JP6599583B1 - 多重遺伝子破壊アスペルギルス属微生物及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]染色体上の少なくとも2種類のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した、形質転換アスペルギルス属(Aspergillus)微生物であって、前記選択マーカー遺伝子は、トリプトファン生合成遺伝子及びトリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子を含む、前記形質転換アスペルギルス属微生物。
[2]相同組換え領域の間にループアウト領域及びマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を含む核酸断片の少なくとも2種類を含む、アスペルギルス属微生物形質転換用組成物であって、前記核酸断片は、前記選択マーカー遺伝子がトリプトファン生合成遺伝子である核酸断片及び前記選択マーカー遺伝子がトリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子である核酸断片を含む、前記組成物。
[3]前記形質転換アスペルギルス属微生物は、宿主生物がアスペルギルス・アクレアタス(Aspergillus aculeatus)以外のアスペルギルス属微生物である、[1]〜[2]のいずれか1項に記載の形質転換アスペルギルス属微生物又は組成物。
[4]前記トリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子は、栄養性物質の要求性を相補し、かつ、該栄養性物質のアナログからの毒性物質の生合成に関与する遺伝子である、[1]〜[3]のいずれか1項に記載の形質転換アスペルギルス属微生物又は組成物。
[5]前記トリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子は、ウラシル生合成遺伝子、硫酸塩代謝遺伝子及び硝酸塩代謝遺伝子からなる群から選ばれる選択マーカー遺伝子である、[1]〜[4]のいずれか1項に記載の形質転換アスペルギルス属微生物又は組成物。
[6]前記トリプトファン生合成遺伝子はtrpC遺伝子であり、かつ、トリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子は、pyrG遺伝子、niaD遺伝子及びsC遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも1種の遺伝子である、[1]〜[5]のいずれか1項に記載の形質転換アスペルギルス属微生物又は組成物。
[7]下記の工程(1)〜工程(3)を含む、染色体上のマーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子及びマーカーリサイクル法に利用可能な第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物の製造方法であって、該第1の選択マーカー遺伝子及び該第2の選択マーカー遺伝子は、いずれか一方がトリプトファン生合成遺伝子であり、他方が栄養性物質の要求性を相補し、かつ、該栄養性物質のアナログからの毒性物質の生合成に関与する遺伝子である、前記方法:
(1)染色体上の第1の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を、相同組換え領域の間にループアウト領域及び第1の選択マーカー遺伝子を含む核酸断片を用いて、染色体上の第2の選択マーカー遺伝子を標的として相同組換えすることにより、形質転換アスペルギルス属微生物を得る工程;
(2)前記工程(1)で得られた形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の存在下で培養することにより、染色体上に前記第1の選択マーカー遺伝子が挿入され、かつ、染色体上の第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程;及び、
(3)前記工程(2)で選抜された形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び栄養性物質のアナログ並びに前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の存在下で培養することにより、染色体上の前記第1の選択マーカー遺伝子及び前記第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。
[8]下記の工程(A)〜工程(B)を含む、マーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子及びマーカーリサイクル法に利用可能な第2の選択マーカー遺伝子を利用した、形質転換アスペルギルス属微生物の染色体上の2種類の標的遺伝子の欠損方法であって、該第1の選択マーカー遺伝子及び該第2の選択マーカー遺伝子は、いずれか一方がトリプトファン生合成遺伝子であり、他方が栄養性物質の要求性を相補し、かつ、該栄養性物質のアナログからの毒性物質の生合成に関与する遺伝子である、前記方法:
(A)染色体上の第1の選択マーカー遺伝子及び第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を、第1の標的遺伝子に対する相同組換え領域の間にループアウト領域及び第1の選択マーカー遺伝子を含む第1の核酸断片及び第2の標的遺伝子に対する相同組換え領域の間にループアウト領域及び第2の選択マーカー遺伝子を含む第2の核酸断片を用いて、該第1の標的遺伝子及び該第2の標的遺伝子を標的として相同組換えすることにより、形質転換アスペルギルス属微生物を得る工程;及び
(B)前記工程(A)で得られた形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の非存在下で培養することにより、染色体上に前記第1の選択マーカー遺伝子及び前記第2の選択マーカー遺伝子が挿入された形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。
[9]さらに下記の工程(C)を含む、[8]に記載の方法:
(C)前記工程(B)で選抜された形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログ並びに前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログの存在下で培養することにより、染色体上の前記第1の選択マーカー遺伝子、前記第2の選択マーカー遺伝子、前記第1の標的遺伝子及び前記第2の標的遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。
[10]前記第1の選択マーカー遺伝子はトリプトファン生合成遺伝子であり、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質のアナログは5−FAAであり、及び該5−FAAの濃度は0.005%(w/v)〜0.02%(w/v)であり、かつ、
前記第2の選択マーカー遺伝子はpyrG遺伝子であり、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質のアナログは5−FOAであり、及び該5−FOAの濃度は0.05%(w/v)〜0.15%(w/v)である、[9]に記載の方法。
[11]前記形質転換アスペルギルス属微生物は、宿主生物がアスペルギルス・アクレアタス以外のアスペルギルス属微生物である、[7]〜[10]のいずれか1項に記載の方法。
本発明の一態様である形質転換アスペルギルス属(Aspergillus)微生物は、宿主生物であるアスペルギルス属微生物の染色体上にある2種類又はそれ以上のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損するように、宿主生物を形質転換したアスペルギルス属微生物である。また、本発明の一態様である組成物は、本発明の一態様である形質転換アスペルギルス属微生物における標的遺伝子を破壊するために用いられ、相同組換え領域の間にループアウト領域及びマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を含む核酸断片の2種類又はそれ以上を少なくとも含む。
酵母のトリプトファン生合成経路の概要を図1に示す。図1に示すとおり、酵母では、トリプトファンの生合成には、TRP4(anthranilate phosphoribosyltransferase)、TRP1(phosphoribosylanthranilate isomerase)、TRP3(indole−3−glycerol phosphate synthase)及びTRP5(tryptophan synthase)の4種の酵素が関与している。なお、chorismateからanthranilateへの反応は、TRP2(Anthranilate synthase)が触媒する。
塩基配列やアミノ酸配列の配列同一性を求める方法は特に限定されないが、例えば、通常知られる方法を利用して、野生型遺伝子や野生型遺伝子が発現する野生型タンパク質のアミノ酸配列と対象となる塩基配列やアミノ酸配列とをアラインメントし、両者の配列の一致率を算出するためのプログラムを用いることにより求められる。
マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子は、例えば、マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子の発現又はマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子としての機能が確認できる生物種などに由来する。マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子の由来生物としては、例えば、微生物などが挙げられ、宿主生物と同一又は近縁種のアスペルギルス属微生物であることが好ましい。アスペルギルス属微生物の具体例としては、アスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・タマリ(Aspergillus tamarii)、アスペルギルス・ルチュエンシス(Aspergillus luchuensis)、アスペルギルス・ウサミ(Aspergillus usamii)、アスペルギルス・アクレアタス(Aspergillus aculeatus)、アスペルギルス・サイトイ(Aspergillus saitoi)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)などが挙げられる。
宿主生物としては、染色体上にマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を有し、該選択マーカー遺伝子を欠損することにより、該選択マーカー遺伝子の機能が発揮し得るアスペルギルス属微生物であれば特に限定されない。ただし、アスペルギルス属微生物は、アスペルギルス・アクレアタス以外のアスペルギルス属微生物であることが好ましく、安全性や培養の容易性を加味すれば、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・ルチュエンシス、アスペルギルス・ウサミ、アスペルギルス・サイトイ、アスペルギルス・ニデュランスなどのアスペルギルス属微生物であることがより好ましい。
形質転換体の一実施態様は、宿主生物がアスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・ルチュエンシス、アスペルギルス・ウサミ又はアスペルギルス・サイトイである、染色体上のpyrG遺伝子及びtrpC遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物であるが、これに限定されない。
マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物の作製方法は特に限定されず、例えば、常法に従って、宿主生物の染色体上にあるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠落するように、又は該選択マーカー遺伝子の遺伝子座に外来核酸断片を挿入又は置換するようにして、マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を欠損させる工程を含む方法などが挙げられる。該工程は相同組換えを利用して実施することが好ましい。
(1)染色体上のマーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を、相同組換え領域の間にループアウト領域及び第1の選択マーカー遺伝子を含む核酸断片を用いて、染色体上のマーカーリサイクル法に利用可能な第2の選択マーカー遺伝子を標的として相同組換えすることにより、形質転換アスペルギルス属微生物を得る工程
(2)前記工程(1)で得られた形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の存在下で培養することにより、染色体上に前記第1の選択マーカー遺伝子が挿入され、かつ、染色体上の第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程
(3)前記工程(2)で選抜された形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び栄養性物質のアナログ並びに前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の存在下で培養することにより、染色体上の前記第1の選択マーカー遺伝子及び前記第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程
本発明の一態様の形質転換アスペルギルス属微生物を利用すれば、形質転換アスペルギルス属微生物の染色体上の2種類又はそれ以上の標的遺伝子を同時的に、又は段階的に欠損させることができる。
(A)染色体上のマーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子及びマーカーリサイクル法に利用可能な第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を、第1の標的遺伝子に対する相同組換え領域の間にループアウト領域及び第1の選択マーカー遺伝子を含む第1の核酸断片及び第2の標的遺伝子に対する相同組換え領域の間にループアウト領域及び第2の選択マーカー遺伝子を含む第2の核酸断片を用いて、該第1の標的遺伝子及び該第2の標的遺伝子を標的として相同組換えすることにより、形質転換アスペルギルス属微生物を得る工程;及び、
(B)前記工程(A)で得られた形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の非存在下で培養することにより、染色体上に前記第1の選択マーカー遺伝子及び前記第2の選択マーカー遺伝子が挿入された形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。
(C)前記工程(B)で選抜された形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログ並びに前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログの存在下で培養することにより、染色体上の前記第1の選択マーカー遺伝子、前記第2の選択マーカー遺伝子、前記第1の標的遺伝子及び前記第2の標的遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。
本発明の一態様の製造方法及び本発明の一態様の標的遺伝子の欠損方法の非限定的な具体例において、マーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子はpyrG遺伝子であり、第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質はウラシル/ウリジンであり、第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質のアナログは5−FOAであり、マーカーリサイクル法に利用可能な第2の選択マーカー遺伝子はtrpC遺伝子であり、第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質はトリプトファンであり、第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質のアナログは5−FAAである。
1.AstrpC破壊株の作製
(1−1)染色体DNAの抽出
150ml容量の三角フラスコにポリペプトンデキストリン培地(1%(w/v)ポリペプトン、2%(w/v)デキストリン、0.5%(w/v)KH2PO4、0.1%(w/v)NaNO3、0.05%(w/v)MgSO4・7H2O、0.1%(w/v)カザミノ酸;pH6.0)を蒸留水で30ml調製し、アスペルギルス・ソーヤNBRC4239株の分生子を接種して30℃で一晩振とう培養した。
プラスミドpUC19に、相同組換えのための上流領域1(As上流領域1)、ウリジン/ウラシル要求性を相補する形質転換マーカーであるpyrG遺伝子及び相同組換えのための下流領域1(As下流領域1)を順に連結させたコンストラクト用プラスミドを次のとおりに作製した。
鋳型DNAとして上記(1−2)で得られたプラスミドpTrpC_HRを用いて、上記(1−2)の記載に準じてPCR及びPCR産物の精製を実施することによりAstrpC破壊用カセットを得た。使用したプライマーは配列番号7〜8のプライマーである。
宿主として、特許第6261039号公報の実施例2の記載に準じて、アスペルギルス・ソーヤNBRC4239株の染色体上のpyrG遺伝子及び遺伝子ターゲッティング効率の向上のために、非相同組換えに関与する遺伝子であるku70遺伝子を破壊したアスペルギルス・ソーヤKP−del株を作製した。AstrpC破壊用カセットを用いたアスペルギルス・ソーヤKP−del株の形質転換の概略を図2に示す。図2に示されているとおり、AstrpC破壊用カセットを用いて形質転換することにより、アスペルギルス・ソーヤKP−del株の染色体上のtrpC遺伝子の遺伝子座にpyrG遺伝子を導入して、trpC遺伝子が欠損し、かつ、pyrG遺伝子を有するAstrpC破壊株を作製した。
上記(1−2)に準じて抽出した形質転換アスペルギルス・ソーヤの染色体DNAを鋳型として、PCRで確認することにより、AstrpC遺伝子が破壊された株を選抜した。使用したプライマーは配列番号9〜12のプライマーである。
AstrpC破壊用カセットが相同組換えで導入されていることを確認したAstrpC破壊株を、1mM トリプトファンを含む、又は含まないCzapek−Dox最少寒天培地のプレートにそれぞれ植菌して、30℃、4日間インキュベートし、トリプトファンを含む培地でのみ生育することを確認した。
AstrpC破壊株及び対照としてアスペルギルス・ソーヤNBRC4239株を、0.04%(w/v)5−FAA及び1mM トリプトファンを含むポテトデキストロース寒天培地(日水製薬社)のプレートに植菌し、30℃、4日間インキュベートした。NBRC4239株は全く生育しなかったのに対し、AstrpC破壊株は生育した。これにより、AstrpC破壊株は5−FAAに耐性を示すことを確認した。なお、5−FAA(5−フルオロアントラニル酸;東京化成工業社)は、エタノールを用いて10%溶液を調製し、最終濃度が上記濃度になるように培地に添加して使用した。
(2−1)破壊対象遺伝子
破壊対象遺伝子として、アスペルギルス・ソーヤNBRC4239株の公開ゲノムデータベース(BioProject Accession:PRJDA60265)から、scaffold00063の3347080−3344733の領域に予測されるpoly(ADP−ribose) polymeraseの遺伝子を対象とすることにした。該遺伝子を、Asparp1遺伝子とした。
上記(1−2)に記載の方法に準じて、プラスミドpUC19に、相同組換えのための上流領域2(As上流領域2)、ループアウトのための領域1(Asループアウト領域1)、AstrpC遺伝子及び相同組換えのための下流領域2(As下流領域2)を順に連結させたプラスミドpPARP1_LO_Trpを作製した。使用したプライマーは配列番号15〜22のプライマーである。
鋳型DNAとして上記(2−2)で得られたプラスミドpPARP1_LO_Trpを用いて、上記(1−3)の記載に準じてPCR及びPCR産物の精製を実施することにより、Asparp1破壊用カセットを得た。使用したプライマーは配列番号23〜24のプライマーである。
以下の手順により、Asparp1破壊株を作製した。なお、Asparp1破壊用カセットを用いたAstrpC破壊株の形質転換の概略を図3に示す。図3に示されているとおり、Asparp1破壊用カセットを用いて形質転換することにより、AstrpC破壊株の染色体上のparp1遺伝子の遺伝子座にtrpC遺伝子を導入して、parp1遺伝子が欠損し、かつ、trpC遺伝子を有する形質転換アスペルギルス・ソーヤを作製した。
上記(1−5)の記載に準じて、形質転換株から染色体DNAを抽出してPCRで確認することにより、Asparp1遺伝子が破壊された株を選抜した。使用したプライマーは配列番号25〜28のプライマーである。
(3−1)AstrpC除去株の確認
図5に概略を示すとおり、以下の手順により、Asparp1破壊株に導入したtrpC遺伝子をループアウトにより除去した、trpC遺伝子及びparp1遺伝子が除去された株を選抜した。
選抜したAstrpC除去株を、1mM トリプトファンを含む、又は含まないCzapek−Dox最少寒天培地のプレートにそれぞれ植菌して、30℃、4日間インキュベートすることにより、AstrpC除去株は、トリプトファンを含む培地でのみ生育する、すなわちトリプトファン要求性であることを確認した。また、5−FAAを用いることにより、AstrpCが除去できることが示された。
1.AotrpC破壊株の作製
例1と同様にして、アスペルギルス・オリゼRIB40株の染色体DNAを鋳型として、相同組換えのための上流領域1(Ao上流領域1)及び相同組換えのための下流領域1(Ao下流領域1)のDNA断片を得た後、プラスミドpUC19に、Ao上流領域1、AspyrG遺伝子及びAo下流領域1を順に連結させたコンストラクト用プラスミドpAoTrpC_HRを作製した。使用したプライマーは配列番号31〜34のプライマーである。
破壊対象遺伝子として、アスペルギルス・オリゼRIB40株の公開ゲノムデータベース(BioProject Accession:PRJNA20809)から、SC102の1456616−1457378の領域にある機能不明の予測遺伝子を用いた。該遺伝子を、AohypGとした。
図8に概略を示すとおり、以下の手順により、AohypG破壊株に導入したtrpC遺伝子をループアウトにより除去した、trpC遺伝子及びhypG遺伝子が除去された株を選抜した。
1.AntrpC破壊株の作製
例1と同様にして、アスペルギルス・ニガーA1179株(ΔkusA、pyrG−;Fungal Genetics Stock Centerから入手)の染色体DNAを鋳型として、相同組換えのための上流領域1(An上流領域1)及び相同組換えのための下流領域1(An下流領域1)のDNA断片を得た後、プラスミドpUC19に、An上流領域1、AspyrG遺伝子及びAn下流領域1を順に連結させたコンストラクト用プラスミドpAnTrpC_HRを作製した。使用したプライマーは配列番号53〜56のプライマーである。
破壊対象遺伝子として、アスペルギルス・ニガーが有するトレハロース6リン酸合成酵素であるTpsCの遺伝子(BMC Microbiol 14,90(2014)、[Website]https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3991884/を参照)を用いた。該遺伝子を、AntpsCとした。
AntpsC破壊株の分生子を、1mM トリプトファン及び0.015%(w/v)5−FAAを含むポテトデキストロース寒天培地のプレートに塗沫し、30℃、4日間以上インキュベートした。
以下の手順により、アスペルギルス・ソーヤのAspyrG破壊株におけるAstrpC遺伝子を、AspyrG遺伝子で破壊した後、導入したAspyrGをループアウトで除くことにより、AspyrG・AstrpC二重破壊株を作製した。AspyrG・AstrpC二重破壊株の作製手順の概略を図10に示す。
例1で作製したプラスミドpTrpC_HRを鋳型として、Inverse PCR及びPCR産物の精製を実施することにより、ベクター断片を得た。使用したプライマーは配列番号79〜80のプライマーである。
例1の(1−4)に記載の方法に準じて、ループアウト可能なAstrpC破壊用カセットを用いて、アスペルギルス・ソーヤKP−del株を形質転換することにより、形質転換アスペルギルス・ソーヤを得た。
上記で得たAstrpC破壊株の分生子を、1mM トリプトファン、20mM ウラシル及び0.3%(w/v)5−FOAを含むCzapek−Dox最少寒天培地のプレートに塗沫し、30℃、5日間以上インキュベートすることにより、5−FOA耐性株を選抜した。なお、5−FOA(5−フルオロオロチン酸;Fluorochem社)は、1.2%水溶液をpH6に調整し、次いでフィルターろ過滅菌したものを、最終濃度が上記濃度になるように培地に添加して使用した。
AspyrG・AstrpC二重破壊株を下記(1)〜(4)に示す4種の寒天培地のプレートに植菌し、30℃、5日間以上インキュベートした。
(1)Czapek−Dox最少寒天培地
(2)1mM トリプトファンを含むCzapek−Dox最少寒天培地
(3)20mM ウラシルを含むCzapek−Dox最少寒天培地
(4)1mM トリプトファン及び20mM ウラシルを含むCzapek−Dox最少寒天培地
非破壊株(アスペルギルス・ソーヤNBRC4239株)、AspyrG破壊株(アスペルギルス・ソーヤKP−del株)、AstrpC破壊株(例1で作製)及びAspyrG・AstrpC二重破壊株を用いて、以下の手順により、これらの菌株の5−FOA耐性及び5−FAA耐性を評価した。
1.Asnph破壊用カセットの作製
破壊対象遺伝子として、アスペルギルス・ソーヤNBRC4239株の公開ゲノムデータベース(BioProject Accession:PRJDA60265)から、scaffold00033の1904082−1905244の領域に予測されるプロテアーゼの遺伝子を対象とすることにした。該遺伝子を、Asnph遺伝子とした。
Asparp1破壊用カセット及びAsnph破壊用カセットを用いたAspyrG・AstrpC二重破壊株の形質転換によるAsparp1・Asnph二重破壊株の作製から、AspyrGマーカー遺伝子及びAstrpCマーカー遺伝子をループアウトさせて得られるAspyrG・AstrpC二重除去株の作製までの手順の概略を図11に示す。
(3−1)同時ループアウト
Asparp1・Asnph二重破壊株の分生子を、1mM トリプトファン、20mM ウラシル、0.08%(w/v)5−FOA及び0.01%(w/v)5−FAAを含むポテトデキストロース寒天培地のプレートに塗沫し、30℃、10日間以上インキュベートした。
(1)Czapek−Dox最少寒天培地
(2)1mM トリプトファンを含むCzapek−Dox最少寒天培地
(3)20mM ウラシルを含むCzapek−Dox最少寒天培地
(4)1mM トリプトファン及び20mM ウラシルを含むCzapek−Dox最少寒天培地
Asparp1・Asnph二重破壊株の分生子を、20mM ウラシル及び0.3%(w/v)5−FOAを含むCzapek−Dox最少寒天培地のプレートに塗沫し、30℃、5日間以上インキュベートした。5−FOA耐性株(AspyrG除去株)が生じたプレートから、0.01%(w/v)Tween80溶液を用いて分生子を回収し、同溶液で適宜希釈することこにより、分生子懸濁液を調製した。
Claims (8)
- 染色体上の少なくとも2種類のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した、形質転換アスペルギルス属(Aspergillus)微生物であって、前記選択マーカー遺伝子はtrpC遺伝子及びpyrG遺伝子を含み、かつ、宿主生物がアスペルギルス・アクレアタス(Aspergillus aculeatus)以外のアスペルギルス属微生物である、前記形質転換アスペルギルス属微生物。
- 相同組換え領域の間にループアウト領域及びマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を含む核酸断片の少なくとも2種類を含む、アスペルギルス・アクレアタス(Aspergillus aculeatus)以外のアスペルギルス属微生物形質転換用組成物であって、前記核酸断片は、前記選択マーカー遺伝子がtrpC遺伝子である核酸断片及び前記選択マーカー遺伝子がpyrG遺伝子である核酸断片を含む、前記組成物。
- 前記形質転換アスペルギルス属微生物は、宿主生物がアスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・タマリ(Aspergillus tamarii)、アスペルギルス・ルチュエンシス(Aspergillus luchuensis)、アスペルギルス・ウサミ(Aspergillus usamii)又はアスペルギルス・サイトイ(Aspergillus saitoi)である、請求項1〜2のいずれか1項に記載の形質転換アスペルギルス属微生物又は組成物。
- 下記の工程(1)〜工程(3)を含む、染色体上のマーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子及びマーカーリサイクル法に利用可能な第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物の製造方法であって、該第1の選択マーカー遺伝子及び該第2の選択マーカー遺伝子は、いずれか一方がtrpC遺伝子であり、他方がpyrG遺伝子であり、trpC遺伝子に対応する栄養性物質がトリプトファンであり、トリプトファンのアナログが5−FAAであり、pyrG遺伝子に対応する栄養性物質がウラシル及び/又はウリジンであり、ウラシル及び/又はウリジンのアナログが5−FOAであり、及び、宿主生物がアスペルギルス・アクレアタス(Aspergillus aculeatus)以外のアスペルギルス属微生物である、前記方法:
(1)染色体上の第1の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を、相同組換え領域の間にループアウト領域及び第1の選択マーカー遺伝子を含む核酸断片を用いて、染色体上の第2の選択マーカー遺伝子を標的として相同組換えすることにより、形質転換アスペルギルス属微生物を得る工程;
(2)前記工程(1)で得られた形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の存在下で培養することにより、染色体上に前記第1の選択マーカー遺伝子が挿入され、かつ、染色体上の第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程;及び、
(3)前記工程(2)で選抜された形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び栄養性物質のアナログ並びに前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の存在下で培養することにより、染色体上の前記第1の選択マーカー遺伝子及び前記第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。 - 下記の工程(A)〜工程(B)を含む、マーカーリサイクル法に利用可能な第1の選択マーカー遺伝子及びマーカーリサイクル法に利用可能な第2の選択マーカー遺伝子を利用した、形質転換アスペルギルス属微生物の染色体上の2種類の標的遺伝子の欠損方法であって、該第1の選択マーカー遺伝子及び該第2の選択マーカー遺伝子は、いずれか一方がtrpC遺伝子であり、他方がpyrG遺伝子であり、trpC遺伝子に対応する栄養性物質がトリプトファンであり、トリプトファンのアナログが5−FAAであり、pyrG遺伝子に対応する栄養性物質がウラシル及び/又はウリジンであり、ウラシル及び/又はウリジンのアナログが5−FOAであり、及び、宿主生物がアスペルギルス・アクレアタス(Aspergillus aculeatus)以外のアスペルギルス属微生物である、前記方法:
(A)染色体上の第1の選択マーカー遺伝子及び第2の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を、第1の標的遺伝子に対する相同組換え領域の間にループアウト領域及び第1の選択マーカー遺伝子を含む第1の核酸断片及び第2の標的遺伝子に対する相同組換え領域の間にループアウト領域及び第2の選択マーカー遺伝子を含む第2の核酸断片を用いて、該第1の標的遺伝子及び該第2の標的遺伝子を標的として相同組換えすることにより、形質転換アスペルギルス属微生物を得る工程;及び
(B)前記工程(A)で得られた形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の非存在下で培養することにより、染色体上に前記第1の選択マーカー遺伝子及び前記第2の選択マーカー遺伝子が挿入された形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。 - さらに下記の工程(C)を含む、請求項5に記載の方法:
(C)前記工程(B)で選抜された形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第1の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログ並びに前記第2の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログの存在下で培養することにより、染色体上の前記第1の選択マーカー遺伝子、前記第2の選択マーカー遺伝子、前記第1の標的遺伝子及び前記第2の標的遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。 - 前記5−FAAの濃度は0.005%(w/v)〜0.02%(w/v)であり、かつ、
前記5−FOAの濃度は0.05%(w/v)〜0.15%(w/v)である、請求項6に記載の方法。 - 前記形質転換アスペルギルス属微生物は、宿主生物がアスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・タマリ(Aspergillus tamarii)、アスペルギルス・ルチュエンシス(Aspergillus luchuensis)、アスペルギルス・ウサミ(Aspergillus usamii)又はアスペルギルス・サイトイ(Aspergillus saitoi)である、請求項4〜7のいずれか1項に記載の方法。
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