JP6990111B2 - 変異糸状菌の製造方法 - Google Patents
変異糸状菌の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6990111B2 JP6990111B2 JP2017565597A JP2017565597A JP6990111B2 JP 6990111 B2 JP6990111 B2 JP 6990111B2 JP 2017565597 A JP2017565597 A JP 2017565597A JP 2017565597 A JP2017565597 A JP 2017565597A JP 6990111 B2 JP6990111 B2 JP 6990111B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- seq
- less
- gene
- kbp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
(非特許文献2)Int J Mol Sci,2015,16:21128-21137
(非特許文献3)PNAS, 2013, 110(10):3782-87
(非特許文献4)Nature Commun,2016,20,doi:10.1038/ncomms10431
(非特許文献5)Mol Genet Genomics,2004,271(4):499-510
(非特許文献6)Mol Genet Genomics,2005,274(4):373-383
(非特許文献7)Mol Microbiol,2010,77(3):587-604
10bp以上50kbp以下、10bp以上20kbp以下、10bp以上12kbp以下、10bp以上11kbp以下、20bp以上50kbp以下、20bp以上20kbp以下、20bp以上12kbp以下、20bp以上11kbp以下、30bp以上50kbp以下、30bp以上20kbp以下、30bp以上12kbp以下、30bp以上11kbp以下、40bp以上50kbp以下、40bp以上20kbp以下、40bp以上12kbp以下、40bp以上11kbp以下、50bp以上50kbp以下、50bp以上20kbp以下、50bp以上12kbp以下、50bp以上11kbp以下、60bp以上50kbp以下、60bp以上20kbp以下、60bp以上12kbp以下、60bp以上11kbp以下、70bp以上50kbp以下、70bp以上20kbp以下、70bp以上12kbp以下、70bp以上11kbp以下、80bp以上50kbp以下、80bp以上20kbp以下、80bp以上12kbp以下、80bp以上11kbp以下、90bp以上50kbp以下、90bp以上20kbp以下、90bp以上12kbp以下、90bp以上11kbp以下、100bp以上50kbp以下、100bp以上20kbp以下、100bp以上12kbp以下、100bp以上11kbp以下、200bp以上50kbp以下、200bp以上20kbp以下、200bp以上12kbp以下、200bp以上11kbp以下、500bp以上50kbp以下、500bp以上20kbp以下、500bp以上12kbp以下、500bp以上11kbp以下、1000bp以上50kbp以下、1000bp以上20kbp以下、1000bp以上12kbp以下、1000bp以上11kbp以下、1500bp以上50kbp以下、1500bp以上20kbp以下、1500bp以上12kbp以下、1500bp以上11kbp以下、2000bp以上50kbp以下、2000bp以上20kbp以下、2000bp以上12kbp以下、又は2000bp以上11kbp以下である、
〔1〕記載の方法。
好ましくは1bp以上50kbp以下、0.3kbp以上50kbp以下、1kbp以上50kbp以下、又は3kbp以上50kbp以下であり、
より好ましくは1bp以上20kbp以下、0.3kbp以上20kbp以下、1kbp以上20kbp以下、又は3kbp以上20kbp以下であり、
さらに好ましくは1bp以上10kbp以下、0.3kbp以上10kbp以下、1kbp以上10kbp以下、又は3kbp以上10kbp以下であり、
さらに好ましくは1bp以上9kbp以下、0.3kbp以上9kbp以下、1kbp以上9kbp以下、又は3kbp以上9kbp以下であり、
さらに好ましくは1bp以上5kbp以下、0.3kbp以上5kbp以下、1kbp以上5kbp以下、又は3kbp以上5kbp以下である、
〔5〕記載の方法。
好ましくは、TALEN、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1又はZFN技術に基づく人工DNAヌクレアーゼであり、
より好ましくはTALENである、
〔1〕~〔7〕のいずれか1項記載の方法。
好ましくは、接合菌門、子嚢菌門、又は担子菌門に属する菌であり、
より好ましくは、接合菌門、又は子嚢菌門に属する菌であり、
さらにより好ましくは接合菌門に属する菌である、
〔1〕~〔8〕のいずれか1項記載の方法。
好ましくは、糸状菌に由来するエキソヌクレアーゼであり、
より好ましくはリゾプス属菌由来エキソヌクレアーゼであり、
さらに好ましくは、Rhizopus oryzae又はRhizopus delemar由来のエキソヌクレアーゼである、
〔12〕記載の方法。
(1)トリプトファン栄養要求性株の作製
Rhizopus delemar JCM(Japan Collection of Microorganisms/理研)5557株(以降、5557株と表記)、又は5557株由来のトリプトファン栄養要求性株を、相同組換え体の親株として用いた。トリプトファン栄養要求性株は、5557株へのイオンビーム照射による変異導入株の中から選抜し取得した。イオンビーム照射は、独立行政法人日本原子力研究開発機構・高崎量子応用研究所のイオン照射施設(TIARA)において行った。照射は、AVFサイクロトロンを用いて12C5+を加速し、220MeVのエネルギーで100~1250Gray照射した。照射した菌体より胞子を回収し、その中から、trpC遺伝子領域に1塩基欠損変異を有し、トリプトファン栄養要求性を示すRhizopus delemar 02T6株を取得した。以降の実施例では、リゾプス属菌相同組換え体作製のための親株として5557株又は02T6株を用いた。
5557株のゲノムDNAを鋳型に、プライマーoJK162(配列番号10)及びoJK163(配列番号11)を用いたPCRにてtrpC遺伝子のDNA断片を合成した。次に、プラスミドpUC18を鋳型に、プライマーoJK164(配列番号12)及びoJK165(配列番号13)を用いたPCRにてDNA断片を増幅した。以上の2断片をIn-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)を用いて連結しプラスミドpUC18-trpCを作製した。
pdc1、pdc2又はtrpC遺伝子座を標的として、TALENを作製した。TALENの作製は、pdc1遺伝子座を標的とするものはTransposagen Biopharmaceuticals社に、pdc2又はtrpC遺伝子座を標的とするものはLife technologies社に依頼し、Custom XTN TALEN(Transposagen Biopharmaceuticals社が提供するTALENの商品名)又はGeneArt Precision TALs(Life Technologies社が提供するTALENの商品名)を得た。これらキットは、それぞれの標的遺伝子に対し、Left-TALEN及びRight-TALENの2つのポリヌクレオチドを含む。pdc1遺伝子(配列番号1)を標的とするキットは、LeftTALEN-pdc1(配列番号2)及びRightTALEN-pdc1(配列番号3)を含み、これらはそれぞれ、pdc1遺伝子のセンス鎖中の5’-TGCCTGCTATTAAAATCG-3’(配列番号96)及びアンチセンス鎖中の5’-TTGATTTCCTTAAGACGG-3’(配列番号97)の配列を標的とするTALENをコードする。また、pdc2遺伝子(配列番号4)を標的とするキットは、LeftTALEN-pdc2(配列番号5)及びRightTALEN-pdc2(配列番号6)を含み、これらはそれぞれ、pdc2遺伝子のセンス鎖中の5’-TGGTGTTGCTGGTTCTTAT-3’(配列番号98)及びアンチセンス鎖中の5’-TGCCGACAATGTGAATCAC-3’(配列番号99)の配列を標的とするTALENをコードする。また、trpC遺伝子(配列番号7)を標的とするキットは、LeftTALEN-trpC(配列番号8)及びRightTALEN-trpC(配列番号9)を含み、これらはそれぞれ、trpC遺伝子のセンス鎖中の5’-TGCCAAGGCGCCAATGTAG-3’(配列番号100)及びアンチセンス鎖中の5’-TCGGAAATGGTGATTTTGT-3’(配列番号101)の配列を標的とするTALENをコードする。
プラスミドpUC18(タカラバイオ)を鋳型に、プライマーpPTR1-sal1-F(配列番号28)及びpPTR1-sal1-R(配列番号29)を用いたPCRにてpUC18ベクター断片を増幅した。また、Rhizopus oryzae NRBC5384株(以下、5384株と表記)の精製ゲノム溶液を鋳型に、プライマーsal1-ldhpro-F3(配列番号30)及びldhpro-R(配列番号31)を用いてldhプロモーター断片を、プライマーldhpro-exo1-F2(配列番号32)及びexo1-pdcter-R2(配列番号33)を用いてエキソヌクレアーゼ遺伝子断片を、及びプライマーpdcTer-F(配列番号34)及びpdcTer-sal1-R(配列番号35)を用いてpdcターミネーター断片を、それぞれ増幅した。増幅した上記4断片を、In-Fusion HD cloning kit(clontech社)にて連結し、プラスミドpldh-exo1を作製した。
また、5384株の精製ゲノム溶液を鋳型に、プライマーadhpro-exo1-F(配列番号36)及びexo1-adhter-R(配列番号37)を用いてエキソヌクレアーゼ遺伝子断片を、pUC18-trpC-Padh-Tadhを鋳型に、プライマーadhpro-R(配列番号22)及びadhter-F(配列番号23)を用いたPCRにてベクター断片を、それぞれ増幅した。増幅した上記2断片を、In-Fusion HD cloning kit(clontech社)にて連結し、プラスミドpadh-exo1を作製した。
pdc1遺伝子座に対してpdc1遺伝子ORFを除き、trpC遺伝子領域をknock-inするための、プラスミドptrpC-knock-in(pdc1)を作製した。すなわち、pUC18を鋳型にプライマーpUC18-Pae1-F3(配列番号38)及びpUC18-Hind3-R3(配列番号39)にて増幅したpUC18ベクター断片と、5557株のゲノムを鋳型にプライマーPDC1-upstr-F(配列番号40)及びPDC1-upstr-R(配列番号41)にて増幅したpdc1遺伝子のプロモーター部位断片と、5557株のゲノムを鋳型にプライマーtrpCpro-R(配列番号42)及びtrpCter-F(配列番号43)にて増幅したtrpC遺伝子領域断片と、5557株のゲノムを鋳型にプライマーPDC1-downstr-F(配列番号44)及びPDC1-downstr-R(配列番号45)にて増幅したpdc1遺伝子のターミネーター部位断片をIn-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)を用いて連結し、ptrpC-knock-in(pdc1)を構築した。
プラスミドptrpC-knock-in(pdc1)のtrpC配列の5’側にadh1プロモーター及びFT1遺伝子を導入したプラスミドである、p(trpC+FT1)-knock-in(pdc1)を作製した。すなわち、ptrpC-knock-in(pdc1)を鋳型にプライマーtrpCpro-R(配列番号42)及びpdc1ter-F(配列番号52)にて増幅したベクター断片と、FT1プラスミド(pUC18-trpC-Padh-Tadhのadh1プロモーターの下流側にFT1遺伝子(配列番号102)を導入したプラスミド)を鋳型にプライマーtrpC-adh1pro-F(配列番号53)及びFT1-pdc1Ter-R(配列番号54)にて増幅したadh1プロモーターとFT1遺伝子を含む断片をIn-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)を用いて連結し、p(trpC+FT1)-knock-in(pdc1)を構築した。
(6)と同様に、p(trpC+PYC)-knock-in(pdc1)を作製した。すなわち、ptrpC-knock-in(pdc1)を鋳型にプライマーtrpCpro-R(配列番号42)及びpdc1ter-F(配列番号52)にて増幅したベクター断片と、PYCプラスミド(pUC18-trpC-Padh-Tadhのadh1プロモーターの下流側にPYC遺伝子(配列番号103)を導入したプラスミド)を鋳型にプライマーtrpC-adh1pro-F(配列番号53)及びPYC-pdc1Ter-R(配列番号55)にて増幅したadh1プロモーターとPYC遺伝子を含む断片をIn-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)を用いて連結し、p(trpC+PYC)-knock-in(pdc1)を構築した。
表7のNo.1に従い、二本鎖DNAを調製した。すなわち、プラスミドptrpC-knock-in(pdc1)を鋳型にプライマーPDC1-upstr-F2(配列番号56)及びPDC1-downstr-R2(配列番号57)を用いてDNA断片を増幅し、鋳型をDpn1(TOYOBO)処理にて分解した。続いて生成物をフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール処理、及びエタノール沈殿処理して精製し、精製物を適量のDNase free waterに溶解し、pdc1遺伝子破壊用の二本鎖DNA溶液を得た。
表7のNo.2~No.20に従い、一本鎖DNAを調製した。すなわち、表7の各条件のテンプレートを鋳型に、プライマー1及びプライマー2を用いて、表7の挿入長の長さを有するDNA断片を増幅し、鋳型をDpn1(TOYOBO)処理にて分解した。続いて生成物をフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール処理、及びエタノール沈殿処理して精製した。精製物を、さらにLambda Exonuclease(NEW ENGLAND BioLabs)を用いて処理した後、上記と同様に精製し、一本鎖DNAを得た。Lambda Exonuclease処理は、37℃、オーバーナイトで行った。
上記(8)又は(9)で作製した一本鎖DNA又は二本鎖DNA(表7のNo.1~20)を、上記(3)で作製したLeftTALEN発現ベクター及びRightTALEN発現ベクター、ならびに上記(4)で作製したエキソヌクレアーゼ発現ベクターと混合し、DNA溶液を調製した。
TALEN発現ベクターは、No.1とNo.2にはpadh-LeftTALEN-pdc1及びpadh-RightTALEN-pdc1を、No.3~18にはpadh-LeftTALEN-pdc1-2及びpadh-RightTALEN-pdc1を、No.19にはpadh-LeftTALEN-pdc2及びpadh-RightTALEN-pdc2を、No.20にはpadh-LeftTALEN-trpC及びpadh-RightTALEN-trpCを用いた。エキソヌクレアーゼ発現ベクターは、No.1とNo.2にはpldh-exo1を、それ以外には、padh-exo1を用いた。No.1とNo.2の条件においてのみ、遺伝子導入プラスミドを制限酵素処理した。すなわち、padh-LeftTALEN-pdc1、padh-LeftTALEN-pdc1-2及びpadh-RightTALEN-pdc1は制限酵素ScaIで、プラスミドpldh-exo1は制限酵素Pst1で処理した。DNA溶液におけるLeftTALEN発現ベクター、RightTALEN発現ベクター、エキソヌクレアーゼ発現ベクター、及び一本鎖DNA又は二本鎖DNAの濃度比は、No.1とNo.2ではおよそ2:4:2:1、No.3~20ではおよそ1:1:1:2とした。
調製したDNA溶液(約1~3μg/μL)10μLを金粒子溶液(60mg/mL、INBIO GOLD社、粒子径1μm)100μLに加え混合した。さらに0.1Mスペルミジンを40μL加え、ボルテックスでよく攪拌した。2.5MのCaCl2を100μL加え、ボルテックスで1分間攪拌した後、6000rpmで30秒間遠心し、上清を除いた。得られた沈殿に70%EtOHを200μL加え、30秒間ボルテックスで攪拌した後、6000rpmで30秒間遠心し、上清を除いた。得られた沈殿を100μLの100%EtOHで再懸濁した。
上記(10)で培養した菌体から胞子を回収し、pH3に調製した無機寒天培地(20g/Lグルコース、1g/L硫酸アンモニウム、0.6g/Lリン酸2水素カリウム、0.25g/L硫酸マグネシウム・7水和物、0.09g/L硫酸亜鉛・7水和物、15g/L寒天)で単離した。生育した菌株の菌糸を爪楊枝にて一部かき取り、10mM Tris-HCl(pH8.5)に懸濁し、95℃で10分間インキュベートした。その後、10mM Tris-HCl(pH8.5)で適宜希釈し、コロニーPCR用のゲノムテンプレート溶液とした。コロニーPCRは、上記ゲノムテンプレート溶液、プライマーpdc1-up2(配列番号58)とtrpC(d)-1(配列番号59)、及びKOD FX Neo(TOYOBO)を用いて行った。上記プライマーでコロニーPCRを行った場合、pdc1遺伝子座にtrpC遺伝子断片又はtrpC遺伝子とその他の遺伝子断片のknock-inが起こっていれば、適切な長さのDNA断片が増幅する。コロニーPCRによりDNA増幅断片が得られた菌株を、Knock-in株(pdc1遺伝子欠損株)とした。
上記(10)で培養した菌体から胞子を回収し、pH3に調製した無機寒天培地(20g/Lグルコース、1g/L硫酸アンモニウム、0.6g/Lリン酸2水素カリウム、0.25g/L硫酸マグネシウム・7水和物、0.09g/L硫酸亜鉛・7水和物、15g/L寒天)で単離した。生育した菌株の菌糸を爪楊枝にて一部かき取り、10mM Tris-HCl(pH8.5)に懸濁し、95℃で10分間インキュベートした。その後、10mM Tris-HCl(pH8.5)で適宜希釈し、コロニーPCR用のゲノムテンプレート溶液とした。コロニーPCRは、上記ゲノムテンプレート溶液、プライマーpdc2-down1(配列番号60)とtrpC(d)-7(配列番号61)、及びKOD FX Neo(TOYOBO)を用いて行った。上記プライマーでコロニーPCRを行った場合、pdc2遺伝子座にtrpC遺伝子断片のknock-inが起こっていれば、適切な長さのDNA断片が増幅する。コロニーPCRによりDNA増幅断片が得られた菌株を、Knock-in株(pdc2遺伝子欠損株)とした。
上記(10)で培養した菌体から胞子を回収し、pH6に調製した5-FAA培地(10g/Lグルコース、3.36g/L Yeast Nitrogen Base w/o amino acids、0.03g/L トリプトファン、5g/L 5-フルオロアントラニル酸、15g/L寒天)で培養した。生育した菌株は、5-FAA培地に植え継いだ。生育した菌株の菌糸を爪楊枝にて一部かき取り、10mM Tris-HCl(pH8.5)に懸濁し、95℃で10分間インキュベートした。その後、10mM Tris-HCl(pH8.5)で適宜希釈し、コロニーPCR用のゲノムテンプレート溶液とした。コロニーPCRは、上記ゲノムテンプレート溶液、プライマーpdc1-down3(配列番号62)とtrpC(d)-5(配列番号63)、及びKOD FX Neo(TOYOBO)を用いて行った。上記プライマーでコロニーPCRを行った場合、trpC遺伝子座に、500bp欠損したtrpC遺伝子断片のknock-inが起こっていれば、増幅DNA断片のバンド位置がシフトする。コロニーPCRによりDNA増幅断片のバンドがシフトした菌株を、Knock-in株(trpC遺伝子欠損株)とした。
(a)一本鎖DNA 対 二本鎖DNA
供与体DNAが二本鎖DNAの場合と一本鎖DNAの場合(表7のNo.1及びNo.2)の間で、相同組換え効率の比較を行った。結果を表8に示す。二本鎖DNAを用いた場合、長鎖配列が導入された相同組換え株を取得することはできなかったが、一本鎖DNAを用いることで、長鎖配列が導入された相同組換え株の取得に成功した。さらに、供与体DNAが一本鎖DNAの場合、最長で約8.8kbpの長鎖配列を導入した相同組換え株の取得に成功した(表7のNo.2~4)。
一本鎖DNAにおける宿主ゲノムDNAとの相同領域の鎖長が組換え効率に与える影響を検討した(表7のNo.2、8、及び9)。結果を表9に示す。
(a)プラスミドベクターの作製
上記(2)で構築したpUC18-trpC-Padh-Tadhのadh1プロモーターをcipCプロモーターに変更したプラスミドベクターを作製した。すなわち、該pUC18-trpC-Padh-Tadhを鋳型にプライマーadhter-F(配列番号23)及びtrpCter-R(配列番号104)を用いたPCRにてベクター断片を増幅し、また5557株のゲノムDNAを鋳型にプライマーtrpCter-cicCpro-F(配列番号105)及びcipCpro-adhter-R(配列番号106)を用いたPCRにてcipCプロモーター領域断片を増幅した。以上の2断片を、In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)を用いて連結してプラスミドpUC18-trpC-PcipC-Tadhを作製した。
pdc3遺伝子座を標的として、TALENを作製した。TALENの作製は、Life technologies社に依頼し、GeneArt PerfectMatch TALs(Life Technologies社が提供するTALENの商品名)を得た。このキットは、標的遺伝子に対するLeft-TALEN及びRight-TALENの2つのポリヌクレオチドを含む。pdc3遺伝子(配列番号143)を標的とするキットは、LeftTALEN-pdc3(配列番号144)及びRightTALEN-pdc3(配列番号145)を含み、これらはそれぞれ、pdc3遺伝子のセンス鎖中の5’-CCGGAATCGACACGATTTT-3’(配列番号146)及びアンチセンス鎖中の5’-CGTAACTTACCATATTGTA-3’(配列番号147)の配列を標的とするTALENをコードする。
上記(4)で作製したプラスミドpldh-exo1を鋳型に、プライマーcipCpro-exo1-F(配列番号111)及びexo1-adhter-R2(配列番号142)を用いたPCRにてエキソヌクレアーゼ遺伝子断片を、上記(15)(a)で作製したプラスミドpUC18-PcipC-Tadhを鋳型に、プライマーcipCpro-R(配列番号109)及びadhter-F(配列番号23)を用いたPCRにてベクター断片を、それぞれ増幅した。上記2断片には、15塩基ずつオーバーラップする領域が存在する。これら2断片をIn-Fusion HD cloning kit(clontech社)にて連結し、プラスミドpcipC-exo1を得た。
pdc3遺伝子座に対してpdc3遺伝子ORFを除去し、trpC遺伝子領域をknock-inするための、プラスミドptrpC-knock-in(pdc3)を作製した。すなわち、pUC18を鋳型にプライマーpUC18-Pae1-F3(配列番号38)及びpUC18-Hind3-R3(配列番号39)にて増幅したpUC18ベクター断片と、5557株のゲノムDNAを鋳型にプライマーpdc3-upstr-F(配列番号112)及びpdc3-upstr-R2(配列番号113)にて増幅したpdc3遺伝子プロモーター断片と、5557株のゲノムDNAを鋳型にプライマーpdc3-downstr-F2(配列番号114)及びpdc3-downstr-R(配列番号115)にて増幅したpdc3遺伝子ターミネーター断片を増幅した。以上3断片をIn-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)を用いて連結し、pknock-in(pdc3)を作製した。
PCRの鋳型としてプラスミドptrpC-knock-in(pdc3)を、プライマーとしてpdc3-upstr-F2(配列番号118)及びpdc3-downstr-R2-P(配列番号119、5’側はリン酸化されている)を用いた以外は、上記(9)と同様の手順で一本鎖DNAを得た。
上記(10)と同様の手順で、一本鎖DNAを含むDNA-金粒子溶液を調製し、これを用いて02T6株の胞子に対して遺伝子導入し、得られた胞子を培養した。一本鎖DNAには、上記(15)(e)で作製した一本鎖DNAを用いた。TALEN発現ベクターには、上記(15)(b)で作製したpcipC-LeftTALEN-pdc3及びpcipC-RightTALEN-pdc3を用いた。エキソヌクレアーゼ発現ベクターには上記(15)(c)で作製したpcipC-exo1を用いた。DNA溶液におけるpcipC-LeftTALEN-pdc3、pcipC-RightTALEN-pdc3、pcipC-exo1、及び一本鎖DNAの濃度比は、およそ1:1:1:2とした。
上記(11)と同様の手順で、上記(15)(f)で培養した菌体から胞子を回収し、菌株の単離及びゲノムテンプレート溶液の調製を行った。次いでこれを鋳型としたコロニーPCRによりpdc3遺伝子座にtrpC遺伝子領域断片がknock-inされたpdc3遺伝子欠損株を選択した。コロニーPCRは、上記ゲノムテンプレート溶液、プライマーpdc3-up(配列番号120)とtrpC(d)-1(配列番号59)、及びKOD FX Neo(TOYOBO)を用いて行った。上記プライマーでコロニーPCRを行った場合、pdc3遺伝子座にtrpC遺伝子領域断片のknock-inが起こっていれば、適切な長さのDNA断片が増幅する。コロニーPCRによりDNA増幅断片が得られた菌株を、Knock-in株(pdc3遺伝子欠損株)とした。
得られたpdc3遺伝子欠損株について相同組換え効率を調べた(表10)。
(1)アデニン栄養要求性株の作製
Rhizopus oryzae NRBC5384株(以下、5384株と表記)を相同組換え体の親株として用いた。アデニン栄養要求性株は、5384株の胞子へのUV照射による変異導入株の中から選抜し取得した。UV照射は、殺菌ランプGL15(日立アプライアンス)を用いて、1分間照射した。照射した胞子を回収し、その中から、ade1遺伝子領域に変異を有し、アデニン栄養要求性を示すRhizopus oryzae AM002株を取得した。以降の実施例では、Rhizopus oryzae相同組換え体作製のための親株としてRhizopus oryzae AM002株を用いた。
5384株のゲノムDNAを鋳型に、プライマーpUC18-adh1pro-F(配列番号121)及びadh1pro-pUC18-R(配列番号122)を用いたPCRにてadh1のプロモーター断片を増幅した。次に、pUC18を鋳型に、プライマーpUC18-Pae1-F3(配列番号38)及びpUC18-Hind3-R3(配列番号39)を用いたPCRにてDNA断片を増幅した。以上の2断片を、In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)を用いて連結してプラスミドpUC18-Padh(RO)を作製した。
ldhA遺伝子座を標的として、TALENを作製した。TALENの作製は、Life technologies社に依頼し、GeneArt Precision TALs(Life Technologies社が提供するTALENの商品名)を得た。このキットは、標的遺伝子に対するLeft-TALEN及びRight-TALENの2つのポリヌクレオチドを含む。ldhA遺伝子(配列番号148)を標的とするキットは、LeftTALEN-ldhA(配列番号149)及びRightTALEN-ldhA(配列番号150)を含み、これらはそれぞれ、ldhA遺伝子のセンス鎖中の5’-TGCAGATGCTGCCAGTATA-3’(配列番号151)及びアンチセンス鎖中の5’-TCCTCTGCGCTACCTGCTC-3’(配列番号152)の配列を標的とするTALENをコードする。
ldhA遺伝子座に対してldhA遺伝子ORFの一部を除去し、ade1遺伝子領域をknock-inするための、プラスミドpade1-knock-in(ldhA)を作製した。すなわち、pUC18を鋳型にプライマーpUC18-Pae1-F3(配列番号38)及びpUC18-Hind3-R3(配列番号39)にて増幅したpUC18ベクター断片と、5384株のゲノムDNAを鋳型にプライマーldhA-upstr-F(配列番号130)及びldhA-upstr-R2(配列番号131)にて増幅した、ldhA遺伝子の一部を含むldhA遺伝子プロモーター部位断片と、5384株のゲノムDNAを鋳型にプライマーldhA-downstr-F2(配列番号132)及びldhA-downstr-R(配列番号133)にて増幅したldhA遺伝子ターミネーター部位断片を増幅した。以上3断片をIn-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)を用いて連結し、pknock-in(ldhA)を作製した。
プラスミドpade1 knock-in(ldhA)を鋳型にプライマーldhA-upstr-F2(配列番号138)及びldhA-downstr-R2-P(配列番号139、5’側はリン酸化されている)を用いてDNA断片を増幅し、鋳型をDpn1(TOYOBO)処理にて分解した。続いて生成物をフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール処理、及びエタノール沈殿処理して精製し、精製物を適量のDNase free waterに溶解し、ldhA遺伝子破壊用の二本鎖DNA溶液を得た。
次いで、上記(5)で得た二本鎖DNAを、Lambda Exonuclease(NEW ENGLAND BioLabs)を用いて処理した後、上記と同様に精製し、一本鎖DNAを得た。Lambda Exonuclease処理は、37℃、オーバーナイトで行った。
実施例1の(10)と同様の手順で、一本鎖又は二本鎖DNAを含むDNA-金粒子溶液を調製し、これを用いてAM002株の胞子に対して遺伝子導入し、得られた胞子を培養した。一本鎖DNA又は二本鎖DNAには、上記(5)又は(6)で作製した一本鎖DNA又は二本鎖DNAを用いた。TALEN発現ベクターには、上記(3)で作製したpadh-LeftTALEN-ldhA(RO)及びpadh-RightTALEN-ldhA(RO)を用いた。エキソヌクレアーゼ発現ベクターには、実施例1(4)で作製したpldh-exo1を用いた。DNA溶液におけるpadh-LeftTALEN-ldhA(RO)、padh-RightTALEN-ldhA(RO)、pldh-exo1、及び一本鎖DNA又は二本鎖DNAの濃度比は、およそ1:1:1:2とした。
上記(7)で培養した菌体から胞子を回収し、実施例1の(11)と同様の手順で、菌株の単離及びゲノムテンプレート溶液の調製を行った。次いでこれを鋳型としたコロニーPCRによりldhA遺伝子座にade1遺伝子領域断片がknock-inされたldhA遺伝子欠損株を選択した。コロニーPCRは、上記ゲノムテンプレート溶液、プライマーldhA-up(配列番号140)とade1-15(配列番号141)、及びKOD FX Neo(TOYOBO)を用いて行った。上記プライマーでコロニーPCRを行った場合、ldhA遺伝子座にade1遺伝子領域断片のknock-inが起こっていれば、適切な長さのDNA断片が増幅する。コロニーPCRによりDNA増幅断片が得られた菌株を、Knock-in株(ldhA遺伝子欠損株)とした。
(a)一本鎖DNA 対 二本鎖DNA
供与体DNAが二本鎖DNAの場合と一本鎖DNAの場合の間で、相同組換え効率の比較を行った。結果を表11に示す。二本鎖DNAを用いた場合、長鎖配列が導入された相同組換え株を取得することはできなかったが、一本鎖DNAを用いることで、長鎖配列が導入された相同組換え株の取得に成功した。
Claims (7)
- 宿主リゾプス属菌に部位特異的DNAヌクレアーゼと一本鎖DNAとを導入し、該宿主リゾプス属菌のゲノムDNAにおける該部位特異的DNAヌクレアーゼによる切断部位の上流領域及び下流領域を、相同組換えによって該一本鎖DNAで置換することを含み、
該一本鎖DNAの長さが2000bp以上11kbp以下であり、
該一本鎖DNAが、該宿主リゾプス属菌のゲノムDNAにおける切断部位の上流領域及び下流領域と相同な領域をそれぞれ含む2つのDNA配列を含有し、
該2つのDNA配列の長さがそれぞれ25bp以上である、
変異糸状菌の製造方法。 - 前記一本鎖DNAが、前記宿主リゾプス属菌のゲノムDNAに挿入すべき配列をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 前記挿入すべき配列の長さが1kbp以上10kbp以下である、請求項2記載の方法。
- 前記部位特異的DNAヌクレアーゼがTALEN、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1又はZFN技術に基づく人工DNAヌクレアーゼである、請求項1~3のいずれか1項記載の方法。
- 前記リゾプス属菌がRhizopus delemar又はRhizopus oryzaeである、請求項1~4のいずれか1項記載の方法。
- 前記宿主リゾプス属菌において外来エキソヌクレアーゼを発現させることをさらに含む、請求項1~5のいずれか1項記載の方法。
- 前記外来エキソヌクレアーゼがリゾプス属菌由来エキソヌクレアーゼである、請求項6記載の方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016019676 | 2016-02-04 | ||
JP2016019676 | 2016-02-04 | ||
JP2016152972 | 2016-08-03 | ||
JP2016152972 | 2016-08-03 | ||
PCT/JP2017/003648 WO2017135317A1 (ja) | 2016-02-04 | 2017-02-01 | 変異糸状菌の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2017135317A1 JPWO2017135317A1 (ja) | 2018-11-29 |
JP6990111B2 true JP6990111B2 (ja) | 2022-02-03 |
Family
ID=59500688
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017565597A Active JP6990111B2 (ja) | 2016-02-04 | 2017-02-01 | 変異糸状菌の製造方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20190359991A1 (ja) |
EP (1) | EP3412765B1 (ja) |
JP (1) | JP6990111B2 (ja) |
CN (1) | CN108603160B (ja) |
DK (1) | DK3412765T3 (ja) |
WO (1) | WO2017135317A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102319845B1 (ko) * | 2016-07-13 | 2021-11-01 | 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. | 조류 숙주 세포에 대한 crispr-cas 시스템 |
JP6599583B1 (ja) | 2018-11-05 | 2019-10-30 | キッコーマン株式会社 | 多重遺伝子破壊アスペルギルス属微生物及びその製造方法 |
CN111154801B (zh) * | 2018-11-07 | 2021-09-10 | 武汉纤然生物科技有限公司 | 一种提高基因编辑效率的方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002065273A (ja) | 2000-08-31 | 2002-03-05 | Nippon Shokuhin Kako Co Ltd | α−グルコシダーゼ遺伝子を含有する組換えベクター、形質転換体およびそれを用いたα−グルコシダーゼの製造方法 |
JP2015519923A (ja) | 2012-06-21 | 2015-07-16 | リコンビネティクス・インコーポレイテッドRecombinetics,Inc. | 遺伝子改変動物およびそれを作製するための方法 |
JP2015192662A (ja) | 2014-03-20 | 2015-11-05 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | トリアシルグリセロールリパーゼ変異植物 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6268189B1 (en) | 2000-03-24 | 2001-07-31 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Fungal lactate dehydrogenase gene and constructs for the expression thereof |
US6528636B1 (en) | 2000-03-27 | 2003-03-04 | Battelle Memorial Institute | Promoter sequence of 3-phosphoglycerate kinase gene 2 of lactic acid-producing fungus rhizopus oryzae and a method of expressing a gene of interest in fungal species |
US6465635B2 (en) | 2000-03-27 | 2002-10-15 | Battelle Memorial Institute | Promoter sequence of 3-phosphoglycerate kinase gene 1 of lactic acid-producing fungus rhizopus oryzae and a method of expressing a gene of interest in fungal species |
US7838278B2 (en) | 2005-01-14 | 2010-11-23 | Archer-Daniels-Midland Company | Compositions and methods for manipulating carbon flux in cells |
WO2015017866A1 (en) * | 2013-08-02 | 2015-02-05 | Enevolv, Inc. | Processes and host cells for genome, pathway, and biomolecular engineering |
CN107667171A (zh) * | 2014-12-16 | 2018-02-06 | 丹尼斯科美国公司 | 真菌基因组修饰系统及使用方法 |
US11396665B2 (en) * | 2015-01-06 | 2022-07-26 | Dsm Ip Assets B.V. | CRISPR-CAS system for a filamentous fungal host cell |
JP6055514B2 (ja) | 2015-06-01 | 2016-12-27 | Thk株式会社 | リニアアクチュエータ |
-
2017
- 2017-02-01 DK DK17747472.3T patent/DK3412765T3/da active
- 2017-02-01 JP JP2017565597A patent/JP6990111B2/ja active Active
- 2017-02-01 CN CN201780009765.3A patent/CN108603160B/zh active Active
- 2017-02-01 US US16/074,167 patent/US20190359991A1/en not_active Abandoned
- 2017-02-01 EP EP17747472.3A patent/EP3412765B1/en active Active
- 2017-02-01 WO PCT/JP2017/003648 patent/WO2017135317A1/ja active Application Filing
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002065273A (ja) | 2000-08-31 | 2002-03-05 | Nippon Shokuhin Kako Co Ltd | α−グルコシダーゼ遺伝子を含有する組換えベクター、形質転換体およびそれを用いたα−グルコシダーゼの製造方法 |
JP2015519923A (ja) | 2012-06-21 | 2015-07-16 | リコンビネティクス・インコーポレイテッドRecombinetics,Inc. | 遺伝子改変動物およびそれを作製するための方法 |
JP2015192662A (ja) | 2014-03-20 | 2015-11-05 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | トリアシルグリセロールリパーゼ変異植物 |
Non-Patent Citations (8)
Title |
---|
Biotechnology and Bioengineering (2015), Vol.112, No.12, pp.2543-2549 |
Biotechnology and Bioengineering (2015), Vol.112, No.7, pp.1335-1342 |
Cell Discovery (2015) Vol.1, No.15007, pp.1-11 |
Genome Biology (2015) Vol.16, No.251, pp.1-3 |
Mol. Genet. Genomics (2002) Vol.268, pp.397-406 |
Nature Communications (2014) Vol.5, No.5560, pp.1-8 |
Nature Methods (2011) Vol.8, No.9, pp.753-755 (Author Manuscript pp.1-10) |
壺井雄一, 外5名,人工DNA切断酵素TALENを用いたRhizopus oryzaeにおける遺伝子破壊技術の確立,日本農芸化学会2016年度大会講演要旨集, 2016年3月5日発行, 発表番号3F216 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3412765B1 (en) | 2023-01-18 |
US20190359991A1 (en) | 2019-11-28 |
EP3412765A4 (en) | 2019-05-22 |
EP3412765A1 (en) | 2018-12-12 |
DK3412765T3 (da) | 2023-01-30 |
JPWO2017135317A1 (ja) | 2018-11-29 |
CN108603160B (zh) | 2022-02-18 |
CN108603160A (zh) | 2018-09-28 |
WO2017135317A1 (ja) | 2017-08-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11345933B2 (en) | CRISPR enabled multiplexed genome engineering | |
Chen et al. | Efficient CRISPR-Cas9 gene disruption system in edible-medicinal mushroom Cordyceps militaris | |
Wang et al. | Molecular tools for gene manipulation in filamentous fungi | |
KR102626503B1 (ko) | 뉴클레오타이드 표적 인식을 이용한 표적 서열 특이적 개변 기술 | |
JP6990111B2 (ja) | 変異糸状菌の製造方法 | |
WO2018123134A1 (ja) | ゲノム編集タンパク質の直接導入による糸状菌ゲノム編集方法 | |
NL2011912C2 (en) | Novel genome alteration system for microorganisms. | |
CN112481309B (zh) | Ago蛋白的用途及组合物和基因编辑方法 | |
CN112585272A (zh) | 基因靶向 | |
JP6081245B2 (ja) | 麹菌染色体における任意領域の重複転座の作製方法 | |
JP5846417B2 (ja) | 形質転換体の培養方法及びイタコン酸の製造方法 | |
US11306320B2 (en) | Method for promoting homologous recombination | |
JP2017121184A (ja) | 変異リゾプス属菌 | |
Madhavan et al. | Aspergillus spp., a versatile cell factory for enzymes and metabolites: Interventions through genome editing | |
JP2021010344A (ja) | ユーグレナのゲノム改変方法、ユーグレナの育種方法及び化合物の製造方法 | |
JP4049364B2 (ja) | 多コピー型・ゲノム挿入型の選択両用ベクター | |
JP6859086B2 (ja) | 糸状菌変異株及びそれを用いたc4ジカルボン酸の製造方法 | |
JP5565992B2 (ja) | 酵母キャンディダ・ユティリスの形質転換法 | |
JP7025932B2 (ja) | 変異リゾプス属菌 | |
JP7358105B2 (ja) | アスペルギルス属糸状菌のピリチアミン耐性変異株 | |
JP6970101B2 (ja) | 変異糸状菌、及びそれを用いたc4ジカルボン酸の製造方法 | |
CN112143729B (zh) | 一种启动红发夫酵母rna表达的启动子及其应用 | |
WO2022210464A1 (ja) | ストレス耐性植物 | |
Wang et al. | Advances in the generation of insertion-based genome edits in plants | |
JP5170397B2 (ja) | イオンビーム照射を用いた糸状菌の変異株作出方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20191212 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20201201 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210129 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20210629 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210917 |
|
C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20210917 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20210928 |
|
C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21 Effective date: 20211005 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20211130 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20211203 |
|
R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 6990111 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |