として、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域及び該ターゲット領域と置き換えられる領域が共に夫々の染色体の長腕に位置するような場合には、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域の５’ 末端の外側にコード領域の３’ 末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が３’を上流にして逆向きで組み込まれ、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域の５’末端の外側にコード領域の５’ 末端の一部が欠損した該形質転換マーカー遺伝子が３’ 側を上流にして逆向きで組み込まれている。
即ち、第１例として、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域及び該ターゲット領域と置き換えられる領域が共に夫々の染色体の長腕に位置するような場合には、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域の５’ 末端の外側にコード領域の３’ 末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が３’を上流にして逆向きで組み込まれ、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域の５’末端の外側にコード領域の５’ 末端の一部が欠損した該形質転換マーカー遺伝子が３’ 側を上流にして逆向きで組み込まれている。
第２例として、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域及び該ターゲット領域と置き換えられる領域が共に夫々の染色体の短腕に位置するような場合には、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域の３’ 末端の外側にコード領域の３’ 末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が５’側を上流にして組み込まれ、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域の３’末端の外側にコード領域の５’ 末端の一部が欠損した該形質転換マーカー遺伝子が５’側を上流にして組み込まれている。
第３例として、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域が染色体の長腕に位置し、一方、該ターゲット領域と置き換えられる領域が染色体の短腕に位置するような場合には、或る染色体上重複転座の対象となるターゲット領域の５’ 末端の外側にコード領域の３’ 末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が３’を上流にして逆向きで組み込まれ、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域の３’末端の外側にコード領域の５’ 末端の一部が欠損した該形質転換マーカー遺伝子が５’側を上流にして組み込まれている。
更に、第４例として、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域が染色体の短腕に位置し、一方、該ターゲット領域と置き換えられる領域が染色体の長腕に位置するような場合には、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域の３’ 末端の外側にコード領域の３’ 末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が５’側を上流にして組み込まれ、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域の５’末端の外側にコード領域の５’ 末端の一部が欠損した該形質転換マーカー遺伝子が３’ 側を上流にして逆向きで組み込まれている。
このような構造上の特徴を有するいずれかの形質転換体を培養することによって、２つの異なる染色体に組み込まれた夫々の形質転換マーカー遺伝子のコード領域の中間部分に共通して存在する相同配列領域間（図１及び図２中で斜線で示した部分）における二重鎖切断時の修復機構を介した、該形質転換体における２つの異なる染色体の間での相同組換えによって、該ターゲット領域が重複転座された菌株が得られる。ターゲット領域並びに２つの異なる染色体は、重複転座の対象となるターゲット領域及び菌株の種類等に応じて任意に選択することが出来る。例えば、実施例で示されるように、アスペルギルス属に属する各菌において有用物質（例えば、各種酵素類）をコードする遺伝子が多数含まれている、第２番の染色体のセントロメア近傍からテロメア近傍領域に亘るアーム全体をターゲット領域として選択することができる。
尚、形質転換体において重複転座の対象となるターゲット領域と該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域の一方が夫々の染色体において長腕又は短腕いずれか一方の同じ腕側に位置する場合には、上記の相同組換えによって得られるターゲット領域が重複転座された菌株において重複転座されたターゲット領域は５’側を上流にして組み込まれることになる。
これに対して、形質転換体において重複転座の対象となるターゲット領域が長腕又は短腕いずれか一方の腕側に位置し、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域が他方の腕側に位置する場合には、上記の相同組換えによって得られるターゲット領域が重複転座された菌株において重複転座されたターゲット領域は３’ 側を上流にして逆向きで組み込まれることになる。
本発明で使用するアスペルギルス属に属する菌としては、上記のような非相同組換え機構に関与する各種遺伝子が抑制又は欠失している形質転換菌（特開２００６−１５８２６９号公報）を使用することによって、より効果的である。
又、該形質転換体における組み込まれる形質転換マーカー遺伝子は、相同組換えを効率よく生起するのに十分な長さ、例えば、数百ｂｐ以上、数百ｂｐ〜数ｋｂ程度（例えば、約１００ｂp〜約２ｋｂ）の塩基配列がコード領域の中間部分に残るように、そのコード領域の５’末端又は３’末端の一部が欠損していることが好ましい。即ち、２つの異なる染色体に組み込まれた夫々の一部が欠損している形質転換マーカー遺伝子において、元の形質転換マーカー遺伝子のコード領域の中間部分に存在する上記の長さの塩基配列が共通して残っていることが好ましい。従って、形質転換マーカー遺伝子のコード領域において欠損させる５’末端又は３’末端領域の塩基配列の長さは、使用する形質転換マーカー遺伝子の種類及び全長等に応じて、当業者が適宜決めることが出来る。例えば、pyrG遺伝子を使用する場合には、通常、例えば、約０．４ｋｂ〜約１．４ｋｂである。又、欠損させる５’末端又は３’末端領域の塩基配列の長さは同じである必要はない。
本発明の形質転換体を培養した場合に、上記の相同組換えによって該ターゲット領域が重複転座された菌株においては同時に形質転換マーカー遺伝子コード領域の完全長が構築される結果、形質転換マーカー遺伝子に基づく形質によって、該ターゲット領域が重複転座された菌株を該ターゲット領域が重複されていない（即ち、形質転換マーカー遺伝子コード領域の完全長が構築されていない）菌株から選択すること出来る。尚、上記の形質転換マーカー遺伝子のコード領域の５‘側には、目的とする遺伝子自身のコード領域に加えて、該遺伝子のプロモーター領域及びターミネーター領域等の転写調節領域も含まれていても良い。
本発明で使用するこのような形質転換マーカーに特に制限はないが、ポジティブ選択可能なマーカー遺伝子の代表例として、pyrG、sC及びniaD等を挙げることが出来、これらマーカー遺伝子を使用した際には、夫々の栄養要求性（ウリジン要求、イオウ資化、及び、硝酸資化）を補償する形質によって該ターゲット領域が重複転座された菌株を選択することが可能となる。
尚、これらのマーカー遺伝子は、選択用の薬剤を含む培地で培養することによって、該マーカー遺伝子を含有する菌はそこに含まれている該マーカー遺伝子の発現産物によって選択用の薬剤が細胞毒性物質に変換され細胞死に至らしめることによって、ネガティブ選択にも使用することが出来る。
更に、上記形質転換マーカー遺伝子のいずれか一方又はその両方のコード領域の中間部分に存在する相同配列領域に予め、I-sceI、I-ceuI、PI-pspI及びPI-sceI等の当業者に公知の適当な制限酵素認識部位を導入しておくことが出来る。このような制限酵素部位は、相同組換え等の当業者に公知の任意の手段によって導入することが出来る。
従って、本発明は、上記の形質転換体を使用してアスペルギルス属に属する菌の染色体上の任意の領域を重複転座させる方法にも係る。この方法の一例の概略は図１に示したとおりである。即ち、本発明方法は、
（１）上記の本発明に係る形質転換体を培養し、
（２）２つの異なる染色体に組み込まれた夫々の形質転換マーカー遺伝子のコード領域の中間部分に共通して存在する相同配列領域間における二重鎖切断時の修復機構を介した、該形質転換体における２つの異なる染色体の間での相同組換えによって、該ターゲット領域が重複転座された菌株を得、
（３）上記の相同組換えによってコード領域の完全長が構築された該形質転換マーカー遺伝子に基づく形質によって、該ターゲット領域が重複された菌株を選択することから成る。
（１）上記の本発明に係る形質転換体を培養し、
（２）２つの異なる染色体に組み込まれた夫々の形質転換マーカー遺伝子のコード領域の中間部分に共通して存在する相同配列領域間における二重鎖切断時の修復機構を介した、該形質転換体における２つの異なる染色体の間での相同組換えによって、該ターゲット領域が重複転座された菌株を得、
（３）上記の相同組換えによってコード領域の完全長が構築された該形質転換マーカー遺伝子に基づく形質によって、該ターゲット領域が重複された菌株を選択することから成る。
本発明方法は、本発明の形質転換体を通常の条件で培養することによって、形質転換マーカー遺伝子のコード領域の中間部分に共通して存在する相同配列領域間において二重鎖の切断が適当な頻度で生じた時に働く修復機構を介した相同組換えを利用するものである。
本発明方法において、形質転換体を培養する際に、適当な時期、例えば、培養開始前に形質転換体の分生子に紫外線及びＸ線等の当業者に公知の適当な突然変異処理を施すことによって、２つの異なる染色体の間での相同組換えを促進させて相同組換えの効率を高めることが出来る。例えば、分生子懸濁液に紫外線処理をする場合には、当業者に公知の任意の手段を用いて、通常、15W紫外線ランプ下で１〜１０分間程度照射することが好ましい。尚、本発明の形質転換体を培養する際に、特にプロトプラストの状態にする必要はない。
更に、コード領域の中間部分に存在する相同配列領域に、予め、I-sceI、I-ceuI、PI-pspI及びPI-sceI等の当業者に公知の適当な制限酵素認識部位が導入された形質転換マーカー遺伝子を使用する場合には、該制限酵素の作用下に形質転換体を培養して部位特異的切断を起こさせ、それによって相同組換えの効率を高めることが出来る。具体的には、例えば、プロトプラストの状態にした形質転換体と制限酵素を融合補助剤（例えば、PEG等）の存在下で混合すること（プロトプラストPEG法）によって、制限酵素を該形質転換体に効率よく作用させることが可能である。
尚、本発明の形質転換体は、本願明細書の実施例に記載されているような当業者の公知の手段を用いて作製することが出来る。又、形質転換体の培養は当業者に公知の適当な条件で実施することが出来る。
更に、本発明は、以上の方法で得られた、染色体上に、例えば、千ｋｂ以上（例えば、約１４００ｋｂ）の重複転座領域を有するアスペルギルス属に属する菌にも係るものである。重複転座の対象となるターゲット領域は任意に選択することができるので、有用な酵素類をコードする公知の各種領域をターゲット領域とすることによって、醤油の醸造等、食品製造に有用な菌（例えば、醤油麹）を得ることが出来る。従って、本発明は、このような該麹菌を用いて製造される醤油等の食品にも係るものである。
以下、実施例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
［実験方法］
使用菌株
Aspergillus oryzae RP-1株（ΔpyrG）。Aspergillus oryzae RP-1株はRIB40(=ATCC42149) 由来のpyrG deletion株（Takahashi et al. (2006) Biosci Biotechnol Biochem. 70:135-143）。
使用菌株
Aspergillus oryzae RP-1株（ΔpyrG）。Aspergillus oryzae RP-1株はRIB40(=ATCC42149) 由来のpyrG deletion株（Takahashi et al. (2006) Biosci Biotechnol Biochem. 70:135-143）。
使用培地
ポリペプトンデキストリン（ＰＤ）培地（polypepton 1%, dextrin 2%, KH2PO4 0.5%, NaNO3 0.1%, MgSO4 0.05%, casamino acid 0.1%, pH 6.0）、CzapekDox (CZ) 最小培地、再生培地として1.2M ソルビトール CZを使用した。1.5 mg/ml 5fluoroortic acid（5FOA） (シグマ社) および20mM ウリジンを含むCZ培地プレートをpyrG-（ウリジン要求）株のポジティブセレクション用の培地として使用した。
ポリペプトンデキストリン（ＰＤ）培地（polypepton 1%, dextrin 2%, KH2PO4 0.5%, NaNO3 0.1%, MgSO4 0.05%, casamino acid 0.1%, pH 6.0）、CzapekDox (CZ) 最小培地、再生培地として1.2M ソルビトール CZを使用した。1.5 mg/ml 5fluoroortic acid（5FOA） (シグマ社) および20mM ウリジンを含むCZ培地プレートをpyrG-（ウリジン要求）株のポジティブセレクション用の培地として使用した。
形質転換
150ｍｌ容三角フラスコ中の20ｍＭ Uridineを含むポリペプトンデキストリン液体培地50ｍｌに分生子を接種し、30℃で約20時間振とう培養を行い、菌体を回収した。回収した菌体を0.7 M KCl bufferで洗浄し、1％ Lysing enzyme(シグマ社)を含む0.7M KCl buffer中で30℃、3時間緩やかに振とうし、プロトプラストを調製した。得られたプロトプラストを1.2 Ｍソルビトール bufferで洗浄した後、プロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行った。形質転換体の再生は0.5％agarを含む1.2Ｍソルビトール-ＣＺ培地上で行った。
150ｍｌ容三角フラスコ中の20ｍＭ Uridineを含むポリペプトンデキストリン液体培地50ｍｌに分生子を接種し、30℃で約20時間振とう培養を行い、菌体を回収した。回収した菌体を0.7 M KCl bufferで洗浄し、1％ Lysing enzyme(シグマ社)を含む0.7M KCl buffer中で30℃、3時間緩やかに振とうし、プロトプラストを調製した。得られたプロトプラストを1.2 Ｍソルビトール bufferで洗浄した後、プロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行った。形質転換体の再生は0.5％agarを含む1.2Ｍソルビトール-ＣＺ培地上で行った。
I-SceIを用いた重複転座株の作製
染色体重複転座株の作製は、以下の通りに行った。約2X107/100μl量のプロトプラスト溶液に対し、20μlのPEG溶液を加えた後、50Uまたは0UのI-SceIを加え、氷中に40分保持した後、70μlのPEG溶液を加え、さらに室温で20分保持した後、1.2Ｍソルビトール-ＣＺ培地プレート上で再生させた。CZ培地上で生育の見られた株を染色体重複転座候補株として以後の解析に使用した。
染色体重複転座株の作製は、以下の通りに行った。約2X107/100μl量のプロトプラスト溶液に対し、20μlのPEG溶液を加えた後、50Uまたは0UのI-SceIを加え、氷中に40分保持した後、70μlのPEG溶液を加え、さらに室温で20分保持した後、1.2Ｍソルビトール-ＣＺ培地プレート上で再生させた。CZ培地上で生育の見られた株を染色体重複転座候補株として以後の解析に使用した。
ふすま麹の作製法
麹菌の酵素活性評価は定法に従って行なった。すなわち、80％散水した小麦ふすま５ｇを150ｍｌ容三角フラスコに入れ、121℃、50分滅菌した後、麹菌を２白金耳程度接種し30℃、4日間培養する。培養後、滅菌水100mlを入れ、ゴム栓をして十分に振とうし、4時間室温にて静置した後、No.2の濾紙（アドバンテック社製）で濾過して得られた抽出液を酵素サンプルとした。
麹菌の酵素活性評価は定法に従って行なった。すなわち、80％散水した小麦ふすま５ｇを150ｍｌ容三角フラスコに入れ、121℃、50分滅菌した後、麹菌を２白金耳程度接種し30℃、4日間培養する。培養後、滅菌水100mlを入れ、ゴム栓をして十分に振とうし、4時間室温にて静置した後、No.2の濾紙（アドバンテック社製）で濾過して得られた抽出液を酵素サンプルとした。
プロテアーゼ活性の測定法
得られた酵素サンプルを適宜希釈し、「しょうゆ試験法」（財団法人 日本醤油研究所 昭和60年、287ページ）に記載の方法に従って測定した。プロテアーゼ活性は、ふすま麹１ｇ当り1分間に1μモルのチロシンを生成する活性を１U（ユニットまたは単位）として示した。
得られた酵素サンプルを適宜希釈し、「しょうゆ試験法」（財団法人 日本醤油研究所 昭和60年、287ページ）に記載の方法に従って測定した。プロテアーゼ活性は、ふすま麹１ｇ当り1分間に1μモルのチロシンを生成する活性を１U（ユニットまたは単位）として示した。
α-アミラーゼ活性の測定法
得られた酵素サンプルを適宜希釈し、α-アミラーゼ測定キット（キッコーマン醸造分析キット、コード60213）を用い、キットのプロトコルに従って測定を行なった。α-アミラーゼ活性は、ふすま麹１ｇ当り1分間に1μモルの2-クロロ-4-ニトロフェノールを遊離する力価を１U（ユニットまたは単位）として示した。
得られた酵素サンプルを適宜希釈し、α-アミラーゼ測定キット（キッコーマン醸造分析キット、コード60213）を用い、キットのプロトコルに従って測定を行なった。α-アミラーゼ活性は、ふすま麹１ｇ当り1分間に1μモルの2-クロロ-4-ニトロフェノールを遊離する力価を１U（ユニットまたは単位）として示した。
定量PCR（リアルタイムPCR）を用いた染色体中の遺伝子コピー数の比較
定量PCRはMx3005P（アジレント・テクノロジー社）を用いて行った。rad52をノーマライザーとして相対定量法により、２番染色体上のAlp （B1036）、amyR、prtT（B1212）、D1258、B1440、B1555および４番染色体上のD0024、D0123および８番染色体上のH19の各遺伝子のコピー数を親株（RIB40）と染色体重複株（UV4-C株及びBN1-1株）比較した。PCRの条件は95℃で10分保持した後、95℃20秒−58℃30秒−72℃30秒を40サイクル繰り返した。rad52、Alp、prtT、H19、D1258、B1440、B1555、D0024、D0123の各遺伝子の増幅には、r52UR-r52LR、AlpU-AlpL、prtTU-prtTL、H19U-H19L、1258D U-1258D L、B1440U-B1440L、B1555U-B1555L、D0024U-D0024L、D0123U-D0123Lの各プライマーを使用した（表１）。
定量PCRはMx3005P（アジレント・テクノロジー社）を用いて行った。rad52をノーマライザーとして相対定量法により、２番染色体上のAlp （B1036）、amyR、prtT（B1212）、D1258、B1440、B1555および４番染色体上のD0024、D0123および８番染色体上のH19の各遺伝子のコピー数を親株（RIB40）と染色体重複株（UV4-C株及びBN1-1株）比較した。PCRの条件は95℃で10分保持した後、95℃20秒−58℃30秒−72℃30秒を40サイクル繰り返した。rad52、Alp、prtT、H19、D1258、B1440、B1555、D0024、D0123の各遺伝子の増幅には、r52UR-r52LR、AlpU-AlpL、prtTU-prtTL、H19U-H19L、1258D U-1258D L、B1440U-B1440L、B1555U-B1555L、D0024U-D0024L、D0123U-D0123Lの各プライマーを使用した（表１）。
重複転座株作製用のベクターの構築および染色体重複転座株の確認に使用したPCRのプライマーの配列を表２に示す。
UV照射による染色体重複転座株の作製
［形質転換体の作製］
重複転座の標的とする領域は図３に示すように、A.oryzaeの２番染色体中のSC003領域のAO090003001035〜AO090003001556の各ORFの領域に対応する部分を含む1380 kbの領域（図３、斜線部）である。この領域を４番染色体SC166領域のAO090166000009とAO090166000010の境界領域（166 locus）からテロメア側に重複転座させる。そのために、B locusに５’ΔpyrGを組込み、166 locusに３’ΔpyrGを組込むためのベクターを作製した。本明細書内では以後簡略化のため、各遺伝子名のAO090003000部分を省略し、Bで表現する（例：AO090003000160 → B0160）。またAO090166000部分を省略し、Dで表現する（例：AO090166000010 → D0010）。SC003領域と対応する各遺伝子の配列は独立行政法人製品評価技術基盤機構（NITE）のゲノム解析データベースであるDOGAN（Database Of the Genomes Analyzed at NITE）に基づいている。
（http://www.bio.nite.go.jp/dogan/GeneMap?GENOME_ID=ao__G2）。
4番染色体において予定通りの重複転座が起こり、2番染色体中のtarget領域（図３）が4番染色体へと重複転座した場合、図４のような染色体構造を持った株を得ることが出来る。
［形質転換体の作製］
重複転座の標的とする領域は図３に示すように、A.oryzaeの２番染色体中のSC003領域のAO090003001035〜AO090003001556の各ORFの領域に対応する部分を含む1380 kbの領域（図３、斜線部）である。この領域を４番染色体SC166領域のAO090166000009とAO090166000010の境界領域（166 locus）からテロメア側に重複転座させる。そのために、B locusに５’ΔpyrGを組込み、166 locusに３’ΔpyrGを組込むためのベクターを作製した。本明細書内では以後簡略化のため、各遺伝子名のAO090003000部分を省略し、Bで表現する（例：AO090003000160 → B0160）。またAO090166000部分を省略し、Dで表現する（例：AO090166000010 → D0010）。SC003領域と対応する各遺伝子の配列は独立行政法人製品評価技術基盤機構（NITE）のゲノム解析データベースであるDOGAN（Database Of the Genomes Analyzed at NITE）に基づいている。
（http://www.bio.nite.go.jp/dogan/GeneMap?GENOME_ID=ao__G2）。
4番染色体において予定通りの重複転座が起こり、2番染色体中のtarget領域（図３）が4番染色体へと重複転座した場合、図４のような染色体構造を持った株を得ることが出来る。
５’ΔpyrGおよび３’ΔpyrGの作製
まず、５’ΔpyrGおよび３’ΔpyrGを作製するために、図２に示すような基本ユニットを作製した。５’ΔpyrGあるいは３’ΔpyrGユニットの作製は PCRとライゲーションを用いて行った。pyrGユニットの作製は、当業者に公知の方法を用いて、pyrG全長の転写開始点付近(5’ΔpyrGの場合)あるいはコード領域の3’側付近(3’ΔpyrGの場合)に、図２中で斜線で示す相同配列（適当な制限酵素認識部位を含んでいても良い）を組込むことにより行った。各ベクターが染色体上に組込まれた後５FOA耐性株を選択（ネガティブ選択）することにより、それぞれ相同領域での組換えにより内部が切り出された５’ΔpyrGあるいは３’ΔpyrG株が得られた。
まず、５’ΔpyrGおよび３’ΔpyrGを作製するために、図２に示すような基本ユニットを作製した。５’ΔpyrGあるいは３’ΔpyrGユニットの作製は PCRとライゲーションを用いて行った。pyrGユニットの作製は、当業者に公知の方法を用いて、pyrG全長の転写開始点付近(5’ΔpyrGの場合)あるいはコード領域の3’側付近(3’ΔpyrGの場合)に、図２中で斜線で示す相同配列（適当な制限酵素認識部位を含んでいても良い）を組込むことにより行った。各ベクターが染色体上に組込まれた後５FOA耐性株を選択（ネガティブ選択）することにより、それぞれ相同領域での組換えにより内部が切り出された５’ΔpyrGあるいは３’ΔpyrG株が得られた。
２番染色体B-locusへ５’ΔpyrGのユニットを組み込むためのベクターの作製
次に５’ΔpyrGおよび３’ΔpyrGそれぞれのユニットを染色体上のターゲットとする領域に組込むためのベクターを構築した。
まず、B-locusへ5’ ΔpyrGを組込むためのベクターは以下のようにして作製した。A.oryzae RIB40株のゲノムDNAを鋳型とし、primer B-UおよびB-Lを用いてPCRを行い、B-locus近傍を含む3 kbのDNA断片を得た。得られた断片を精製し、TOPO-TA cloning kit（invitrogen社）を用いてクローニングした。得られたプラスミドを鋳型とし、プライマーB-iUとB-iLを用いて増幅し、約6 kbのDNA断片を得た。5’ ΔpyrGを作製するための基本ユニットをプライマーP-UおよびP-Lを用いて増幅し、約3 kbのDNA断片を得た。これらの断片を精製した後、In-fusion cloning kit（Takara社）を用いて処理し、ベクターpB-d5pyrGを得た。
次に５’ΔpyrGおよび３’ΔpyrGそれぞれのユニットを染色体上のターゲットとする領域に組込むためのベクターを構築した。
まず、B-locusへ5’ ΔpyrGを組込むためのベクターは以下のようにして作製した。A.oryzae RIB40株のゲノムDNAを鋳型とし、primer B-UおよびB-Lを用いてPCRを行い、B-locus近傍を含む3 kbのDNA断片を得た。得られた断片を精製し、TOPO-TA cloning kit（invitrogen社）を用いてクローニングした。得られたプラスミドを鋳型とし、プライマーB-iUとB-iLを用いて増幅し、約6 kbのDNA断片を得た。5’ ΔpyrGを作製するための基本ユニットをプライマーP-UおよびP-Lを用いて増幅し、約3 kbのDNA断片を得た。これらの断片を精製した後、In-fusion cloning kit（Takara社）を用いて処理し、ベクターpB-d5pyrGを得た。
４番染色体166-locusへ3’ΔpyrGのユニットを組み込むためのベクターの作製
続いて166-locusへ3’ΔpyrGを組込むためのベクターを作製した。A.oryzae RIB40株のゲノムDNAを鋳型とし、primer 166-Uおよび166-Lを用いてPCRを行い、166-locus近傍を含む3 kbのDNA断片を得た。得られた断片を精製し、TOPO-TA cloning kit（invitrogen社）を用いてクローニングした。得られたプラスミドを鋳型とし、プライマー166-iUと166-iLを用いて増幅し、約6 kbのDNA断片を得た。3’ ΔpyrGを作製するための基本ユニットをプライマーP-UおよびP-Lを用いて増幅し、約3 kbのDNA断片を得た。これらの断片を精製した後、In-fusion cloning kit（Takara社）を用いて処理し、ベクターp166-d3pyrGを得た。
続いて166-locusへ3’ΔpyrGを組込むためのベクターを作製した。A.oryzae RIB40株のゲノムDNAを鋳型とし、primer 166-Uおよび166-Lを用いてPCRを行い、166-locus近傍を含む3 kbのDNA断片を得た。得られた断片を精製し、TOPO-TA cloning kit（invitrogen社）を用いてクローニングした。得られたプラスミドを鋳型とし、プライマー166-iUと166-iLを用いて増幅し、約6 kbのDNA断片を得た。3’ ΔpyrGを作製するための基本ユニットをプライマーP-UおよびP-Lを用いて増幅し、約3 kbのDNA断片を得た。これらの断片を精製した後、In-fusion cloning kit（Takara社）を用いて処理し、ベクターp166-d3pyrGを得た。
重複転座用の親株の作製
続いてこれらのベクターをA.oryzae染色体上のB-locusおよび166-locusへ組込み、染色体の重複転座用の親株を作製した。まず、A.oryzae RIB40のpyrG欠失株であるA.oryzae RP-1株に対し、pB-d5pyrGをプライマーB-UおよびB-Lを用いて増幅した断片で形質転換を行った。再生培地上で得られた形質転換体に対し、プライマーB-OUおよびB-OLを用いてスクリーニングを行い、B-locusにベクターが組込まれた株を得た。この株より分生子を回収し、5FOA-CZプレートに塗布した後、３０℃で一週間程度培養し、十分に分生子を着生した耐性株からDNAを抽出し、プライマーB-OUおよびB-OLを用いてPCRを行うことにより、pyrGの5’側の欠失を確認するとともに最小培地で生育しないことを確認し、B-locusに5’pyrGが組込まれた株（AO-B-d5pyrG株）を得た。続いて、得られた株の４番染色体の166-locusに3’ΔpyrGの組込むことを試みた。3’pyrG組込み用のベクターp166d3pyrGをプライマー166Uおよび166Lを用いて増幅し、得られた断片を用いてAO-B-d5pyrG株に対し、形質転換を行った。最小培地上で再生した形質転換体からゲノムDNAを抽出し、プライマー166-OUおよび166-OLを用いてPCRを行い、166-locusにベクターが組込まれた株を得た。得られた株から分生子を回収し、5FOA-CZプレートに塗布した後、３０℃で一週間程度培養し、十分に分生子を着生した耐性株を得た。得られた耐性株からDNAを抽出し、プライマー166-OUおよび166-OLを用いてPCRを行うことにより、pyrGの3’側の欠失を確認した。最小培地で生育しないことを確認し、最終的に２番染色体B-locusに5’pyrGが組込まれ、４番染色体166-locusに3’pyrGが組込まれた、本発明の形質転換体である、重複転座用の親株（AO-D-2株）を得た。
続いてこれらのベクターをA.oryzae染色体上のB-locusおよび166-locusへ組込み、染色体の重複転座用の親株を作製した。まず、A.oryzae RIB40のpyrG欠失株であるA.oryzae RP-1株に対し、pB-d5pyrGをプライマーB-UおよびB-Lを用いて増幅した断片で形質転換を行った。再生培地上で得られた形質転換体に対し、プライマーB-OUおよびB-OLを用いてスクリーニングを行い、B-locusにベクターが組込まれた株を得た。この株より分生子を回収し、5FOA-CZプレートに塗布した後、３０℃で一週間程度培養し、十分に分生子を着生した耐性株からDNAを抽出し、プライマーB-OUおよびB-OLを用いてPCRを行うことにより、pyrGの5’側の欠失を確認するとともに最小培地で生育しないことを確認し、B-locusに5’pyrGが組込まれた株（AO-B-d5pyrG株）を得た。続いて、得られた株の４番染色体の166-locusに3’ΔpyrGの組込むことを試みた。3’pyrG組込み用のベクターp166d3pyrGをプライマー166Uおよび166Lを用いて増幅し、得られた断片を用いてAO-B-d5pyrG株に対し、形質転換を行った。最小培地上で再生した形質転換体からゲノムDNAを抽出し、プライマー166-OUおよび166-OLを用いてPCRを行い、166-locusにベクターが組込まれた株を得た。得られた株から分生子を回収し、5FOA-CZプレートに塗布した後、３０℃で一週間程度培養し、十分に分生子を着生した耐性株を得た。得られた耐性株からDNAを抽出し、プライマー166-OUおよび166-OLを用いてPCRを行うことにより、pyrGの3’側の欠失を確認した。最小培地で生育しないことを確認し、最終的に２番染色体B-locusに5’pyrGが組込まれ、４番染色体166-locusに3’pyrGが組込まれた、本発明の形質転換体である、重複転座用の親株（AO-D-2株）を得た。
UV照射による染色体重複転座株の作製
UV照射による染色体重複転座株の作製は、以下の通りに行った。約2X106/100μl量の分生子懸濁液を塗布したマルツプレートを6枚用意し、それぞれのプレートに対し、クリーンベンチ中で蓋を開けた状態でUVランプを0分、1分、2分、3分、4分、5分間、照射した後、30℃で1週間、培養しプレート全面に分生子を形成させた。各プレートの分生子に0.01% tween液を加え、スプレッダーでかき取ることにより回収した後、一枚あたり約2X106個の分生子をカゼインプレート上に塗布し、30℃で約4日間培養し、分生子の生育状況、およびハロの形成状態を調べた。カゼインプレート上ではウリジン要求株は生育できないため、ここで生育できる株は、栄養要求が解除された株である。各UV照射で得られた再生分生子数（コロニー数）を図５に示す。UV照射0分、1分、2分のものから再生した分生子は得られなかったが、UV照射3分および5分からは各1個、4分のものからは5個の再生分生子が得られた。UV照射4分の分生子を塗布したカゼインプレートを図５に示す。5個のコロニー（UV4-A、UV4-B、UV4-C、UV4-D、UV4-E）のうち1個（UV4-C）で大きなハロの形成が確認された（図５）。
UV照射による染色体重複転座株の作製は、以下の通りに行った。約2X106/100μl量の分生子懸濁液を塗布したマルツプレートを6枚用意し、それぞれのプレートに対し、クリーンベンチ中で蓋を開けた状態でUVランプを0分、1分、2分、3分、4分、5分間、照射した後、30℃で1週間、培養しプレート全面に分生子を形成させた。各プレートの分生子に0.01% tween液を加え、スプレッダーでかき取ることにより回収した後、一枚あたり約2X106個の分生子をカゼインプレート上に塗布し、30℃で約4日間培養し、分生子の生育状況、およびハロの形成状態を調べた。カゼインプレート上ではウリジン要求株は生育できないため、ここで生育できる株は、栄養要求が解除された株である。各UV照射で得られた再生分生子数（コロニー数）を図５に示す。UV照射0分、1分、2分のものから再生した分生子は得られなかったが、UV照射3分および5分からは各1個、4分のものからは5個の再生分生子が得られた。UV照射4分の分生子を塗布したカゼインプレートを図５に示す。5個のコロニー（UV4-A、UV4-B、UV4-C、UV4-D、UV4-E）のうち1個（UV4-C）で大きなハロの形成が確認された（図５）。
PCRを用いた染色体の重複転座株の確認
続いて、得られた重複転座候補株に対し、PCRを用いて染色体上の狙った位置で重複転座が起きているかどうかを確認した。使用したプライマーの配列を表２に示す。図６に示すように、２番染色体上の転座境界領域および４番染色体上の転座境界領域の両隣接領域にプライマーを組合せ、PCR産物が増幅されるか否かにより、重複転座の有無を確認できる。転座が起きる前の状態では２番染色体上の5‘ΔpyrG の両サイドに配置したプライマーB-U＆B-Lの組合せ（１）、および４番染色体上の3’ΔpyrGの両サイドに配置したプライマーct166-U＆ct166-Lの組合せ（２）、それぞれで、約5-kbのバンドの増幅が見られる。これに対し、相互転座が起きた場合には、プライマーB-U＆ct166-Lの組合せ（３）、およびプライマーct166-U＆B-Lの組合せ（４）でバンドが増幅する。一方、重複転座が起きた場合にはプライマーB-U＆B-Lの組合せ（１）、およびプライマーct166-U＆B-Lの組合せ（４）でバンドが増幅されると考えられる。そこで転座が起きる前の親株および今回得られた重複転座の候補株であるUV4-C株およびUV4-D株よりゲノムDNAを調製し、PCRを行った。親株およびUV4-D株ではプライマーの組合せがB-U＆B-L（１）の時、およびct166-U＆ct166-L（２）の時（２）にのみバンドの増幅が見られ、転座が起きていないことが示された。一方、UV4-C株ではプライマーB-U＆B-Lの組合せ（１）、に加えてプライマーct166-U＆B-Lの組合せ（４）でもバンドが増幅されたため、狙った領域で重複転座が起きていることが示唆された（図６、電気泳動図）。
続いて、得られた重複転座候補株に対し、PCRを用いて染色体上の狙った位置で重複転座が起きているかどうかを確認した。使用したプライマーの配列を表２に示す。図６に示すように、２番染色体上の転座境界領域および４番染色体上の転座境界領域の両隣接領域にプライマーを組合せ、PCR産物が増幅されるか否かにより、重複転座の有無を確認できる。転座が起きる前の状態では２番染色体上の5‘ΔpyrG の両サイドに配置したプライマーB-U＆B-Lの組合せ（１）、および４番染色体上の3’ΔpyrGの両サイドに配置したプライマーct166-U＆ct166-Lの組合せ（２）、それぞれで、約5-kbのバンドの増幅が見られる。これに対し、相互転座が起きた場合には、プライマーB-U＆ct166-Lの組合せ（３）、およびプライマーct166-U＆B-Lの組合せ（４）でバンドが増幅する。一方、重複転座が起きた場合にはプライマーB-U＆B-Lの組合せ（１）、およびプライマーct166-U＆B-Lの組合せ（４）でバンドが増幅されると考えられる。そこで転座が起きる前の親株および今回得られた重複転座の候補株であるUV4-C株およびUV4-D株よりゲノムDNAを調製し、PCRを行った。親株およびUV4-D株ではプライマーの組合せがB-U＆B-L（１）の時、およびct166-U＆ct166-L（２）の時（２）にのみバンドの増幅が見られ、転座が起きていないことが示された。一方、UV4-C株ではプライマーB-U＆B-Lの組合せ（１）、に加えてプライマーct166-U＆B-Lの組合せ（４）でもバンドが増幅されたため、狙った領域で重複転座が起きていることが示唆された（図６、電気泳動図）。
リアルタイムPCRによるコピー数の確認
続いてリアルタイムPCR（定量PCR）を用いて2番染色体の重複領域における各遺伝子のコピー数をコントロール株（Wt：RIB40株）および染色体重複転座株（UV4-C株）で比較した（図７および図８）。実験では他の染色体に存在し、コピー数が１であるrad52をノーマライザーとして使用し、重複転座領域内のセントロメア側の端に位置するB1036遺伝子（Alp）とそこから490 kb離れた位置に存在するB1208(amyR)遺伝子、B1212(prtT)遺伝子、B1258(1258D)遺伝子、B1440遺伝子およびテロメア側の端に位置するB1555遺伝子、そして重複領域外である8番染色体に位置するH19遺伝子および転座した先の４番染色体上の領域に位置するD0024遺伝子とD0123遺伝子（図３参照）をターゲットとして、SYBR Greenを用いた相対的定量法により、親株におけるコピー数との比較を行った。図７および図８にはコントロール株（Wt:RIB40株）でのコピー数に対する相対値を示す。
続いてリアルタイムPCR（定量PCR）を用いて2番染色体の重複領域における各遺伝子のコピー数をコントロール株（Wt：RIB40株）および染色体重複転座株（UV4-C株）で比較した（図７および図８）。実験では他の染色体に存在し、コピー数が１であるrad52をノーマライザーとして使用し、重複転座領域内のセントロメア側の端に位置するB1036遺伝子（Alp）とそこから490 kb離れた位置に存在するB1208(amyR)遺伝子、B1212(prtT)遺伝子、B1258(1258D)遺伝子、B1440遺伝子およびテロメア側の端に位置するB1555遺伝子、そして重複領域外である8番染色体に位置するH19遺伝子および転座した先の４番染色体上の領域に位置するD0024遺伝子とD0123遺伝子（図３参照）をターゲットとして、SYBR Greenを用いた相対的定量法により、親株におけるコピー数との比較を行った。図７および図８にはコントロール株（Wt:RIB40株）でのコピー数に対する相対値を示す。
その結果、RIB40株に対する染色体重複株（UV4-C株）における各遺伝子のコピー数は、８番染色体（染色体重複領域外）に位置するH19では、１程度の値で変化が見られないのに対し、２番染色体の重複転座領域内に位置するB1036（Alp）遺伝子、B1208(amyR)遺伝子、B1212(prtT)遺伝子、B1258(1258D)遺伝子のコピー数はいずれも染色体重複転座株（UV4-C株）では約2倍の値に増幅していることが判明した（図７）。
また、同じく重複領域内に位置する遺伝子であるB1440およびB1555遺伝子のコピー数は、コントロールに比較して2倍に増幅しているのに対し、転座した先の４番染色体166 locusとテロメアの間の領域に位置するD0024およびD0123遺伝子のコピー数は0に近い値を示し、UV4-C株においては、この部分が消失していることが確認された（図８）。これらのことからUV4-C株においては２番染色体上の狙った領域が4番染色体の狙った領域に転座することにより、重複転座が起きていることが示された。
染色体重複株におけるプロテアーゼおよびアミラーゼ活性の測定
２番染色体の重複株については、特許文献１（特許第4469014号「大規模ゲノム重複を保持する麹菌」）で、麹菌の２番染色体上のSC003のAO090003001003〜AO090003001259に対応するゲノム領域の重複株で、プロテアーゼ活性およびアミラーゼ活性の顕著な上昇が見られることが報告されている。そこで本実験で２番染色体を重複転座させた重複株について、同様の活性上昇が見られるかどうかを調べるために、酵素活性の測定を行なった。
２番染色体の重複株については、特許文献１（特許第4469014号「大規模ゲノム重複を保持する麹菌」）で、麹菌の２番染色体上のSC003のAO090003001003〜AO090003001259に対応するゲノム領域の重複株で、プロテアーゼ活性およびアミラーゼ活性の顕著な上昇が見られることが報告されている。そこで本実験で２番染色体を重複転座させた重複株について、同様の活性上昇が見られるかどうかを調べるために、酵素活性の測定を行なった。
プロテアーゼ活性測定の結果
前述の方法によって、ふすま麹より得られた酵素抽出液を用いて全プロテアーゼ活性の測定を行い、染色体重複を持たないコントロール株（Ct株）と重複株とで比較を行なった。その結果を表３に示す。プロテアーゼ活性については、コントロール株（Ct株）の活性に対し、染色体重複転座株（UV4-C株）では約2.6倍程度に活性値が上昇していた。
前述の方法によって、ふすま麹より得られた酵素抽出液を用いて全プロテアーゼ活性の測定を行い、染色体重複を持たないコントロール株（Ct株）と重複株とで比較を行なった。その結果を表３に示す。プロテアーゼ活性については、コントロール株（Ct株）の活性に対し、染色体重複転座株（UV4-C株）では約2.6倍程度に活性値が上昇していた。
α‐アミラーゼ活性測定の結果
続いてα‐アミラーゼ活性についても同一の酵素液を用いて測定を行なった。その結果を表4に示す。その結果、コントロール株（Ct株）の活性値に対し、染色体重複転座株（UV4-C株）での活性値は約1.8倍程度に上昇していることが明らかとなった。
続いてα‐アミラーゼ活性についても同一の酵素液を用いて測定を行なった。その結果を表4に示す。その結果、コントロール株（Ct株）の活性値に対し、染色体重複転座株（UV4-C株）での活性値は約1.8倍程度に上昇していることが明らかとなった。
これらの結果から本研究で得られた染色体重複転座株（UV4-C株）においてはフスマ培養において、プロテアーゼおおびアミラーゼ活性ともに染色体重複株と同様に顕著な活性の上昇が見られることが確認された。このことから、UV4-C株では2番染色体のアルカリプロテアーゼ遺伝子を含む領域が広範囲に亘って重複していることが確認された。
以上の結果から、本発明で得られた染色体重複転座株（UV4-C株）を解析した結果、PCRおよびリアルタイムPCR（定量PCR）およびフスマ培養における活性測定の、いずれの結果においても、2番染色体のアルカリプロテアーゼ遺伝子（alp）およびamyR、prtTを含む部分（SC003領域のAO090003001035〜AO090003001556の各ORFの領域に対応する1380 kbの領域（図３、斜線部））が、4番染色体（SC166領域のAO090166000009とAO090166000010の境界領域（166 locus）からテロメア側）に重複転座し、そのことにより各遺伝子のコピー数が増えていることを示すデータが得られた。
部位特異的切断による染色体重複転座株の作製
実施例１と同様に、形質転換体の作成、５’ΔpyrGおよび３’ΔpyrGの作製、２番染色体B-locusへ５’ΔpyrGのユニットを組み込むためのベクターの作製を行った。
実施例１と同様に、形質転換体の作成、５’ΔpyrGおよび３’ΔpyrGの作製、２番染色体B-locusへ５’ΔpyrGのユニットを組み込むためのベクターの作製を行った。
４番染色体166-locusへ3’ΔpyrGのユニットを組み込むためのベクターの作製
続いて166-locusへ3’ΔpyrGを組込むためのベクターを作製した。A.oryzae RIB40株のゲノムDNAを鋳型とし、primer 166-Uおよび166-Lを用いてPCRを行い、166-locus近傍を含む3 kbのDNA断片を得た。得られた断片を精製し、TOPO-TA cloning kit（invitrogen社）を用いてクローニングした。得られたプラスミドを鋳型とし、プライマー166-iUと166-iLを用いて増幅し、約6 kbのDNA断片を得た。コード領域中にI-SceI切断部位を持つ3’ ΔpyrGを作製するための基本ユニットをプライマーP-UおよびP-Lを用いて増幅し、約3 kbのDNA断片を得た。これらの断片を精製した後、In-fusion cloning kit（Takara社）を用いて処理し、ベクターp166-d3pyrG-Iを得た。
続いて166-locusへ3’ΔpyrGを組込むためのベクターを作製した。A.oryzae RIB40株のゲノムDNAを鋳型とし、primer 166-Uおよび166-Lを用いてPCRを行い、166-locus近傍を含む3 kbのDNA断片を得た。得られた断片を精製し、TOPO-TA cloning kit（invitrogen社）を用いてクローニングした。得られたプラスミドを鋳型とし、プライマー166-iUと166-iLを用いて増幅し、約6 kbのDNA断片を得た。コード領域中にI-SceI切断部位を持つ3’ ΔpyrGを作製するための基本ユニットをプライマーP-UおよびP-Lを用いて増幅し、約3 kbのDNA断片を得た。これらの断片を精製した後、In-fusion cloning kit（Takara社）を用いて処理し、ベクターp166-d3pyrG-Iを得た。
重複転座用の親株の作製
続いてこれらのベクターをA.oryzae染色体上のB-locusおよび166-locusへ組込み、染色体の重複転座用の親株を作製した。まず、A.oryzae RIB40のpyrG欠失株であるA.oryzae RP-1株に対し、pB-d5pyrGをプライマーB-UおよびB-Lを用いて増幅した断片で形質転換を行った。再生培地上で得られた形質転換体に対し、プライマーB-OUおよびB-OLを用いてスクリーニングを行い、B-locusにベクターが組込まれた株を得た。この株より分生子を回収し、5FOA-CZプレートに塗布した後、３０℃で一週間程度培養し、十分に分生子を着生した耐性株からDNAを抽出し、プライマーB-OUおよびB-OLを用いてPCRを行うことにより、pyrGの5’側の欠失を確認するとともに最小培地で生育しないことを確認し、B-locusに5’ΔpyrGが組込まれた株（AO-B-d5pyrG株）を得た。続いて、得られた株の４番染色体の166-locusに3’ΔpyrGの組込むことを試みた。3’ΔpyrG組込み用のベクターp166d3pyrGをプライマー166Uおよび166Lを用いて増幅し、得られた断片を用いてAO-B-d5pyrG株に対し、形質転換を行った。最小培地上で再生した形質転換体からゲノムDNAを抽出し、プライマー166-OUおよび166-OLを用いてPCRを行い、166-locusにベクターが組込まれた株を得た。得られた株から分生子を回収し、5FOA-CZプレートに塗布した後、３０℃で一週間程度培養し、十分に分生子を着生した耐性株を得た。得られた耐性株からDNAを抽出し、プライマー166-OUおよび166-OLを用いてPCRを行うことにより、pyrGの3’側の欠失を確認し、なおかつこの部分に新たにI-SceIによる切断認識部位が組込まれていることを確認した。最小培地で生育しないことを確認し、最終的に２番染色体B-locusに5’ΔpyrGが組込まれ、４番染色体166-locusに3’ΔpyrGが組込まれ、重複転座用の親株（AO-BN43株）を得た。
続いてこれらのベクターをA.oryzae染色体上のB-locusおよび166-locusへ組込み、染色体の重複転座用の親株を作製した。まず、A.oryzae RIB40のpyrG欠失株であるA.oryzae RP-1株に対し、pB-d5pyrGをプライマーB-UおよびB-Lを用いて増幅した断片で形質転換を行った。再生培地上で得られた形質転換体に対し、プライマーB-OUおよびB-OLを用いてスクリーニングを行い、B-locusにベクターが組込まれた株を得た。この株より分生子を回収し、5FOA-CZプレートに塗布した後、３０℃で一週間程度培養し、十分に分生子を着生した耐性株からDNAを抽出し、プライマーB-OUおよびB-OLを用いてPCRを行うことにより、pyrGの5’側の欠失を確認するとともに最小培地で生育しないことを確認し、B-locusに5’ΔpyrGが組込まれた株（AO-B-d5pyrG株）を得た。続いて、得られた株の４番染色体の166-locusに3’ΔpyrGの組込むことを試みた。3’ΔpyrG組込み用のベクターp166d3pyrGをプライマー166Uおよび166Lを用いて増幅し、得られた断片を用いてAO-B-d5pyrG株に対し、形質転換を行った。最小培地上で再生した形質転換体からゲノムDNAを抽出し、プライマー166-OUおよび166-OLを用いてPCRを行い、166-locusにベクターが組込まれた株を得た。得られた株から分生子を回収し、5FOA-CZプレートに塗布した後、３０℃で一週間程度培養し、十分に分生子を着生した耐性株を得た。得られた耐性株からDNAを抽出し、プライマー166-OUおよび166-OLを用いてPCRを行うことにより、pyrGの3’側の欠失を確認し、なおかつこの部分に新たにI-SceIによる切断認識部位が組込まれていることを確認した。最小培地で生育しないことを確認し、最終的に２番染色体B-locusに5’ΔpyrGが組込まれ、４番染色体166-locusに3’ΔpyrGが組込まれ、重複転座用の親株（AO-BN43株）を得た。
部位特異的切断による染色体重複転座株の作製
部位特異的切断による染色体重複転座株の作製は、以下の通りに行った。重複転座用の親株の分生子をポリペプトンデキストリン液体培地に接種し30℃で14時間培養した。形質転換と同様の方法でプロトプラストを調製し、I-SceIで処理後（方法の項参照）、1.2 MソルビトールCZプレート上に重層し、30℃で約一週間静置培養した。その結果、再生株として１株（BN1-1株）が得られた。重複転座用の親株はウリジン要求性であるため、そのままでは生育出来ないが、I-SceIにより切断された4番染色体の3’ΔpyrGが２番染色体の5’ΔpyrGによって修復されることにより、完全型pyrGとして相補されることが期待される。
部位特異的切断による染色体重複転座株の作製は、以下の通りに行った。重複転座用の親株の分生子をポリペプトンデキストリン液体培地に接種し30℃で14時間培養した。形質転換と同様の方法でプロトプラストを調製し、I-SceIで処理後（方法の項参照）、1.2 MソルビトールCZプレート上に重層し、30℃で約一週間静置培養した。その結果、再生株として１株（BN1-1株）が得られた。重複転座用の親株はウリジン要求性であるため、そのままでは生育出来ないが、I-SceIにより切断された4番染色体の3’ΔpyrGが２番染色体の5’ΔpyrGによって修復されることにより、完全型pyrGとして相補されることが期待される。
PCRを用いた染色体の重複転座株の確認
続いて、得られた重複転座候補株に対し、PCRを用いて染色体上の狙った位置で重複転座が起きているかどうかを確認した。使用したプライマーの配列を表２に示す。図９に示すように、２番染色体上の転座境界領域および４番染色体上の転座境界領域の両隣接領域にプライマーを組合せ、PCR産物が増幅されるか否かにより、重複転座の有無を確認できる。転座が起きる前の状態では２番染色体上の5‘ΔpyrG の両サイドに配置したプライマーB-U＆B-Lの組合せ（１）、および４番染色体上の3’ΔpyrGの両サイドに配置したプライマーct166-U＆ct166-Lの組合せ（２）、それぞれで、約5-kbのバンドの増幅が見られる。これに対し、相互転座が起きた場合には、プライマーB-U＆ct166-Lの組合せ（３）、およびプライマーct166-U＆B-Lの組合せ（４）でバンドが増幅する。一方、重複転座が起きた場合にはプライマーB-U＆B-Lの組合せ（１）、およびプライマーct166-U＆B-Lの組合せ（４）でバンドが増幅されると考えられる。そこで今回得られた重複転座の候補株であるBN1-1株よりゲノムDNAを調製し、PCRを行った。その結果、BN1-1株ではプライマーB-U＆B-Lの組合せ（１）、およびプライマーct166-U＆B-Lの組合せ（４）でバンドが増幅され、プライマーct166-U＆ct166-Lの組合せ（２）およびプライマーB-U＆ct166-Lの組合せ（３）ではバンドが検出されなかった。このことから、BN1-1株では、染色体上の狙った領域で重複転座が起きていることが示された（図９左下、電気泳動図）。
続いて、得られた重複転座候補株に対し、PCRを用いて染色体上の狙った位置で重複転座が起きているかどうかを確認した。使用したプライマーの配列を表２に示す。図９に示すように、２番染色体上の転座境界領域および４番染色体上の転座境界領域の両隣接領域にプライマーを組合せ、PCR産物が増幅されるか否かにより、重複転座の有無を確認できる。転座が起きる前の状態では２番染色体上の5‘ΔpyrG の両サイドに配置したプライマーB-U＆B-Lの組合せ（１）、および４番染色体上の3’ΔpyrGの両サイドに配置したプライマーct166-U＆ct166-Lの組合せ（２）、それぞれで、約5-kbのバンドの増幅が見られる。これに対し、相互転座が起きた場合には、プライマーB-U＆ct166-Lの組合せ（３）、およびプライマーct166-U＆B-Lの組合せ（４）でバンドが増幅する。一方、重複転座が起きた場合にはプライマーB-U＆B-Lの組合せ（１）、およびプライマーct166-U＆B-Lの組合せ（４）でバンドが増幅されると考えられる。そこで今回得られた重複転座の候補株であるBN1-1株よりゲノムDNAを調製し、PCRを行った。その結果、BN1-1株ではプライマーB-U＆B-Lの組合せ（１）、およびプライマーct166-U＆B-Lの組合せ（４）でバンドが増幅され、プライマーct166-U＆ct166-Lの組合せ（２）およびプライマーB-U＆ct166-Lの組合せ（３）ではバンドが検出されなかった。このことから、BN1-1株では、染色体上の狙った領域で重複転座が起きていることが示された（図９左下、電気泳動図）。
リアルタイムPCRによるコピー数の確認
続いてリアルタイムPCR（定量PCR）を用いて２番染色体の重複領域における各遺伝子のコピー数をコントロール株（Wt：RIB40株）および染色体重複転座株（BN1-1株）で比較した（図１０および図１１）。実験では他の染色体に存在し、コピー数が１であるrad52をノーマライザーとして使用し、２番染色体の重複転座領域内のセントロメア側の端に位置するB1036遺伝子（Alp）とそこからテロメア側に490 kb離れた位置に存在するB1212(prtT)遺伝子およびさらにテロメア側に位置するB1440遺伝子とB1555遺伝子、および転座した先の４番染色体上の領域に位置するD0024遺伝子およびD0123遺伝子（図３参照）、さらに重複転座領域全く別の染色体である８番染色体に位置するH19遺伝子をターゲットとして、SYBR Greenを用いた相対的定量法により、親株におけるコピー数との比較を行った。図１０および図１１に各遺伝子のコピー数のコントロール株（Wt:RIB40株）に対する相対値を示す。その結果、２番染色体の重複転座領域内に位置するB1036（Alp）遺伝子、B1212(prtT)遺伝子、B1440遺伝子、B1555遺伝子のコピー数はいずれも染色体重複転座株（BN1-1株）ではコントロール株に比較して約2倍の値に増幅していた。一方、重複転座した先の４番染色体に上に位置するD0024遺伝子およびD0123遺伝子は染色体重複株（BN1-1株）では消失していることが判明した（図１０および図１１）。また重複転座領域とは別の８番染色体に位置するH19遺伝子のコピー数は１で変化がなかった。
続いてリアルタイムPCR（定量PCR）を用いて２番染色体の重複領域における各遺伝子のコピー数をコントロール株（Wt：RIB40株）および染色体重複転座株（BN1-1株）で比較した（図１０および図１１）。実験では他の染色体に存在し、コピー数が１であるrad52をノーマライザーとして使用し、２番染色体の重複転座領域内のセントロメア側の端に位置するB1036遺伝子（Alp）とそこからテロメア側に490 kb離れた位置に存在するB1212(prtT)遺伝子およびさらにテロメア側に位置するB1440遺伝子とB1555遺伝子、および転座した先の４番染色体上の領域に位置するD0024遺伝子およびD0123遺伝子（図３参照）、さらに重複転座領域全く別の染色体である８番染色体に位置するH19遺伝子をターゲットとして、SYBR Greenを用いた相対的定量法により、親株におけるコピー数との比較を行った。図１０および図１１に各遺伝子のコピー数のコントロール株（Wt:RIB40株）に対する相対値を示す。その結果、２番染色体の重複転座領域内に位置するB1036（Alp）遺伝子、B1212(prtT)遺伝子、B1440遺伝子、B1555遺伝子のコピー数はいずれも染色体重複転座株（BN1-1株）ではコントロール株に比較して約2倍の値に増幅していた。一方、重複転座した先の４番染色体に上に位置するD0024遺伝子およびD0123遺伝子は染色体重複株（BN1-1株）では消失していることが判明した（図１０および図１１）。また重複転座領域とは別の８番染色体に位置するH19遺伝子のコピー数は１で変化がなかった。
プロテアーゼ活性測定の結果
実施例１と同様に、染色体重複を持たないコントロール株（Ct株）と重複株とで比較を行なった。その結果を表５に示す。プロテアーゼ活性については、コントロール株（Ct株）の活性に対し、染色体重複転座株（BN1-1株）では約2.5倍程度に活性値が上昇していた。
実施例１と同様に、染色体重複を持たないコントロール株（Ct株）と重複株とで比較を行なった。その結果を表５に示す。プロテアーゼ活性については、コントロール株（Ct株）の活性に対し、染色体重複転座株（BN1-1株）では約2.5倍程度に活性値が上昇していた。
α‐アミラーゼ活性測定の結果
続いてα‐アミラーゼ活性についても同一の酵素液を用いて測定を行なった。その結果を表６に示す。その結果、コントロール株（Ct株）の活性値に対し、染色体重複転座株（BN1-1株）での活性値は約1.5倍程度に上昇していることが明らかとなった。
続いてα‐アミラーゼ活性についても同一の酵素液を用いて測定を行なった。その結果を表６に示す。その結果、コントロール株（Ct株）の活性値に対し、染色体重複転座株（BN1-1株）での活性値は約1.5倍程度に上昇していることが明らかとなった。
本発明で得られた染色体重複転座株（BN1-1株）を解析した結果、PCRおよびリアルタイムPCR（定量PCR）およびフスマ培養における活性測定の、いずれの結果においても、２番染色体のアルカリプロテアーゼ遺伝子（alp）およびamyR、prtTを含む部分（SC003領域のAO090003001035〜AO090003001556の各ORFの領域に対応する1380 kbの領域（図３、斜線部））が、４番染色体（SC166領域のAO090166000009とAO090166000010の境界領域（166 locus）からテロメア側）に重複転座し、そのことにより各遺伝子のコピー数が増えていることを示すデータが得られた。
以上の結果から、本発明で確立した方法により、麹菌の染色体上の任意の領域を広範囲に亘って重複転座させることができることが示された。
本発明による製造方法を使用することにより、育種の対象である菌株のゲノム情報を利用して実用上有用であると考えられる染色体の領域を特定し、その染色体領域を狙って重複させた菌株を作製することが可能となり、効率的に分子育種が進められると考えられる。更に、従来知られていなかった全く新たな有用な形質が強化された麹菌が得られるものと期待される。
Claims (15)
- アスペルギルス属に属する菌において、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域のセントロメア側の外側にコード領域の５’ 末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が該遺伝子の５’末端がセントロメア側に位置するように組み込まれ、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域のセントロメア側の外側にコード領域の３’ 末端の一部が欠損した該形質転換マーカー遺伝子が該遺伝子の５’末端がセントロメア側に位置するように組み込まれていることを特徴とする、形質転換体。
- アスペルギルス属に属する菌において、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域のセントロメア側の外側にコード領域の３’ 末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が該遺伝子の３’末端がセントロメア側に位置するように組み込まれ、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域のセントロメア側の外側にコード領域の５’ 末端の一部が欠損した該形質転換マーカー遺伝子がその３’末端がセントロメア側に位置するように組み込まれていることを特徴とする、形質転換体。
- コード領域の５’又は３’末端の一部が欠損した２つの形質転換マーカー遺伝子に共通して存在する該遺伝子のコード領域の中間部分が１００ｂp〜２ｋｂの塩基を有する、請求項１又は２に記載の形質転換体。
- 形質転換マーカー遺伝子が、pyrG、sC及びniaDから成る群から選択される、請求項１ないし３のいずれか一項に形質転換体。
- 形質転換マーカー遺伝子のいずれか一方又はその両方のコード領域の中間部分に存在する相同配列領域に予め制限酵素認識部位が導入されている、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の形質転換体。
- 制限酵素がI-sceI、I-ceuI、PI-pspI及びPI-sceIから成る群から選択される、請求項５記載の形質転換体。
- 制限酵素認識部位が相同組換えによって導入されたものである、請求項５又は６に記載の形質転換体。
- アスペルギルス属に属する菌がアスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼである、請求項１ないし７のいずれかに記載の形質転換体。
- アスペルギルス属に属する菌の染色体上の任意の領域を重複転座させる方法であって、
（１）請求項１ないし８のいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、
（２）２つの異なる染色体に組み込まれた夫々の形質転換マーカー遺伝子のコード領域の中間部分に共通して存在する相同配列領域間における二重鎖切断時の修復機構を介した、該形質転換体における２つの異なる染色体の間での相同組換えによって、該ターゲット領域が重複転座された菌株を得、
（３）上記の相同組換えによってコード領域の完全長が構築された該形質転換マーカー遺伝子に基づく形質によって、該ターゲット領域が重複された菌株を選択することから成る、前記方法。 - 形質転換体が多核の状態にあることを特徴とする、請求項９記載の方法。
- 形質転換体に紫外線照射することによって、２つの異なる染色体の間での相同組換えを促進させることを特徴とする、請求項９又は１０記載の方法。
- 制限酵素の作用下に形質転換体を培養して相同組換えを生起させる、請求項９ないし１１のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法で得られた、染色体上に重複転座領域を有するアスペルギルス属に属する菌。
- アスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼである、請求項１３記載のアスペルギルス属に属する菌。
- 重複転座領域が千ｋｂ以上である、請求項１３又は１４記載のアスペルギルス属に属する菌。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2013052795A JP6081245B2 (ja) | 2012-04-07 | 2013-03-15 | 麹菌染色体における任意領域の重複転座の作製方法 |
| EP13162003.1A EP2647714B1 (en) | 2012-04-07 | 2013-04-02 | Method for production of duplicated translocation of optional region in Aspergillus chromosome |
| DK13162003.1T DK2647714T3 (en) | 2012-04-07 | 2013-04-02 | PROCEDURE FOR PREPARING DUPLICATED TRANSLOCATION OF AN OPTIONAL REGION IN ASPERGILLUS CHROMOSOMES |
| US13/856,763 US9562234B2 (en) | 2012-04-07 | 2013-04-04 | Method for the production of duplication and translocation of any region in the chromosome of aspergillus |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012087987 | 2012-04-07 | ||
| JP2012087987 | 2012-04-07 | ||
| JP2013052795A JP6081245B2 (ja) | 2012-04-07 | 2013-03-15 | 麹菌染色体における任意領域の重複転座の作製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2013230141A JP2013230141A (ja) | 2013-11-14 |
| JP6081245B2 true JP6081245B2 (ja) | 2017-02-15 |
Family
ID=48536677
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2013052795A Active JP6081245B2 (ja) | 2012-04-07 | 2013-03-15 | 麹菌染色体における任意領域の重複転座の作製方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9562234B2 (ja) |
| EP (1) | EP2647714B1 (ja) |
| JP (1) | JP6081245B2 (ja) |
| DK (1) | DK2647714T3 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103937766B (zh) * | 2014-04-25 | 2017-02-01 | 南京百斯杰生物工程有限公司 | 一段重组基因及提高黑曲霉表达糖化酶的方法 |
| WO2016050917A1 (en) * | 2014-10-01 | 2016-04-07 | Dsm Ip Assets B.V. | Methods for genomic modification |
| EP4123026A1 (en) * | 2020-02-14 | 2023-01-25 | Public University Corporation Yokohama City University | Nucleic acid construct, and therapeutic or diagnostic agent for mismatch repair deficient cancers comprising nucleic acid construct |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69734936T2 (de) * | 1996-09-19 | 2006-08-24 | Novozymes A/S | Wirtszellen und methoden für die produktion von proteinen |
| BR9807941A (pt) * | 1997-04-07 | 2000-02-22 | Unilever Nv | Processos para a produção e para cultivar um bolor transformado, e, bolor transformado |
| US7935862B2 (en) * | 2003-12-02 | 2011-05-03 | Syngenta Participations Ag | Targeted integration and stacking of DNA through homologous recombination |
| JP4625318B2 (ja) | 2004-12-06 | 2011-02-02 | 財団法人野田産業科学研究所 | 相同組換え頻度が上昇した形質転換菌 |
| JP2009095279A (ja) * | 2007-10-17 | 2009-05-07 | Kikkoman Corp | 麹菌、その育種法及び醤油の製造法 |
| JP4469014B1 (ja) * | 2009-04-17 | 2010-05-26 | キッコーマン株式会社 | 大規模ゲノム重複を保持する麹菌 |
| EP2584031B1 (en) * | 2010-06-17 | 2015-09-23 | Kikkoman Corporation | Production method for large region duplication in aspergillus chromosome |
-
2013
- 2013-03-15 JP JP2013052795A patent/JP6081245B2/ja active Active
- 2013-04-02 DK DK13162003.1T patent/DK2647714T3/en active
- 2013-04-02 EP EP13162003.1A patent/EP2647714B1/en active Active
- 2013-04-04 US US13/856,763 patent/US9562234B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US9562234B2 (en) | 2017-02-07 |
| EP2647714A3 (en) | 2013-10-23 |
| US20130316065A1 (en) | 2013-11-28 |
| EP2647714A2 (en) | 2013-10-09 |
| DK2647714T3 (en) | 2017-04-10 |
| JP2013230141A (ja) | 2013-11-14 |
| EP2647714B1 (en) | 2017-03-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6855543B2 (ja) | 植物プロトプラストからゲノム編集植物体を高効率で製造する方法 | |
| Nielsen et al. | Efficient PCR-based gene targeting with a recyclable marker for Aspergillus nidulans | |
| US20170088845A1 (en) | Vectors and methods for fungal genome engineering by crispr-cas9 | |
| JP2017522897A (ja) | Ｒｎａ誘導型エンドヌクレアーゼを用いた非従来型酵母における遺伝的ターゲティング | |
| JP2005296019A (ja) | 選択マーカー遺伝子を含まない組換え体株、その作製方法及びその株の使用 | |
| JP2007222055A (ja) | 染色体領域欠失株の作製方法 | |
| US20200040330A1 (en) | Method for editing filamentous fungal genome through direct introduction of genome-editing protein | |
| JP6081245B2 (ja) | 麹菌染色体における任意領域の重複転座の作製方法 | |
| JP5836946B2 (ja) | 麹菌染色体における大領域重複の作製方法 | |
| JP6990111B2 (ja) | 変異糸状菌の製造方法 | |
| WO2010087344A1 (ja) | シゾサッカロミセス・ポンベの形質転換方法および形質転換体、ならびに異種蛋白質の製造方法 | |
| WO2013021811A1 (ja) | 重複ゲノム領域を有する菌 | |
| CN108913611B (zh) | 基因元件及其在酿酒酵母染色体数目、拷贝数、结构变异中的应用 | |
| JP5367300B2 (ja) | 麹菌の分生子形成に関与する遺伝子、及び、麹菌の分生子形成能を増大させる方法 | |
| CN108949600B (zh) | 基因的缺失及其应用，缺失该基因的菌株及其在提高微生物次级代谢产物的产量中的应用 | |
| JP7358105B2 (ja) | アスペルギルス属糸状菌のピリチアミン耐性変異株 | |
| JP2007089441A (ja) | 酵母キャンディダ・ユティリスの形質転換法 | |
| Zhang et al. | An efficient method for constructing a random insertional mutant library for forward genetics in Nannochloropsis oceanica | |
| JP2008263927A (ja) | 染色体大領域の欠失方法 | |
| JPWO2017135316A1 (ja) | 変異リゾプス属菌 | |
| JP2009195205A (ja) | イオンビーム照射を用いた糸状菌の変異株作出方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20151021 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160809 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160906 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170117 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170118 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6081245 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |