JP2020074748A - 多重遺伝子破壊アスペルギルス属微生物及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】少なくとも２種類のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物及びその利用のための組成物の提供。【解決手段】染色体上の少なくとも２種類のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した、形質転換アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）微生物、及び、相同組換え領域の間にループアウト領域及びマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を含む核酸断片の少なくとも２種類を含む、アスペルギルス属微生物形質転換用組成物であって、前記選択マーカー遺伝子は、トリプトファン生合成遺伝子及びトリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子を含む。【選択図】図１１

Description

本発明は、染色体上の少なくとも２種類の遺伝子が破壊された形質転換アスペルギルス属微生物及びその製造方法に関する。

アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）微生物は、醤油や味噌などの発酵食品の製造工程の一つである製麹工程に用いられる麹菌として利用される他、様々な物質生産に利用されている。そこで、染色体上にある標的遺伝子を破壊するなどして、所望の形質を表現するようにアスペルギルス属微生物を改変する技術が求められている。

宿主の染色体上にある標的遺伝子を破壊する方法としては、マーカーリサイクル法（マーカーリサイクリング法ともよばれる。）がある。マーカーリサイクル法は、相同組換えによって標的遺伝子を選択マーカー遺伝子に置換した後、選択マーカー遺伝子を除去させて、形質転換体の染色体上に選択マーカー遺伝子が残らないようにして、選択マーカー遺伝子を再利用するという方法である。

マーカーリサイクル法で用いられる選択マーカー遺伝子としては、選択マーカー遺伝子による置換及び選択マーカー遺伝子の除去が容易に確認できるシステムを備えていることが求められる。このようなマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子として、アスペルギルス属微生物ではｐｙｒＧ遺伝子が用いられている。

アスペルギルス属微生物は、染色体上にｐｙｒＧ遺伝子を有することにより、ウリジン及び／又はウラシル（以下、ウリジン／ウラシルと表記する場合もある。）を添加しなくても生育できるが、ウリジンモノリン酸の生合成の中間体であるオロチジン ５’−モノリン酸のアナログである５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）を代謝して毒性のある５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を合成する。したがって、染色体上にｐｙｒＧ遺伝子を有するアスペルギルス属微生物は、５−ＦＯＡの存在下で培養しても生育できない。これに対して、染色体上にｐｙｒＧ遺伝子を有さないアスペルギルス属微生物は、５−ＦＯＡを代謝できないことから、５−ＦＯＡが存在していても生育できるが、ウリジン／ウラシル要求性となる。

ｐｙｒＧ遺伝子のように、マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子としては、その遺伝子が発現することにより、特定の薬剤（５−ＦＯＡなど）を含む環境下では生育できなくなることを利用したカウンター選抜に利用可能な選択マーカー遺伝子であることが求められる。換言すれば、カウンター選抜に利用できる薬剤が見つかっていなければ、その選択マーカー遺伝子はマーカーリサイクル法に利用できない。

この性質を利用して、ｐｙｒＧ遺伝子欠損アスペルギルス属微生物の染色体上の標的遺伝子をｐｙｒＧ遺伝子で置換した形質転換体をウリジン／ウラシル非含有培地を用いて選抜し、次いで選抜した形質転換体を５−ＦＯＡ含有培地を用いてカウンター選抜することにより、５−ＦＯＡ耐性株として標的遺伝子及びｐｙｒＧ遺伝子が欠損した形質転換体を得ることができる。

ただし、アスペルギルス属微生物を対象としたマーカーリサイクル法で用いられる選択マーカー遺伝子としては、現状では、上記したｐｙｒＧ遺伝子が用いられているのみである。また、薬剤を使用したｎｉａＤ欠損株のカウンター選抜や、ｓＣ欠損株のカウンター選抜においては、いずれも薬剤の選択圧が弱いために非欠損株のバックグラウンドの生育が見られることから、実質的にマーカーリサイクル法にはほとんど用いられていないのが現状である。

一方、特許文献１には、リゾプス・デルマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ）を宿主とする形質転換体について、トリプトファンの生合成に関与する遺伝子であるｔｒｐＣ遺伝子の欠損の有無を５−フルオロアントラニル酸（５−ＦＡＡ）の存在下での生育の有無を確認することにより評価していることが記載されている。また、非特許文献１には、選択マーカー遺伝子として、ｐｙｒＧ遺伝子及びアルギニンの生合成遺伝子であるａｒｇＢ遺伝子を欠損した形質転換アスペルギルス・アクレアタスが記載されている。

ＷＯ２０１７／１３５３１７号パンフレット

TANI et al.，AMB Express，2013，3:4，https://amb-express.springeropen.com/articles/10.1186/2191-0855-3-4

特許文献１では、５−ＦＡＡ存在下での生育の有無により、ｔｒｐＣ遺伝子欠損株を選抜している。しかし、特許文献１には、ｔｒｐＣ遺伝子を、マーカーリサイクル法で用いるためのリサイクル可能な選択マーカー遺伝子として使用できることについての記載は無い。

また、非特許文献１に記載の形質転換アスペルギルス・アクレアタスについて、欠損したａｒｇＢ遺伝子はマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子ではない。また、非特許文献１には、ａｒｇＢ遺伝子に代えて別の選択マーカー遺伝子を利用すること、例えば、数多くあるアミノ酸の生合成に関与する遺伝子のうち、特定の選択マーカー遺伝子を利用することについて、なんら記載が無い。

さらに、宿主生物であるアスペルギルス属微生物をマーカーリサイクル法により形質転換するに際して、ｐｙｒＧ遺伝子と同程度のリサイクルが可能であり、ｐｙｒＧ遺伝子に代えて利用可能な選択マーカー遺伝子についてはこれまでにほとんど知られていない。特に、ｐｙｒＧ遺伝子とともに用いることが可能である、マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子による置換及び除去を容易に確認できるシステムについても、これまでにほとんど知られていない。

そこで、本発明が解決しようとする第１の課題は、マーカーリサイクル法に利用可能な少なくとも２種類の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物及びその製造方法を提供することにある。

本発明が解決しようとする第２の課題は、選択マーカー遺伝子を含む核酸断片の少なくとも２種類を含む組成物を用いて、マーカーリサイクル法を利用して形質転換アスペルギルス属微生物の染色体上にある少なくとも２種類の標的遺伝子を欠損する方法を提供することにある。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討したところ、利用可能性が想定される種々の遺伝子のうち、トリプトファンの生合成に関与する遺伝子に着眼するに至った。そして、このトリプトファン生合成遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を宿主として、標的遺伝子の遺伝子座に、ループアウト領域及びトリプトファン生合成遺伝子を含む核酸断片を導入したところ、トリプトファン非存在下での生育により標的遺伝子とトリプトファン生合成遺伝子との置換が確認でき、さらに５−ＦＡＡ存在下での生育によりトリプトファン生合成遺伝子のループアウトによる除去が確認できることを見出した。

そして、驚くべきことに、本発明者は、５−ＦＯＡ及び５−ＦＡＡの存在量を所定の濃度に設定することにより、選択マーカー遺伝子としてトリプトファン生合成遺伝子及びｐｙｒＧ遺伝子を欠損させた二重破壊形質転換アスペルギルス属微生物を製造及び選抜することに成功した。アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼといったアスペルギルス属微生物は薬剤に対する耐性が高いことが知られている。そのために、アスペルギルス属微生物に対して、５−ＦＡＡをトリプトファン生合成系遺伝子欠損株のカウンター選抜に使用できるか否か、使用できるとしても５−ＦＡＡの濃度をどの程度に設定すればよいかなどについて、これまでに知見はなかった。これに加えて、選択圧が弱いこと、すなわち感受性と耐性との差が小さいために適した薬剤濃度を設定することが困難であるおそれさえも想定された。このような技術的背景があるにもかかわらず、本発明者は、上記二重破壊形質転換アスペルギルス属微生物を製造及び選抜すること、更には該二重破壊形質転換アスペルギルス属微生物を用いることにより、染色体上にある２種類の標的核酸を効率良く短時間で欠損させることに成功した。本発明はこのような知見や成功例に基づいて完成するに至った発明である。

したがって、本発明の一態様によれば、以下の［１］〜［８］の形質転換アスペルギルス属微生物、組成物及び方法が提供される。
［１］染色体上の少なくとも２種類のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した、形質転換アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）微生物であって、前記選択マーカー遺伝子は、トリプトファン生合成遺伝子及びトリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子を含む、前記形質転換アスペルギルス属微生物。
［２］相同組換え領域の間にループアウト領域及びマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を含む核酸断片の少なくとも２種類を含む、アスペルギルス属微生物形質転換用組成物であって、前記核酸断片は、前記選択マーカー遺伝子がトリプトファン生合成遺伝子である核酸断片及び前記選択マーカー遺伝子がトリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子である核酸断片を含む、前記組成物。
［３］前記形質転換アスペルギルス属微生物は、宿主生物がアスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）以外のアスペルギルス属微生物である、［１］〜［２］のいずれか１項に記載の形質転換アスペルギルス属微生物又は組成物。
［４］前記トリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子は、栄養性物質の要求性を相補し、かつ、該栄養性物質のアナログからの毒性物質の生合成に関与する遺伝子である、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の形質転換アスペルギルス属微生物又は組成物。
［５］前記トリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子は、ウラシル生合成遺伝子、硫酸塩代謝遺伝子及び硝酸塩代謝遺伝子からなる群から選ばれる選択マーカー遺伝子である、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の形質転換アスペルギルス属微生物又は組成物。
［６］前記トリプトファン生合成遺伝子はｔｒｐＣ遺伝子であり、かつ、トリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子は、ｐｙｒＧ遺伝子、ｎｉａＤ遺伝子及びｓＣ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子である、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の形質転換アスペルギルス属微生物又は組成物。
［７］下記の工程（１）〜工程（３）を含む、染色体上のマーカーリサイクル法に利用可能な第１の選択マーカー遺伝子及びマーカーリサイクル法に利用可能な第２の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物の製造方法であって、該第１の選択マーカー遺伝子及び該第２の選択マーカー遺伝子は、いずれか一方がトリプトファン生合成遺伝子であり、他方が栄養性物質の要求性を相補し、かつ、該栄養性物質のアナログからの毒性物質の生合成に関与する遺伝子である、前記方法：
（１）染色体上の第１の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を、相同組換え領域の間にループアウト領域及び第１の選択マーカー遺伝子を含む核酸断片を用いて、染色体上の第２の選択マーカー遺伝子を標的として相同組換えすることにより、形質転換アスペルギルス属微生物を得る工程；
（２）前記工程（１）で得られた形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第２の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の存在下で培養することにより、染色体上に前記第１の選択マーカー遺伝子が挿入され、かつ、染色体上の第２の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程；及び、
（３）前記工程（２）で選抜された形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第１の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び栄養性物質のアナログ並びに前記第２の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の存在下で培養することにより、染色体上の前記第１の選択マーカー遺伝子及び前記第２の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。
［８］下記の工程（Ａ）〜工程（Ｂ）を含む、マーカーリサイクル法に利用可能な第１の選択マーカー遺伝子及びマーカーリサイクル法に利用可能な第２の選択マーカー遺伝子を利用した、形質転換アスペルギルス属微生物の染色体上の２種類の標的遺伝子の欠損方法であって、該第１の選択マーカー遺伝子及び該第２の選択マーカー遺伝子は、いずれか一方がトリプトファン生合成遺伝子であり、他方が栄養性物質の要求性を相補し、かつ、該栄養性物質のアナログからの毒性物質の生合成に関与する遺伝子である、前記方法：
（Ａ）染色体上の第１の選択マーカー遺伝子及び第２の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を、第１の標的遺伝子に対する相同組換え領域の間にループアウト領域及び第１の選択マーカー遺伝子を含む第１の核酸断片及び第２の標的遺伝子に対する相同組換え領域の間にループアウト領域及び第２の選択マーカー遺伝子を含む第２の核酸断片を用いて、該第１の標的遺伝子及び該第２の標的遺伝子を標的として相同組換えすることにより、形質転換アスペルギルス属微生物を得る工程；及び
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第１の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び前記第２の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の非存在下で培養することにより、染色体上に前記第１の選択マーカー遺伝子及び前記第２の選択マーカー遺伝子が挿入された形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。
［９］さらに下記の工程（Ｃ）を含む、［８］に記載の方法：
（Ｃ）前記工程（Ｂ）で選抜された形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第１の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログ並びに前記第２の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログの存在下で培養することにより、染色体上の前記第１の選択マーカー遺伝子、前記第２の選択マーカー遺伝子、前記第１の標的遺伝子及び前記第２の標的遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。
［１０］前記第１の選択マーカー遺伝子はトリプトファン生合成遺伝子であり、前記第１の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質のアナログは５−ＦＡＡであり、及び該５−ＦＡＡの濃度は０．００５％（ｗ／ｖ）〜０．０２％（ｗ／ｖ）であり、かつ、
前記第２の選択マーカー遺伝子はｐｙｒＧ遺伝子であり、前記第１の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質のアナログは５−ＦＯＡであり、及び該５−ＦＯＡの濃度は０．０５％（ｗ／ｖ）〜０．１５％（ｗ／ｖ）である、［９］に記載の方法。
［１１］前記形質転換アスペルギルス属微生物は、宿主生物がアスペルギルス・アクレアタス以外のアスペルギルス属微生物である、［７］〜［１０］のいずれか１項に記載の方法。

本発明の一態様である形質転換アスペルギルス属微生物及び方法によれば、マーカーリサイクル法を利用して、形質転換アスペルギルス属微生物の染色体上にある少なくとも２種類の標的核酸を効率良く短時間で欠損させることができる。本発明の一態様である組成物及び方法によれば、マーカーリサイクル法に利用可能な少なくとも２種類の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を製造することができる。本発明の一態様である形質転換アスペルギルス属微生物、組成物及び方法を応用することにより、構造若しくは機能が類似又は関連する遺伝子の同時破壊による新たな表現型を迅速に検出することが期待できる。

図１は、酵母のトリプトファン生合成経路の概要を示す図である。 図２は、後述する実施例に記載があるとおりの、ＡｓｔｒｐＣ破壊用カセットを用いたアスペルギルス・ソーヤＫＰ−ｄｅｌ株の形質転換の概略を示す図である。 図３は、後述する実施例に記載があるとおりの、Ａｓｐａｒｐ１破壊用カセットを用いたＡｓｔｒｐＣ破壊株の形質転換の概略を示す図である。 図４Ａは、後述する実施例に記載があるとおりの、Ａｓｐａｒｐ１破壊株の選抜のためのアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。 図４Ｂは、後述する実施例に記載があるとおりの、Ａｓｐａｒｐ１破壊株の選抜のためのアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。 図５は、後述する実施例に記載があるとおりの、Ａｓｐａｒｐ１破壊株に導入したｔｒｐＣ遺伝子をループアウトにより除去した、ｔｒｐＣ遺伝子及びｐａｒｐ１遺伝子が除去された株の選抜手順の概略及び５−ＦＡＡ耐性株の出現頻度を示す図である。 図６Ａは、後述する実施例に記載があるとおりの、ＡｓｔｒｐＣ除去株の選抜のためのアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。 図６Ｂは、後述する実施例に記載があるとおりの、ＡｓｔｒｐＣ除去株の選抜のためのアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。 図７は、後述する実施例に記載があるとおりの、ＡｏｈｙｐＧ破壊用カセットを用いたＡｏｔｒｐＣ破壊株の形質転換の概略を示す図である。 図８は、後述する実施例に記載があるとおりの、ＡｏｈｙｐＧ破壊株に導入したｔｒｐＣ遺伝子をループアウトにより除去した、ｔｒｐＣ遺伝子及びｈｙｐＧ遺伝子が除去された株の選抜手順の概略を示した図である。 図９Ａは、後述する実施例に記載があるとおりの、ＡｏｔｒｐＣ除去株の選抜のためのアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。 図９Ｂは、後述する実施例に記載があるとおりの、ＡｏｔｒｐＣ除去株の選抜のためのアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。 図１０は、後述する実施例に記載があるとおりの、ＡｓｐｙｒＧ・ＡｓｔｒｐＣ二重破壊株の作製手順の概略を示す図である。 図１１は、後述する実施例に記載があるとおりの、Ａｓｐａｒｐ１・Ａｓｎｐｈ二重破壊株の作製からＡｓｐｙｒＧ・ＡｓｔｒｐＣ二重除去株の作製までの手順の概略を示す図である。 図１２は、後述する実施例に記載があるとおりの、Ａｓｐａｒｐ１・Ａｓｎｐｈ二重破壊株の選抜のためのアガロースゲル電気泳動の結果を示した図である。 図１３Ａは、後述する実施例に記載があるとおりの、ＡｓｐｙｒＧ・ＡｓｔｒｐＣ二重除去株の選抜のためのアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。 図１３Ｂは、後述する実施例に記載があるとおりの、ＡｓｐｙｒＧ・ＡｓｔｒｐＣ二重除去株の選抜のためのアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。 図１３Ｃは、後述する実施例に記載があるとおりの、ＡｓｐｙｒＧ・ＡｓｔｒｐＣ二重除去株の選抜のためのアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。

以下、本発明の一態様である形質転換アスペルギルス属微生物、組成物及び方法の詳細について説明するが、本発明の技術的範囲は本項目の事項によってのみに限定されるものではなく、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。

本明細書における各用語は、別段の定めがない限り、当業者により通常用いられている意味で使用され、不当に限定的な意味を有するものとして解釈されるべきではない。

例えば、「及び／又は」とは、列記した複数の関連項目のいずれか１つ、又は２つ以上の任意の組み合わせ若しくは全ての組み合わせを意味する。

「遺伝子の欠損」とは、遺伝子の一部又は全部が欠損することにより、遺伝子が正常に転写されないこと、転写されたタンパク質が本来のタンパク質の機能を発揮しないことなどのように、遺伝子が正常に機能せずに遺伝子の発現が妨げられていることを意味する。本明細書では、遺伝子の欠損と遺伝子の破壊とは同義で用いられる。

「遺伝子の発現」とは、転写や翻訳などを介して、遺伝子によってコードされるタンパク質が本来の構造や活性を有する態様で生産されることを意味する。

「選択マーカー遺伝子」とは、形質転換体の選択手段として使用される形質をもたらす遺伝子であり、対応する選択性物質の存在下若しくは非存在下で、形質転換体が特異的に選択されるように、又はされないようにすることを可能にするものをいう。「選択マーカー遺伝子の機能」とは、対応する選択性物質の存在下又は非存在下で形質転換体が特異的に選択されるようにすることを可能にすることをいう。例えば、選択マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子である場合は、選択マーカー遺伝子の機能が発揮することにより、薬剤の存在下で形質転換体は特異的に選択されるようになる。また、選択マーカー遺伝子が栄養要求性遺伝子である場合は、選択マーカー遺伝子の機能が発揮することにより、栄養物質の非存在下で形質転換体は特異的に選択されるようになる。選択マーカー遺伝子のうち、「マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子」とは、その遺伝子が発現することにより、特定の薬剤を含む環境下では生育できなくなることを利用したカウンター選抜に利用可能な選択マーカー遺伝子をいう。

「相同組換え領域」とは、染色体上にある標的とする遺伝子（標的遺伝子）の両側（すなわち、上流（５’末端側）及び下流（３’末端側））にある領域とそれぞれ相同な核酸配列をいう。「相同組換え領域」のうち、標的遺伝子の上流側にある領域を「相同組換え上流領域」とよび、標的遺伝子の下流側にある領域を「相同組換え下流領域」とよぶ。

「ループアウト」とは、同一染色体上にある相同な核酸配列同士が組換えを起こし、その間にある核酸配列が抜け落ちる現象をいう。「ループアウト領域」は、ループアウトを可能にする領域であり、例えば、ループアウト領域と一緒に導入する選択マーカー遺伝子をループアウトにより除去するための領域をいう。

「生合成遺伝子」とは、対象とする物質の生合成経路において機能するタンパク質を発現する１種類又は２種類以上の遺伝子を意味し、例えば、対象とする物質へ変換する反応を触媒する酵素を発現する遺伝子などが挙げられる。

「代謝遺伝子」とは、対象とする物質の代謝経路において機能するタンパク質を発現する１種類又は２種類以上の遺伝子を意味し、例えば、対象とする物質を別の物質へ変換する反応を触媒する酵素を発現する遺伝子などが挙げられる。

（形質転換アスペルギルス属微生物及び組成物の概要）
本発明の一態様である形質転換アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）微生物は、宿主生物であるアスペルギルス属微生物の染色体上にある２種類又はそれ以上のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損するように、宿主生物を形質転換したアスペルギルス属微生物である。また、本発明の一態様である組成物は、本発明の一態様である形質転換アスペルギルス属微生物における標的遺伝子を破壊するために用いられ、相同組換え領域の間にループアウト領域及びマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を含む核酸断片の２種類又はそれ以上を少なくとも含む。

本発明の一態様の形質転換アスペルギルス属微生物及び組成物において、マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子の１種類又は２種類以上はトリプトファン生合成遺伝子であり、マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子の別の１種類又は２種類以上はトリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子である。

（マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子）
酵母のトリプトファン生合成経路の概要を図１に示す。図１に示すとおり、酵母では、トリプトファンの生合成には、ＴＲＰ４（ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＴＲＰ１（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＴＲＰ３（ｉｎｄｏｌｅ−３−ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）及びＴＲＰ５（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の４種の酵素が関与している。なお、ｃｈｏｒｉｓｍａｔｅからａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅへの反応は、ＴＲＰ２（Ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）が触媒する。

これに対して、本発明者は、アスペルギルス・ソーヤ（Ａ．ｓｏｊａｅ）ＮＢＲＣ４２３９株の公開ゲノムデータベース（ＢｉｏＰｒｏｊｅｃｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＰＲＪＤＡ６０２６５）から、ＴＲＰ４に相当する酵素をコードする遺伝子はｓｃａｆｆｏｌｄ０００６３の１５５４７６０−１５５３４０３の領域にあると予測した。そして、該領域を破壊しようと試みたところ、該領域を破壊した染色体と非破壊の染色体とが混在した株しか得られず、結果として該領域を破壊した株は得られなかった。

また、ＴＲＰ５に相当する酵素をコードする遺伝子はｓｃａｆｆｏｌｄ０００６０の１４７０９３６−１４７３２６０の領域、ｓｃａｆｆｏｌｄ０００３６の９１７９５３−９２０１５２の領域、ｓｃａｆｆｏｌｄ０００５７の３５０５８２−３５２８４６の領域及びｓｃａｆｆｏｌｄ０００１１の６６２６０５−６５９８９８の領域にあると予測した。このようにＴＲＰ５に相当する酵素をコードする遺伝子は４個あると予測して、それらを全て破壊することは非常に困難であることから断念した。

さらに、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株において、ＴＲＰ１及びＴＲＰ３のそれぞれの酵素に相当する酵素をコードする遺伝子は見当らなかった。その一方で、ＴＲＰ１及びＴＲＰ３の機能を兼ね備えた酵素をコードする遺伝子はｓｃａｆｆｏｌｄ０００４８の１２１３７００−１２１１３７６の領域にあると予測し、該領域をＡｓｔｒｐＣ遺伝子と名付けた。そして、アスペルギルス・ソーヤにおいて、ＡｓｔｒｐＣ遺伝子を破壊することにより、アントラニル酸からトリプトファンを生合成することができない形質転換アスペルギルス属微生物を得ることに成功した。

上記した経緯に基づけば、マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子としてのトリプトファン生合成遺伝子としては、酵母のＴＲＰ１及びＴＲＰ３の機能を兼ね備えた酵素をコードする遺伝子、すなわち、ｔｒｐＣ遺伝子が好ましいが、酵母のＴＲＰ４、ＴＲＰ５又はＴＲＰ２に相当する酵素をコードする遺伝子であってもよい。トリプトファン生合成遺伝子は、上記した遺伝子のいずれか１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。

トリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子は、トリプトファン生合成遺伝子とは異なるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子などが挙げられる。栄養要求性遺伝子は宿主生物の栄養要求性を相補する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、ｐｙｒＧ遺伝子、ｎｉａＤ遺伝子、ｓＣ遺伝子などが挙げられる。トリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子は、上記した遺伝子の１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。なお、ｎｉａＤ遺伝子が欠損した株は塩素酸塩に対して耐性を有し、ｓＣ遺伝子が欠損した株はセレン酸に対して耐性を有するという形質を示す。

ｐｙｒＧ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｎｉａＤ遺伝子及びｓＣ遺伝子は、それぞれ由来生物ごとにＮＣＢＩ ＧｅｎｅＢａｎｋに登録されている。例えば、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ及びアスペルギルス・ニガーのｐｙｒＧ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｎｉａＤ遺伝子及びｓＣ遺伝子のＧｅｎｅＢａｎｋのアクセッション番号を表１に示す。なお、アスペルギルス・ソーヤについては、染色体上のｓｃａｆｆｏｌｄを示す。当業者であれば、ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＢａｎｋを参照することにより、アスペルギルス属微生物のこれらの遺伝子の塩基配列を取得できる。

トリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子は、上記した遺伝子のうち、形質転換体の選抜の容易性の観点から、栄養要求性遺伝子が好ましい。栄養要求性遺伝子は、生合成遺伝子及び代謝遺伝子を包含する。栄養要求性遺伝子の中でも、栄養性物質の要求性を相補し、かつ、該栄養性物質のアナログからの毒性物質の生合成に関与する遺伝子であることがより好ましく、ウラシル生合成遺伝子、硫酸塩代謝遺伝子及び硝酸塩代謝遺伝子がさらに好ましく、ｐｙｒＧ遺伝子、ｎｉａＤ遺伝子及びｓＣ遺伝子がなおさらに好ましい。

マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子は、マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を有する由来生物が本来保有する遺伝子（すなわち、野生型遺伝子）と完全に同一でなくともよく、少なくとも野生型遺伝子が発現するタンパク質（すなわち、野生型タンパク質）と同一の、又は近似する酵素学的性質を有するタンパク質を発現する遺伝子である限り、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡなどであってもよい。

本明細書における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味する。

本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。

ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、プローブとしてＤＮＡプローブを用い、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、１．０％（ｗ／ｖ） 核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ロシュ・ダイアグノスティクス社）、０．１％（ｗ／ｖ） Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２％（ｗ／ｖ） ＳＤＳを用い、一晩（８〜１６時間程度）で行う。洗浄は、０．１〜０．５×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳを用い、１５分間、２回行う。ハイブリダイゼーションおよび洗浄を行う温度は６５℃以上、好ましくは６８℃以上である。

また、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡとしては、例えば、コロニー若しくはプラーク由来の野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることによって得られるＤＮＡや０．５〜２．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、４０〜７５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、好ましくは０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、６５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、０．１〜１×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどを挙げることができる。プローブの調製やハイブリダイゼーションの方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ−Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８７−１９９７（以下、これらの文献を参考技術文献とよぶ場合がある。）などに記載されている方法に準じて実施することができる。なお、当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度や温度などの条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブ長さ、反応時間などの諸条件を加味して、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡを得るための条件を適宜設定することができる。

ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡとしては、プローブとして使用する野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列と一定以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば、野生型遺伝子の塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられる。該配列同一性の上限は特に限定されず、典型的には１００％である。

野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、例えば、塩基配列における塩基数１００個を一単位とすれば、野生型遺伝子の塩基配列において、該一単位あたり、１から数個、好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１５個、さらに好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の塩基の欠失、置換、付加などを有する塩基配列を含む。ここで、「塩基の欠失」とは配列中の塩基に欠落又は消失があることを意味し、「塩基の置換」は配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていることを意味し、「塩基の付加」とは新たな塩基が挿入するように付け加えられていることを意味する。

野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質は、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされるタンパク質が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列を有するタンパク質である蓋然性があるが、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされるタンパク質と同じ酵素活性を有するものである。

野生型タンパク質と同一の、又は近似する酵素学的性質を有するタンパク質は、そのアミノ酸配列が、野生型タンパク質が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列からなるものであってもよい。ここで、アミノ酸配列の「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」における「１から数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、アミノ酸配列におけるアミノ酸数１００個を一単位とすれば、該一単位あたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個程度、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個程度、より好ましくは１、２、３、４又は５個程度を意味する。また、「アミノ酸の欠失」とは配列中のアミノ酸残基の欠落又は消失を意味し、「アミノ酸の置換」は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味し、「アミノ酸の付加」とは配列中に新たなアミノ酸残基が挿入するように付け加えられていることを意味する。

「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」の具体的な態様としては、１から数個のアミノ酸が別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えられた態様がある。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する場合、ある極性アミノ酸を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸に置換する場合などを挙げることができる。このような化学的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において知られている。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。

野生型タンパク質が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列としては、野生型タンパク質が有するアミノ酸配列と一定以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ、例えば、野生型タンパク質が有するアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。該配列同一性の上限は特に限定されず、典型的には１００％である。

（配列同一性を算出するための手段）
塩基配列やアミノ酸配列の配列同一性を求める方法は特に限定されないが、例えば、通常知られる方法を利用して、野生型遺伝子や野生型遺伝子が発現する野生型タンパク質のアミノ酸配列と対象となる塩基配列やアミノ酸配列とをアラインメントし、両者の配列の一致率を算出するためのプログラムを用いることにより求められる。

２つの塩基配列やアミノ酸配列における一致率を算出するためのプログラムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８、１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７、１９９３）が知られており、このアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムがＡｌｔｓｃｈｕｌなどによって開発されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、１９９０）。さらに、ＢＬＡＳＴより感度よく配列同一性を決定するプログラムであるＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴも知られている（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、１９９７）。したがって、当業者は例えば上記のプログラムを利用して、与えられた配列に対し、高い配列同一性を示す配列をデータベース中から検索することができる。これらは、例えば、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）において利用可能である。

上記の各方法は、データベース中から配列同一性を示す配列を検索するために通常的に用いられ得るが、個別の配列の配列同一性を決定する手段としては、Ｇｅｎｅｔｙｘネットワーク版 ｖｅｒｓｉｏｎ １２．０．１（ジェネティックス社）のホモロジー解析を用いることもできる。この方法は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１４３５−１４４１、１９８５）に基づくものである。塩基配列の配列同一性を解析する際は、可能であればタンパク質をコードしている領域（ＣＤＳ又はＯＲＦ）を用いる。

（マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子の由来）
マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子は、例えば、マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子の発現又はマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子としての機能が確認できる生物種などに由来する。マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子の由来生物としては、例えば、微生物などが挙げられ、宿主生物と同一又は近縁種のアスペルギルス属微生物であることが好ましい。アスペルギルス属微生物の具体例としては、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・ルチュエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・ウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓａｍｉｉ）、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）などが挙げられる。

上記アスペルギルス属微生物の具体例として挙げたうち、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・ルチュエンシス、アスペルギルス・ウサミ、アスペルギルス・アクレアタス及びアスペルギルス・サイトイは、味噌、醤油、日本酒、焼酎などの醸造食品の製造、クエン酸製造、アミラーゼなどの酵素剤製造への使用実績が豊富であり、高い酵素生産性と長年の利用による安全性に対する高い信頼性とから、産業上利用可能な微生物である。

マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子は、宿主生物に導入して形質転換することにより、マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子タンパク質が発現して、形質転換体は宿主生物と異なる表現形質を呈するようになる。そこで、形質転換体において発現されるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子タンパク質が、宿主生物の生育条件によって不活化せず、選択マーカー機能を発揮するためには、マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子の由来生物は、形質転換すべき宿主生物と生育条件が近似するアスペルギルス属微生物であることが好ましい。

（宿主生物）
宿主生物としては、染色体上にマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を有し、該選択マーカー遺伝子を欠損することにより、該選択マーカー遺伝子の機能が発揮し得るアスペルギルス属微生物であれば特に限定されない。ただし、アスペルギルス属微生物は、アスペルギルス・アクレアタス以外のアスペルギルス属微生物であることが好ましく、安全性や培養の容易性を加味すれば、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・ルチュエンシス、アスペルギルス・ウサミ、アスペルギルス・サイトイ、アスペルギルス・ニデュランスなどのアスペルギルス属微生物であることがより好ましい。

宿主生物は、野生株でもよいが、予め野生株を形質転換した形質転換体でもよい。宿主生物として利用される、予め野生株を形質転換した形質転換体は、特に限定されない。

例えば、アスペルギルス属微生物は相同組換え頻度が低い傾向にあることから、相同組換えで形質転換体を作製する場合には、非相同組換え機構に関与するＫｕ７０、Ｋｕ８０などのタンパク質をコードするｋｕ遺伝子が抑制された形質転換アスペルギルス属微生物を使用することが好ましい。

このようなｋｕ遺伝子の抑制は、当業者に公知の任意の方法で実施することができるが、例えば、ｋｕ遺伝子破壊ベクターを使用してｋｕ遺伝子を破壊することや、ｋｕ遺伝子のアンチセンス発現ベクターを利用するアンチセンスＲＮＡ法によって、ｋｕ遺伝子を不活化することなどによって達成可能である。また、Ｃａｓヌクレアーゼと、ｋｕ遺伝子を標的としたガイドＲＮＡとを利用したゲノム編集の手法によりｋｕ遺伝子を破壊することも可能である。こうして得られる形質転換アスペルギルス属微生物は、ｋｕ遺伝子の抑制に関する遺伝子操作が施される前の元のアスペルギルス属微生物と比較して、相同組換え頻度が顕著に上昇している。具体的には、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも約５０倍上昇している。

（形質転換体の一実施態様）
形質転換体の一実施態様は、宿主生物がアスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・ルチュエンシス、アスペルギルス・ウサミ又はアスペルギルス・サイトイである、染色体上のｐｙｒＧ遺伝子及びｔｒｐＣ遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物であるが、これに限定されない。

（形質転換アスペルギルス属微生物の製造方法）
マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物の作製方法は特に限定されず、例えば、常法に従って、宿主生物の染色体上にあるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠落するように、又は該選択マーカー遺伝子の遺伝子座に外来核酸断片を挿入又は置換するようにして、マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を欠損させる工程を含む方法などが挙げられる。該工程は相同組換えを利用して実施することが好ましい。

相同組換えを利用する方法では、例えば、染色体上のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子の上流領域及び下流領域と相同な相同組換え領域の間に、外来核酸断片を連結するように構築した核酸断片を宿主生物に導入して、相同組換えにより染色体上のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を外来核酸断片と置換する方法などが挙げられる。本明細書では、宿主生物を形質転換するために作製された核酸断片を形質転換用カセットとよぶ場合がある。外来核酸断片は、欠損させるべきマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子とは異なるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子であることが好ましい。

形質転換用カセットは、ループアウト領域を含むことが好ましい。ループアウト領域及び外来核酸断片を含む形質転換用カセットにおいて、ループアウト領域と同じ配列をもつ領域が、宿主生物の染色体上における相同組換えで導入可能な部位の上流又は下流にある場合は、相同組換えにより形質転換用カセットが宿主生物の染色体上に導入された後、ループアウト領域の上流又は下流にあるループアウト領域と相同な領域との間で相同組換えが起きることにより、導入した外来核酸断片をループアウトにより除去することができる。このような手段を講じることにより、選択マーカー遺伝子の遺伝子座に外来核酸断片を導入した後、外来核酸断片を除去した形質転換体を得ることができる。

形質転換用カセットの一態様は、例えば、相同組換え領域の間にループアウト領域及び外来核酸断片を含む核酸断片である。該核酸断片は、アスペルギルス属微生物の染色体ＤＮＡを鋳型として、常法に従って、相同組換え上流領域、ループアウト領域及び相同組換え下流領域のＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」と表記する）によりそれぞれ得た後、プラスミドｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｉｔｅに、相同組換え上流領域、ループアウト領域、外来核酸（ＤＮＡ）断片及び相同組換え下流領域を順に連結させたコンストラクト用プラスミドを作製し、次いで得られたコンストラクト用プラスミドを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲにより増幅することにより得ることができる。

染色体ＤＮＡを抽出する方法は特に限定されないが、例えば、アスペルギルス属微生物を培養し、得られた菌体から水分を取り除き、液体窒素中で冷却しながら乳鉢などを用いて物理的に磨砕することにより細かい粉末状の菌体片とし、該菌体片から通常の方法により染色体ＤＮＡ画分を抽出する。染色体ＤＮＡ抽出操作には、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）などの市販の染色体ＤＮＡ抽出キットが利用できる。

アスペルギルス属微生物の形質転換方法としては、当業者に知られる方法を適宜選択することができ、例えば、宿主生物のプロトプラストを調製した後に、ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いるプロトプラストＰＥＧ法（例えば、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８、９９−１０４、１９８９、特開２００７−２２２０５５号公報などを参照）を用いることができる。アスペルギルス属微生物を再生させるための培地は、用いる宿主生物と欠損させる選択マーカー遺伝子や導入した外来核酸断片とに応じて適切なものを用いる。例えば、宿主生物としてアスペルギルス・ソーヤを用い、外来核酸断片として薬剤耐性遺伝子を用いた場合は、形質転換体の再生は、例えば、対応する薬剤を含む最少寒天培地を用いて行うことができる。

マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物が作製されたことの確認は、欠損したマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子の機能が認められる条件下で形質転換体を培養し、生育の有無を確認することにより行うことができる。例えば、欠損したマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子がｔｒｐＣ遺伝子及びｐｙｒＧ遺伝子である場合は、５−フルオロアントラニル酸（５−ＦＡＡ）及び５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）の存在下での生育を確認することにより、形質転換アスペルギルス属微生物が作製されたことを確認することができる。

また、形質転換アスペルギルス属微生物が作製されたことの確認は、形質転換体から染色体ＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行い、形質転換が起きた場合に増幅が可能なＰＣＲ産物が生じることを確認することにより行ってもよい。

例えば、形質転換用カセットに組み込んだ相同組換え上流領域よりさらに上流に位置する領域に相補的なフォワードプライマーと、形質転換用カセットに組み込んだ相同組換え下流領域よりさらに下流に位置する領域に相補的なリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、相同組換えが起きた場合に想定される長さの産物が生じることを確認することが好ましい。

マーカーリサイクル法に利用可能な第１の選択マーカー遺伝子を欠損した形質転換体に対して、さらにマーカーリサイクル法に利用可能な第２の選択マーカー遺伝子を欠損させることにより、２種類のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換体を作製することができる。この手順を繰り返すことにより、複数のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換体を作製することができる。

例えば、マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子がｔｒｐＣ遺伝子及びｐｙｒＧ遺伝子である場合、ｐｙｒＧ遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を宿主生物として、相同組換え領域の間にループアウト領域及びｐｙｒＧ遺伝子を含む形質転換用カセットによりｔｒｐＣ遺伝子を欠損するように形質転換し、さらに導入したｐｙｒＧ遺伝子をループアウトにより除去することにより、ｔｒｐＣ遺伝子及びｐｙｒＧ遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物が得られる。ｐｙｒＧ遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物としては、例えば、特許第６２６１０３９号公報の実施例２の記載のアスペルギルス・ソーヤＫＰ−ｄｅｌ株などが挙げられる。

形質転換アスペルギルス属微生物の作製方法の具体例として、特許第６２６１０３９号公報の実施例２の記載の方法が挙げられるが、これに限定されない。該方法によれば、アスペルギルス属微生物の野生株から自然変異により該栄養要求性遺伝子が不活性化された株を取得する。該栄養要求性遺伝子は欠損させるべきマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子であっても、そうでなくても、どちらでもよい。

栄養要求性遺伝子が欠損させるべきマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子である場合は、該栄養要求性遺伝子をトリプトファン生合成遺伝子の遺伝子座に導入することにより、トリプトファン生合成遺伝子を欠損させ、次いで該栄養要求性遺伝子をループアウトにより除去することにより、染色体上の２種類のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した、形質転換アスペルギルス属微生物が得られる。

栄養要求性遺伝子が欠損させるべきマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子ではない場合は、例えば、該栄養要求性遺伝子をトリプトファン生合成遺伝子とは異なるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子の遺伝子座に導入することにより、トリプトファン生合成遺伝子とは異なるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を欠損させ、次いでトリプトファン生合成遺伝子とは異なるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子をトリプトファン生合成遺伝子の遺伝子座に導入することにより、トリプトファン生合成遺伝子を欠損させ、次いで導入したトリプトファン生合成遺伝子とは異なるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子をループアウトにより除去することにより、染色体上の２種類のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した、形質転換アスペルギルス属微生物が得られ得る。また、例えば、上記栄養要求性遺伝子をトリプトファン生合成遺伝子の遺伝子座に導入することにより、トリプトファン生合成遺伝子を欠損させ、次いでトリプトファン生合成遺伝子をトリプトファン生合成遺伝子とは異なるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子の遺伝子座に導入することにより、トリプトファン生合成遺伝子とは異なるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を欠損させ、次いで導入したトリプトファン生合成遺伝子をループアウトにより除去することにより、染色体上の２種類のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した、形質転換アスペルギルス属微生物が得られ得る。

本発明の別の一態様は、本発明の一態様である形質転換アスペルギルス属微生物の製造方法である。本発明の一態様の製造方法は、少なくとも下記の工程を含む。ただし、下記工程において、マーカーリサイクル法に利用可能な第１の選択マーカー遺伝子及び第２の選択マーカー遺伝子は、いずれか一方がトリプトファン生合成遺伝子であり、他方が栄養性物質の要求性を相補し、かつ、該栄養性物質のアナログからの毒性物質の生合成に関与する遺伝子である。
（１）染色体上のマーカーリサイクル法に利用可能な第１の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を、相同組換え領域の間にループアウト領域及び第１の選択マーカー遺伝子を含む核酸断片を用いて、染色体上のマーカーリサイクル法に利用可能な第２の選択マーカー遺伝子を標的として相同組換えすることにより、形質転換アスペルギルス属微生物を得る工程
（２）前記工程（１）で得られた形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第２の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の存在下で培養することにより、染色体上に前記第１の選択マーカー遺伝子が挿入され、かつ、染色体上の第２の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程
（３）前記工程（２）で選抜された形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第１の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び栄養性物質のアナログ並びに前記第２の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の存在下で培養することにより、染色体上の前記第１の選択マーカー遺伝子及び前記第２の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程

（標的遺伝子の欠損方法）
本発明の一態様の形質転換アスペルギルス属微生物を利用すれば、形質転換アスペルギルス属微生物の染色体上の２種類又はそれ以上の標的遺伝子を同時的に、又は段階的に欠損させることができる。

本発明の別の一態様は、本発明の一態様の形質転換アスペルギルス属微生物の染色体上の２種類の標的遺伝子の欠損方法である。本発明の一態様の標的遺伝子の欠損方法は、少なくとも下記の工程（Ａ）〜（Ｂ）を含む。ただし、下記工程において、マーカーリサイクル法に利用可能な第１の選択マーカー遺伝子及び第２の選択マーカー遺伝子は、いずれか一方がトリプトファン生合成遺伝子であり、他方が栄養性物質の要求性を相補し、かつ、該栄養性物質のアナログからの毒性物質の生合成に関与する遺伝子である。
（Ａ）染色体上のマーカーリサイクル法に利用可能な第１の選択マーカー遺伝子及びマーカーリサイクル法に利用可能な第２の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を、第１の標的遺伝子に対する相同組換え領域の間にループアウト領域及び第１の選択マーカー遺伝子を含む第１の核酸断片及び第２の標的遺伝子に対する相同組換え領域の間にループアウト領域及び第２の選択マーカー遺伝子を含む第２の核酸断片を用いて、該第１の標的遺伝子及び該第２の標的遺伝子を標的として相同組換えすることにより、形質転換アスペルギルス属微生物を得る工程；及び、
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第１の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び前記第２の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の非存在下で培養することにより、染色体上に前記第１の選択マーカー遺伝子及び前記第２の選択マーカー遺伝子が挿入された形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。

本発明の一態様の標的遺伝子の欠損方法は、さらに下記の工程（Ｃ）を含むことが好ましい：
（Ｃ）前記工程（Ｂ）で選抜された形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第１の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログ並びに前記第２の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログの存在下で培養することにより、染色体上の前記第１の選択マーカー遺伝子、前記第２の選択マーカー遺伝子、前記第１の標的遺伝子及び前記第２の標的遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。

形質転換アスペルギルス属微生物の染色体上の２種類又はそれ以上の標的遺伝子を段階的に欠損させたければ、第１の標的遺伝子に対する第１の核酸断片、マーカーリサイクル法に利用可能な第１の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログ、及びマーカーリサイクル法に利用可能な第２の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質を使用して上記工程（Ａ）〜（Ｃ）を実施した後に、第２の標的遺伝子に対する第２の核酸断片、第２の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログ、及び第１の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質を使用して上記工程（Ａ）〜（Ｃ）を実施することなどをすればよい。また、工程（Ｃ）を第１の選択マーカー遺伝子を除去する工程と第２の選択マーカー遺伝子を除去する工程とに分けて段階的に行うこともできる。このような段階的な標的遺伝子の欠損方法もまた、本発明の一態様の標的遺伝子の欠損方法に包含される。

（方法の具体例）
本発明の一態様の製造方法及び本発明の一態様の標的遺伝子の欠損方法の非限定的な具体例において、マーカーリサイクル法に利用可能な第１の選択マーカー遺伝子はｐｙｒＧ遺伝子であり、第１の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質はウラシル／ウリジンであり、第１の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質のアナログは５−ＦＯＡであり、マーカーリサイクル法に利用可能な第２の選択マーカー遺伝子はｔｒｐＣ遺伝子であり、第２の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質はトリプトファンであり、第２の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質のアナログは５−ＦＡＡである。

本発明の一態様の製造方法及び本発明の一態様の標的遺伝子の欠損方法の別の非限定的な具体例において、マーカーリサイクル法に利用可能な第１の選択マーカー遺伝子はｔｒｐＣ遺伝子であり、第１の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質はトリプトファンであり、第１の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質のアナログは５−ＦＡＡであり、マーカーリサイクル法に利用可能な第２の選択マーカー遺伝子はｐｙｒＧ遺伝子であり、第２の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質はウラシル／ウリジンであり、第２の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質のアナログは５−ＦＯＡである。

上記具体例において、５−ＦＡＡに耐性を有する株、５−ＦＯＡに耐性を有する株並びに５−ＦＡＡ及び５−ＦＯＡに耐性を有する株の選抜の際に用いる５−ＦＡＡ及び５−ＦＯＡの濃度がそれぞれ異なることは、本発明者によって初めて見出された知見である。５−ＦＡＡ及び５−ＦＯＡに耐性を有する株の選抜の際に用いる５−ＦＡＡ及び５−ＦＯＡの濃度は、それらを単独で用いる場合よりも小さい濃度であることが好ましい。５−ＦＡＡに耐性を有する株の選抜には、０．０３％（ｗ／ｖ）〜０．０５％（ｗ／ｖ）５−ＦＡＡを用いることが好ましい。５−ＦＯＡに耐性を有する株の選抜には、０．２％（ｗ／ｖ）〜０．４％（ｗ／ｖ）５−ＦＯＡを用いることが好ましい。５−ＦＡＡ及び５−ＦＯＡに耐性を有する株の選抜には、０．００５％（ｗ／ｖ）〜０．０２％（ｗ／ｖ）５−ＦＡＡ及び０．０５％（ｗ／ｖ）〜０．１５％（ｗ／ｖ）５−ＦＯＡを用いることが好ましい。

本発明の一態様の標的遺伝子の欠損方法における標的遺伝子は特に限定されず、研究や調査の目的に応じて適宜設定すればよい。例えば、後述する実施例に記載があるとおり、宿主生物がアスペルギルス・ソーヤである場合、標的遺伝子をｐａｒｐ１遺伝子及びｎｐｈ遺伝子として、これらの遺伝子が破壊された二重破壊株を得ることができる。

また、本発明の一態様の標的遺伝子の欠損方法を応用すると、１種類のマーカーリサイクル法に利用可能な遺伝子を用いるのみでは達成し得ないことが２種類のマーカーリサイクル法に利用可能な遺伝子を用いることで可能になる。例えば、ｐｙｒＧ遺伝子及びｔｒｐＣ遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を用いて、ｋｕ遺伝子の遺伝子座にｔｒｐＣ遺伝子を導入してｋｕ破壊株を作製する。この際、相同組換え領域の間にｔｒｐＣ遺伝子を含む核酸断片を用いることができるのみでなく、ｔｒｐＣ遺伝子の中程で互いに部分的に重複するように該断片を分割した形の２種の核酸断片を調製し、混合したものを、ｋｕ遺伝子破壊に用いることも可能である。次いで標的遺伝子としてプロテアーゼ遺伝子の遺伝子座にｐｙｒＧ遺伝子を導入及び除去した後、必要に応じてさらに別のプロテアーゼ遺伝子座へのｐｙｒＧ遺伝子の導入及び除去を繰り返した後、導入したｔｒｐＣ遺伝子を除去してｋｕ遺伝子を復活させる。この際、ｋｕ遺伝子を部分的に重複させておくことでループアウトによりｔｒｐＣ遺伝子の除去と共にｋｕ遺伝子を復活させることが可能である。得られたプロテアーゼ遺伝子破壊株に対して、所望のタンパク質を発現する遺伝子発現用カセットを非相同組換えでランダムに多コピー導入することにより、該タンパク質をプロテアーゼによる分解を防ぎながら高発現する株を得ることができる。

本発明の一態様の製造方法及び本発明の一態様の標的遺伝子の欠損方法では、本発明の課題を解決し得る限り、上記した工程の前段若しくは後段又は工程中に、種々の工程や操作を加入することができる。

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。

本実施例で用いたプライマーを表２Ａ〜表２Ｂに示す。なお、表中の配列のうち、小文字の配列は隣接する断片に連結するための付加配列を示す。

［例１．アスペルギルス・ソーヤにおけるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子としてのｔｒｐＣ遺伝子の利用］
１．ＡｓｔｒｐＣ破壊株の作製
（１−１）染色体ＤＮＡの抽出
１５０ｍｌ容量の三角フラスコにポリペプトンデキストリン培地（１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、２％（ｗ／ｖ）デキストリン、０．５％（ｗ／ｖ）ＫＨ_２ＰＯ_４、０．１％（ｗ／ｖ）ＮａＮＯ_３、０．０５％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．１％（ｗ／ｖ）カザミノ酸；ｐＨ６．０）を蒸留水で３０ｍｌ調製し、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の分生子を接種して３０℃で一晩振とう培養した。

得られた培養液からろ過により菌体を回収し、ペーパータオルに挟んで水分を除き、予め液体窒素で冷却した乳鉢及び乳棒を用いて液体窒素で冷却しながら菌体を粉砕した。得られた粉砕菌体からＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて染色体ＤＮＡを抽出した。

（１−２）ＡｓｔｒｐＣ破壊用カセットを含むプラスミドの作製
プラスミドｐＵＣ１９に、相同組換えのための上流領域１（Ａｓ上流領域１）、ウリジン／ウラシル要求性を相補する形質転換マーカーであるｐｙｒＧ遺伝子及び相同組換えのための下流領域１（Ａｓ下流領域１）を順に連結させたコンストラクト用プラスミドを次のとおりに作製した。

Ａｓ上流領域１、ＡｓｐｙｒＧ遺伝子及びＡｓ下流領域１を増幅するために、鋳型ＤＮＡとして上記（１−１）で得られたアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡ、ＰＣＲの酵素としてＱ５ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）、装置としてＴ１００サーマルサイクラー（バイオ・ラッド社）を使用して、酵素に添付されたプロトコールに従ってＰＣＲを実施した。

Ａｓ上流領域１、ＡｓｐｙｒＧ遺伝子及びＡｓ下流領域１を増幅するために使用したプライマー配列番号１〜６のプライマーである。増幅したＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した。

ｐＵＣ１９は、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（クロンテック社）に付属されているｐＵＣ１９ ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ Ｖｅｃｔｏｒを用いた。ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｉｔｅにて、増幅した３種のＤＮＡ断片を、上記したＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用して、キットに添付されたプロトコールに従って連結して、コンストラクト用プラスミドを得た。

得られたコンストラクト用プラスミドにより、コンピテントセルであるＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ニッポンジーン社）を、製造業者の指示に従って形質転換することにより、形質転換大腸菌を得た。

得られた形質転換大腸菌を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で３７℃、一晩振とう培養した。培養後の培養液を遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体について、ＦａｓｔＧｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社）を用いて、キットに添付されたプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。

ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトに、Ａｓ上流領域１−ＡｓｐｙｒＧ−Ａｓ下流領域１の配列が順に連結されたプラスミドを得た。得られたプラスミドをｐＴｒｐＣ＿ＨＲとした。

（１−３）ＡｓｔｒｐＣ破壊用カセットの増幅
鋳型ＤＮＡとして上記（１−２）で得られたプラスミドｐＴｒｐＣ＿ＨＲを用いて、上記（１−２）の記載に準じてＰＣＲ及びＰＣＲ産物の精製を実施することによりＡｓｔｒｐＣ破壊用カセットを得た。使用したプライマーは配列番号７〜８のプライマーである。

上記のようにして、Ａｓ上流領域１−ＡｓｐｙｒＧ−Ａｓ下流領域１の配列が順に連結されたＡｓｔｒｐＣ破壊用カセットを得た。

（１−４）アスペルギルス・ソーヤＫＰ−ｄｅｌ株の形質転換
宿主として、特許第６２６１０３９号公報の実施例２の記載に準じて、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体上のｐｙｒＧ遺伝子及び遺伝子ターゲッティング効率の向上のために、非相同組換えに関与する遺伝子であるｋｕ７０遺伝子を破壊したアスペルギルス・ソーヤＫＰ−ｄｅｌ株を作製した。ＡｓｔｒｐＣ破壊用カセットを用いたアスペルギルス・ソーヤＫＰ−ｄｅｌ株の形質転換の概略を図２に示す。図２に示されているとおり、ＡｓｔｒｐＣ破壊用カセットを用いて形質転換することにより、アスペルギルス・ソーヤＫＰ−ｄｅｌ株の染色体上のｔｒｐＣ遺伝子の遺伝子座にｐｙｒＧ遺伝子を導入して、ｔｒｐＣ遺伝子が欠損し、かつ、ｐｙｒＧ遺伝子を有するＡｓｔｒｐＣ破壊株を作製した。

５００ｍｌ容量の三角フラスコに２０ｍＭ ウラシル及び２０ｍＭ ウリジンを含むポリペプトンデキストリン液体培地 １００ｍｌに、アスペルギルス・ソーヤＫＰ−ｄｅｌ株の分生子を接種し、３０℃で約２０時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト及び２０μｇのＡｓｔｒｐＣ破壊用カセットを用いて、プロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行い、次いで１ｍＭ トリプトファン、０．５％（ｗ／ｖ）寒天及び１．２Ｍ ソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社；ｐＨ６）を用いて、３０℃、５日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換アスペルギルス・ソーヤを得た。

ＡｓｔｒｐＣが破壊された形質転換アスペルギルス・ソーヤは、ＡｓｔｒｐＣ遺伝子の位置に挿入されたＡｓｐｙｒＧ遺伝子によって宿主のウラシル要求性が相補され、代わりにトリプトファン要求性になる。

（１−５）ＡｓｔｒｐＣ破壊株の選抜
上記（１−２）に準じて抽出した形質転換アスペルギルス・ソーヤの染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲで確認することにより、ＡｓｔｒｐＣ遺伝子が破壊された株を選抜した。使用したプライマーは配列番号９〜１２のプライマーである。

上記のＰＣＲを実施することにより、ＡｓｔｒｐＣ遺伝子由来の６９２ｂｐのＰＣＲ産物が生じず、破壊対象ではないＡｓｌｉｇ１遺伝子由来の４３９ｂｐのＰＣＲ産物が生じたことをアガロース電気泳動により確認し、ＡｓｔｒｐＣ破壊株を選抜した。

選抜したＡｓｔｒｐＣ破壊株について、ＰＣＲ及びＰＣＲ産物の制限酵素消化処理を行うことにより、ＡｓｔｒｐＣ破壊用カセットが相同組換えで導入されたことを確認した。使用したプライマーは配列番号１３〜１４のプライマーである。

ＡｓｔｒｐＣ破壊株では、５．７ｋｂのＰＣＲ産物が生じ、これをＫｐｎＩで消化することにより２．４ｋｂ、２．１ｋｂ及び１．２ｋｂの断片が生じた。なお、宿主では、６．４ｋｂのＰＣＲ産物が生じ、これをＫｐｎＩで消化することにより３．５ｋｂ及び２．９ｋｂの断片が生じた。

（１−６）トリプトファン要求性の確認
ＡｓｔｒｐＣ破壊用カセットが相同組換えで導入されていることを確認したＡｓｔｒｐＣ破壊株を、１ｍＭ トリプトファンを含む、又は含まないＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少寒天培地のプレートにそれぞれ植菌して、３０℃、４日間インキュベートし、トリプトファンを含む培地でのみ生育することを確認した。

（１−７）ＡｓｔｒｐＣ破壊株の５−ＦＡＡ耐性の確認
ＡｓｔｒｐＣ破壊株及び対照としてアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株を、０．０４％（ｗ／ｖ）５−ＦＡＡ及び１ｍＭ トリプトファンを含むポテトデキストロース寒天培地（日水製薬社）のプレートに植菌し、３０℃、４日間インキュベートした。ＮＢＲＣ４２３９株は全く生育しなかったのに対し、ＡｓｔｒｐＣ破壊株は生育した。これにより、ＡｓｔｒｐＣ破壊株は５−ＦＡＡに耐性を示すことを確認した。なお、５−ＦＡＡ（５−フルオロアントラニル酸；東京化成工業社）は、エタノールを用いて１０％溶液を調製し、最終濃度が上記濃度になるように培地に添加して使用した。

５−ＦＡＡ濃度を０．０２％（ｗ／ｖ）に変えて同様に行ったところ、ＡｓｔｒｐＣ破壊株及びＮＢＲＣ４２３９株はともに生育した。したがって、アスペルギルス・ソーヤに対して０．０４％（ｗ／ｖ）５−ＦＡＡを用いることにより、ＡｓｔｒｐＣ破壊株を選抜できることがわかった。

２．ＡｓｔｒｐＣマーカー遺伝子を用いた遺伝子破壊
（２−１）破壊対象遺伝子
破壊対象遺伝子として、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の公開ゲノムデータベース（ＢｉｏＰｒｏｊｅｃｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＰＲＪＤＡ６０２６５）から、ｓｃａｆｆｏｌｄ０００６３の３３４７０８０−３３４４７３３の領域に予測されるｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ） ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの遺伝子を対象とすることにした。該遺伝子を、Ａｓｐａｒｐ１遺伝子とした。

（２−２）Ａｓｐａｒｐ１破壊用カセットを含むプラスミドの作製
上記（１−２）に記載の方法に準じて、プラスミドｐＵＣ１９に、相同組換えのための上流領域２（Ａｓ上流領域２）、ループアウトのための領域１（Ａｓループアウト領域１）、ＡｓｔｒｐＣ遺伝子及び相同組換えのための下流領域２（Ａｓ下流領域２）を順に連結させたプラスミドｐＰＡＲＰ１＿ＬＯ＿Ｔｒｐを作製した。使用したプライマーは配列番号１５〜２２のプライマーである。

（２−３）Ａｓｐａｒｐ１破壊用カセットの増幅
鋳型ＤＮＡとして上記（２−２）で得られたプラスミドｐＰＡＲＰ１＿ＬＯ＿Ｔｒｐを用いて、上記（１−３）の記載に準じてＰＣＲ及びＰＣＲ産物の精製を実施することにより、Ａｓｐａｒｐ１破壊用カセットを得た。使用したプライマーは配列番号２３〜２４のプライマーである。

上記のようにして、Ａｓ上流領域２−Ａｓループアウト領域１−ＡｓｔｒｐＣ−Ａｓ下流領域２の配列が順に連結されたＡｓｐａｒｐ１破壊用カセットを得た。

（２−４）Ａｓｐａｒｐ１破壊株の作製
以下の手順により、Ａｓｐａｒｐ１破壊株を作製した。なお、Ａｓｐａｒｐ１破壊用カセットを用いたＡｓｔｒｐＣ破壊株の形質転換の概略を図３に示す。図３に示されているとおり、Ａｓｐａｒｐ１破壊用カセットを用いて形質転換することにより、ＡｓｔｒｐＣ破壊株の染色体上のｐａｒｐ１遺伝子の遺伝子座にｔｒｐＣ遺伝子を導入して、ｐａｒｐ１遺伝子が欠損し、かつ、ｔｒｐＣ遺伝子を有する形質転換アスペルギルス・ソーヤを作製した。

５００ｍｌ容量の三角フラスコに１ｍＭ トリプトファンを含むポリペプトンデキストリン液体培地 １００ｍｌに、ＡｓｔｒｐＣ破壊株の分生子を接種し、３０℃で約２４時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト及び２０μｇのＡｓｐａｒｐ１破壊用カセットを用いて、プロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行い、次いで０．５％（ｗ／ｖ）寒天及び１．２Ｍ ソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地を用いて、３０℃、５日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換アスペルギルス・ソーヤを得た。

Ａｓｐａｒｐ１が破壊された形質転換アスペルギルス・ソーヤは、Ａｓｐａｒｐ１遺伝子の位置に挿入されたＡｓｔｒｐＣ遺伝子によって宿主のトリプトファン要求性が相補されている。

（２−５）Ａｓｐａｒｐ１破壊株の選抜
上記（１−５）の記載に準じて、形質転換株から染色体ＤＮＡを抽出してＰＣＲで確認することにより、Ａｓｐａｒｐ１遺伝子が破壊された株を選抜した。使用したプライマーは配列番号２５〜２８のプライマーである。

上記のＰＣＲを実施することにより、Ａｓｐａｒｐ１遺伝子由来の４６０ｂｐのＰＣＲ産物が生じず、破壊対象ではないＡｓＰｔｅｆプロモーター由来の７２０ｂｐのＰＣＲ産物が生じたことをアガロースゲル電気泳動により確認した。アガロースゲル電気泳動の結果を図４Ａに示す。図４Ａに示すとおり、形質転換株２、６及び７では、ｐａｒｐ１遺伝子のＰＣＲ産物（ＰＡＲＰ）が生じなかった。

選抜したＡｓｐａｒｐ１破壊株について、ＰＣＲを行うことにより、Ａｓｐａｒｐ１破壊用カセットが相同組換えで導入されたことをアガロースゲル電気泳動により確認した。使用したプライマーは配列番号２９〜３０のプライマーである。

アガロースゲル電気泳動の結果を図４Ｂに示す。図４Ｂに示すとおり、上記の形質転換株２、６及び７のうち、形質転換株２及び７では９．６ｋｂのＰＣＲ産物が生じた。なお、宿主では、５．３ｋｂのＰＣＲ産物が生じた。これにより、形質転換株２及び７（それぞれＰＡＲＰ＿２及びＰＡＲＰ＿７）をＡｓｐａｒｐ１破壊株とした。

３．導入したＡｓｔｒｐＣマーカー遺伝子の除去
（３−１）ＡｓｔｒｐＣ除去株の確認
図５に概略を示すとおり、以下の手順により、Ａｓｐａｒｐ１破壊株に導入したｔｒｐＣ遺伝子をループアウトにより除去した、ｔｒｐＣ遺伝子及びｐａｒｐ１遺伝子が除去された株を選抜した。

Ａｓｐａｒｐ１破壊株の分生子を、１ｍＭ トリプトファン及び０．０４％（ｗ／ｖ）５−ＦＡＡを含むポテトデキストロース寒天培地（日水製薬社）のプレートに塗沫し、３０℃、４日間にてインキュベートした。図５に、塗沫したＰＡＲＰ＿２及びＰＡＲＰ＿７の分生子数、出現した耐性株数及びそれらから算出された耐性株出現頻度を示す。

生じた５−ＦＡＡ耐性株から染色体ＤＮＡを抽出して配列番号２９〜３０のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ループアウトが起きてＡｓｔｒｐＣが除去されたＡｓｔｒｐＣ除去株であることをアガロースゲル電気泳動により確認した。ＰＡＲＰ＿７株より選抜した５−ＦＡＡ耐性株７株を対象としたアガロースゲル電気泳動の結果を図６Ａに示す。

図６Ａが示すととおり、ループアウトが起きることにより、想定どおりに、３．０ｋｂのＰＣＲ産物が生じた。なお、ループアウトが起きない場合は、９．６ｋｂのＰＣＲ産物を生じる。

また、ＡｓｔｒｐＣ除去株から染色体ＤＮＡを抽出して、配列番号９〜１２のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ＡｓｔｒｐＣ遺伝子由来の６９２ｂｐのＰＣＲ産物が生じず、破壊対象ではないＡｓｌｉｇ１遺伝子由来の４３９ｂｐのＰＣＲ産物が生じたことをアガロース電気泳動により確認した。ＰＡＲＰ＿７株より選抜した５−ＦＡＡ耐性株７株を対象としたアガロースゲル電気泳動の結果を図６Ｂに示す。これらの７株をＡｓｔｒｐＣ除去株として選抜した。

（３−２）トリプトファン要求性の確認
選抜したＡｓｔｒｐＣ除去株を、１ｍＭ トリプトファンを含む、又は含まないＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少寒天培地のプレートにそれぞれ植菌して、３０℃、４日間インキュベートすることにより、ＡｓｔｒｐＣ除去株は、トリプトファンを含む培地でのみ生育する、すなわちトリプトファン要求性であることを確認した。また、５−ＦＡＡを用いることにより、ＡｓｔｒｐＣが除去できることが示された。

［例２．アスペルギルス・オリゼにおけるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子としてのｔｒｐＣ遺伝子の利用］
１．ＡｏｔｒｐＣ破壊株の作製
例１と同様にして、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、相同組換えのための上流領域１（Ａｏ上流領域１）及び相同組換えのための下流領域１（Ａｏ下流領域１）のＤＮＡ断片を得た後、プラスミドｐＵＣ１９に、Ａｏ上流領域１、ＡｓｐｙｒＧ遺伝子及びＡｏ下流領域１を順に連結させたコンストラクト用プラスミドｐＡｏＴｒｐＣ＿ＨＲを作製した。使用したプライマーは配列番号３１〜３４のプライマーである。

次いで、例１と同様にして、鋳型ＤＮＡとしてプラスミドｐＡｏＴｒｐＣ＿ＨＲを用いて、ＡｏｔｒｐＣ破壊用カセットを増幅した。使用したプライマーは配列番号３５〜３６のプライマーである。

上記のようにして、Ａｏ上流領域１−ＡｓｐｙｒＧ−Ａｏ下流領域１の配列が順に連結されたＡｏｔｒｐＣ破壊用カセットを得た。

ＡｏｔｒｐＣ破壊株を作製するための宿主として、特許第５７０４６０９号公報に記載があるとおりの、アスペルギルス・オリゼＲｋｕＮ１６ｐｔｒ１株（Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２７５：４６０，２００６, Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，７０：１３５，２００６）を用いた。なお、ＲｋｕＮ１６ｐｔｒ１株ではｐｙｒＧ遺伝子及びｋｕ７０遺伝子が破壊してある。

５００ｍｌ容量の三角フラスコに１０ｍＭ ウラシルを含むポリペプトンデキストリン液体培地１００ｍｌに、アスペルギルス・オリゼＲｋｕＮ１６ｐｔｒ１株の分生子を接種し、３０℃で約２０時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト及び２０μｇのＡｏｔｒｐＣ破壊用カセットを用いて、プロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行い、次いで１ｍＭ トリプトファン、０．５％（ｗ／ｖ）寒天及び１．２Ｍ ソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地を用いて、３０℃、５日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換アスペルギルス・オリゼを得た。

ＡｏｔｒｐＣが破壊された形質転換アスペルギルス・オリゼは、ＡｏｔｒｐＣ遺伝子の位置に挿入されたＡｓｐｙｒＧ遺伝子によって宿主のウラシル／ウリジン要求性が相補され、代わりにトリプトファン要求性になる。

次いで、例１と同様にして、形質転換アスペルギルス・オリゼの染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲで確認することにより、ＡｏｔｒｐＣ遺伝子が破壊された株を選抜した。使用したプライマーは配列番号９〜１０及び３７〜３８のプライマーである。

上記のＰＣＲを実施することにより、ＡｏｔｒｐＣ遺伝子由来の６９２ｂｐのＰＣＲ産物が生じず、破壊対象ではないＡｏｌｉｇ１遺伝子由来の４６２ｂｐのＰＣＲ産物が生じたことをアガロース電気泳動により確認し、ＡｏｔｒｐＣ破壊株を選抜した。

選抜したＡｏｔｒｐＣ破壊株について、ＰＣＲ及びＰＣＲ産物の制限酵素消化処理を行うことにより、ＡｏｔｒｐＣ破壊用カセットが相同組換えで導入されたことを確認した。使用したプライマーは配列番号１４及び３９のプライマーである。

ＡｏｔｒｐＣ破壊株では、５．７ｋｂのＰＣＲ産物が生じ、これをＫｐｎＩで消化することにより２．５ｋｂ、２．１ｋｂ及び１．２ｋｂの断片が生じた。なお、宿主では、６．３ｋｂのＰＣＲ産物が生じ、これをＫｐｎＩで消化することにより３．５ｋｂ及び２．８ｋｂの断片が生じた。

ＡｏｔｒｐＣ破壊用カセットが相同組換えで導入されていることを確認したＡｏｔｒｐＣ破壊株を、１ｍＭ トリプトファンを含む、又は含まないＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少寒天培地のプレートにそれぞれ植菌して、３０℃、５日間インキュベートし、トリプトファンを含む培地でのみ生育することを確認した。

ＡｏｔｒｐＣ破壊株及び対照としてアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株を、０．１２％（ｗ／ｖ）５−ＦＡＡ及び１ｍＭ トリプトファンを含むサブローデキストロース寒天培地（ＢＤ社）のプレートに植菌し、３０℃、４日間インキュベートした。ＲＩＢ４０株は全く生育しなかったのに対し、ＡｏｔｒｐＣ破壊株は生育した。これにより、ＡｏｔｒｐＣ破壊株は５−ＦＡＡに耐性を示すことを確認した。

また、５−ＦＡＡ濃度を０．１％（ｗ／ｖ）に変えて同様に行ったところ、ＡｏｔｒｐＣ破壊株及びＲＩＢ４０株はともに生育した。したがって、アスペルギルス・オリゼに対して０．１２％（ｗ／ｖ）５−ＦＡＡを用いることにより、ＡｏｔｒｐＣ破壊株が選抜できることがわかった。

２．ＡｏｔｒｐＣマーカー遺伝子を用いた遺伝子破壊
破壊対象遺伝子として、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株の公開ゲノムデータベース（ＢｉｏＰｒｏｊｅｃｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＰＲＪＮＡ２０８０９）から、ＳＣ１０２の１４５６６１６−１４５７３７８の領域にある機能不明の予測遺伝子を用いた。該遺伝子を、ＡｏｈｙｐＧとした。

例１と同様にして、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、相同組換えのための上流領域２（Ａｏ上流領域２）、ＡｏｔｒｐＣ遺伝子、ループアウトのための領域（Ａｏループアウト領域１）及び相同組換えのための下流領域２（Ａｏ下流領域２）のＤＮＡ断片を得た後、プラスミドｐＵＣ１９に、Ａｏ上流領域２、ＡｏｔｒｐＣ遺伝子、Ａｏループアウト領域１及びＡｏ下流領域２を順に連結させたコンストラクト用プラスミドｐＡｏＨｙｐＧ＿ＬＯ＿ＴｒｐＣを作製した。使用したプライマーは配列番号２０及び４０〜４６のプライマーである。

例１と同様にして、鋳型ＤＮＡとして上記で得られたプラスミドｐＡｏＨｙｐＧ＿ＬＯ＿ＴｒｐＣを用いて、ＡｏｈｙｐＧ破壊用カセットを得た。使用したプライマーは配列番号４７〜４８のプライマーである。

上記のようにして、Ａｏ上流領域２−ＡｏｔｒｐＣ−Ａｏループアウト領域１−Ａｏ下流領域２の配列が順に連結されたＡｏｈｙｐＧ破壊用カセットを得た。

以下の手順により、ＡｏｈｙｐＧ破壊株を作製した。なお、ＡｏｈｙｐＧ破壊用カセットを用いたＡｏｔｒｐＣ破壊株の形質転換の概略を図７に示す。図７に示されているとおり、ＡｏｈｙｐＧ破壊用カセットを用いて形質転換することにより、ＡｏｔｒｐＣ破壊株の染色体上のｈｙｐＧ遺伝子の遺伝子座にｔｒｐＣ遺伝子を導入して、ｈｙｐＧ遺伝子が欠損し、かつ、ｔｒｐＣ遺伝子を有する形質転換アスペルギルス・オリゼを作製した。

５００ｍｌ容量の三角フラスコにおける１ｍＭ トリプトファンを含むポテトデキストロース液体培地（ＢＤ社）１００ｍｌに、アスペルギルス・オリゼＡｏｔｒｐＣ破壊株の分生子を接種し、３０℃で約２４時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト及び２０μｇのＡｏｈｙｐＧ破壊用カセットを用いて、プロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行い、次いで０．５％（ｗ／ｖ）寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地を用いて、３０℃、５日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換アスペルギルス・オリゼを得た。

ＡｏｈｙｐＧが破壊された形質転換アスペルギルス・オリゼは、ＡｏｈｙｐＧ遺伝子の位置に挿入されたＡｏｔｒｐＣ遺伝子によって宿主のトリプトファン要求性が相補されている。

例１と同様にして、形質転換株から染色体ＤＮＡを抽出してＰＣＲで確認することにより、ＡｏｈｙｐＧ遺伝子が破壊された株を選抜した。使用したプライマーは配列番号３７〜３８及び４９〜５０のプライマーである。

上記のＰＣＲを実施することにより、ＡｏｈｙｐＧ遺伝子由来の７０２ｂｐのＰＣＲ産物が生じず、破壊対象ではないＡｏｌｉｇ１由来の４６２ｂｐのＰＣＲ産物が生じたことをアガロース電気泳動により確認し、ＡｏｈｙｐＧ破壊株を選抜した。

選抜したＡｏｈｙｐＧ破壊株について、ＰＣＲを行うことにより、ＡｏｈｙｐＧ破壊用カセットが相同組換えで導入されたことを確認した。使用したプライマーは配列番号５１〜５２のプライマーである。

ＡｏｈｙｐＧ破壊株では、８．６ｋｂのＰＣＲ産物が生じた。なお、宿主では、４．３ｋｂのＰＣＲ産物が生じた。

３．導入したＡｏｔｒｐＣマーカー遺伝子の除去
図８に概略を示すとおり、以下の手順により、ＡｏｈｙｐＧ破壊株に導入したｔｒｐＣ遺伝子をループアウトにより除去した、ｔｒｐＣ遺伝子及びｈｙｐＧ遺伝子が除去された株を選抜した。

ＡｏｈｙｐＧ破壊株の分生子を、１ｍＭ トリプトファン及び０．１２％（ｗ／ｖ）５−ＦＡＡを含むサブローデキストロース寒天培地（ＢＤ社）のプレートに塗沫し、３０℃、５日間以上インキュベートした。

生じた５−ＦＡＡ耐性株から染色体ＤＮＡを抽出して配列番号５１〜５２のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ループアウトが起きてＡｏｔｒｐＣが除去されたＡｏｔｒｐＣ除去株であることをアガロースゲル電気泳動により確認した。生じた５−ＦＡＡ耐性株６株を対象にしたアガロースゲル電気泳動の結果を図９Ａに示す。

図９Ａが示すとおり、いずれの５−ＦＡＡ耐性株においても、ループアウトが起きることにより、想定どおりに、２．７ｋｂの産物が生じた。なお、ループアウトが起きない場合は、８．６ｋｂのＰＣＲ産物を生じる。

また、５−ＦＡＡ耐性株から染色体ＤＮＡを抽出して、配列番号９〜１０及び３７〜３８のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ＡｏｔｒｐＣ遺伝子由来の６９２ｂｐのＰＣＲ産物が生じず、破壊対象ではないＡｏｌｉｇ１遺伝子由来の４６２ｂｐのＰＣＲ産物が生じたことをアガロース電気泳動により確認した。５−ＦＡＡ耐性株６株を対象としたアガロースゲル電気泳動の結果を図９Ｂに示す。これらの６株をＡｏｔｒｐＣ除去株として選抜した。

また、例１と同様の方法によって、ＡｏｔｒｐＣ除去株は、トリプトファンを含む培地でのみ生育する、すなわちトリプトファン要求性であることを確認した。また、５−ＦＡＡを用いることにより、ＡｏｔｒｐＣが除去できることが示された。

［例３．アスペルギルス・ニガーにおけるマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子としてのｔｒｐＣ遺伝子の利用］
１．ＡｎｔｒｐＣ破壊株の作製
例１と同様にして、アスペルギルス・ニガーＡ１１７９株（ΔｋｕｓＡ、ｐｙｒＧ−；Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒから入手）の染色体ＤＮＡを鋳型として、相同組換えのための上流領域１（Ａｎ上流領域１）及び相同組換えのための下流領域１（Ａｎ下流領域１）のＤＮＡ断片を得た後、プラスミドｐＵＣ１９に、Ａｎ上流領域１、ＡｓｐｙｒＧ遺伝子及びＡｎ下流領域１を順に連結させたコンストラクト用プラスミドｐＡｎＴｒｐＣ＿ＨＲを作製した。使用したプライマーは配列番号５３〜５６のプライマーである。

次いで、例１と同様にして、鋳型ＤＮＡとしてプラスミドｐＡｎＴｒｐＣ＿ＨＲを用いて、ＡｎｔｒｐＣ破壊用カセットを増幅した。使用したプライマーは配列番号５７〜５８のプライマーである。

上記のようにして、Ａｎ上流領域１−ＡｓｐｙｒＧ−Ａｎ下流領域１の配列が順に連結されたＡｎｔｒｐＣ破壊用カセットを得た。

５００ｍｌ容量の三角フラスコの中に１０ｍＭ ウラシル及び１０ｍＭ ウリジンを含むポテトデキストロース液体培地（ＢＤ社）１００ｍｌに、アスペルギルス・ニガーＡ１１７９株の分生子を接種し、３０℃で約１６時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト及び２０μｇのＡｎｔｒｐＣ破壊用カセットを用いて、プロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行い、次いで１ｍＭ トリプトファン、０．５％（ｗ／ｖ）寒天及び１．２Ｍ ソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地を用いて、３０℃、４日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換アスペルギルス・ニガーを得た。

ＡｎｔｒｐＣが破壊された形質転換アスペルギルス・ニガーは、ＡｎｔｒｐＣ遺伝子の位置に挿入されたＡｓｐｙｒＧ遺伝子によって宿主のウラシル要求性が相補され、代わりにトリプトファン要求性になる。

次いで、例１と同様にして、形質転換アスペルギルス・ニガーの染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲで確認することにより、ＡｎｔｒｐＣ遺伝子が破壊された株を選抜した。使用したプライマーは配列番号５９〜６２のプライマーである。

上記のＰＣＲを実施することにより、ＡｎｔｒｐＣ遺伝子由来の４２０ｂｐのＰＣＲ産物が生じず、導入されたＡｓｐｙｒＧ遺伝子由来の８６２ｂｐのＰＣＲ産物が生じたことをアガロース電気泳動により確認し、ＡｎｔｒｐＣ破壊株を選抜した。

選抜したＡｎｔｒｐＣ破壊株について、ＰＣＲ及びＰＣＲ産物の制限酵素消化処理を行うことにより、ＡｎｔｒｐＣ破壊用カセットが相同組換えで導入されたことを確認した。使用したプライマーは配列番号６３〜６４のプライマーである。

ＡｎｔｒｐＣ破壊株では、５．５ｋｂのＰＣＲ産物が生じ、これをＫｐｎＩで消化することにより２．４ｋｂ、２．０ｋｂ及び１．２ｋｂの断片が生じた。なお、宿主では、６．１ｋｂのＰＣＲ産物が生じるが、該ＰＣＲ産物はＫｐｎＩで消化されなかった。

ＡｎｔｒｐＣ破壊用カセットが相同組換えで導入されていることを確認したＡｎｔｒｐＣ破壊株を、１ｍＭ トリプトファンを含む、又は含まないＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少寒天培地のプレートにそれぞれ植菌して、３０℃、７日間インキュベートし、トリプトファンを含む培地でのみ生育することを確認した。

２．ＡｎｔｒｐＣマーカー遺伝子を用いた遺伝子破壊
破壊対象遺伝子として、アスペルギルス・ニガーが有するトレハロース６リン酸合成酵素であるＴｐｓＣの遺伝子（ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １４，９０（２０１４）、［Ｗｅｂｓｉｔｅ］ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ３９９１８８４／を参照）を用いた。該遺伝子を、ＡｎｔｐｓＣとした。

例１と同様にして、アスペルギルス・ニガーＡ１１７９株の染色体ＤＮＡを鋳型として、相同組換えのための上流領域２（Ａｎ上流領域２）、ループアウトのための領域（Ａｎループアウト領域１）、ＡｎｔｒｐＣ遺伝子及び相同組換えのための下流領域２（Ａｎ下流領域２）のＤＮＡ断片を得た後、プラスミドｐＵＣ１９に、Ａｎ上流領域２、Ａｎループアウト領域１、ＡｎｔｒｐＣ遺伝子及びＡｎ下流領域２を順に連結させたコンストラクト用プラスミドｐＡｎＴｐｓＣ＿ＬＯ＿ＴｒｐＣを作製した。使用したプライマーは配列番号６５〜７２のプライマーである。

例１と同様にして、鋳型ＤＮＡとして上記で得られたプラスミドｐＡｎＴｐｓＣ＿ＬＯ＿ＴｒｐＣを用いて、ＡｎｔｐｓＣ破壊用カセットを得た。使用したプライマーは配列番号７３〜７４のプライマーである。

上記のようにして、Ａｎ上流領域２−Ａｎループアウト領域１−ＡｎｔｒｐＣ−Ａｎ下流領域２の配列が順に連結されたＡｎｔｐｓＣ破壊用カセットを得た。

以下の手順により、ＡｎｔｒｐＣ破壊株をＡｎｔｐｓＣ破壊用カセットを用いて形質転換することにより、ＡｎｔｐｓＣ破壊株を作製した。

５００ｍｌ容量の三角フラスコの中に１ｍＭ トリプトファンを含むポテトデキストロース液体培地 １００ｍｌに、アスペルギルス・ニガーＡｎｔｒｐＣ破壊株の分生子を接種し、３０℃で約１６時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト及び２０μｇのＡｎｔｐｓＣ破壊用カセットを用いて、プロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行い、次いで０．５％（ｗ／ｖ）寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地を用いて、３０℃、４日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換アスペルギルス・ニガーを得た。

ＡｎｔｐｓＣが破壊された形質転換アスペルギルス・ニガーは、ＡｎｔｐｓＣ遺伝子の位置に挿入されたＡｎｔｒｐＣ遺伝子によって宿主のトリプトファン要求性が相補されている。

例１と同様にして、形質転換株から染色体ＤＮＡを抽出してＰＣＲで確認することにより、ＡｎｔｐｓＣ遺伝子が破壊された株を選抜した。使用したプライマーは配列番号６１〜６２及び７５〜７６のプライマーである。

上記のＰＣＲを実施することにより、ＡｎｔｐｓＣ遺伝子由来の４３０ｂｐのＰＣＲ産物が生じず、導入したＡｓｐｙｒＧ遺伝子由来の８６２ｂｐのＰＣＲ産物が生じたことをアガロース電気泳動により確認し、ＡｎｔｐｓＣ破壊株を選抜した。

選抜したＡｎｔｐｓＣ破壊株について、ＰＣＲを行うことにより、ＡｎｔｐｓＣ破壊用カセットが相同組換えで導入されたことを確認した。使用したプライマーは配列番号７７〜７８のプライマーである。

ＡｎｔｐｓＣ破壊株では、９．１ｋｂのＰＣＲ産物が生じた。なお、宿主では、５．９ｋｂのＰＣＲ産物が生じた。

３．導入したＡｎｔｒｐＣマーカー遺伝子の除去
ＡｎｔｐｓＣ破壊株の分生子を、１ｍＭ トリプトファン及び０．０１５％（ｗ／ｖ）５−ＦＡＡを含むポテトデキストロース寒天培地のプレートに塗沫し、３０℃、４日間以上インキュベートした。

生じた５−ＦＡＡ耐性株から染色体ＤＮＡを抽出して配列番号７７〜７８のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ループアウトが起きてＡｎｔｒｐＣが除去されたＡｎｔｒｐＣ除去株であることを確認した。

ループアウトが起きることにより、想定どおりに、２．９ｋｂの産物が生じた。なお、ループアウトが起きない場合は、９．１ｋｂのＰＣＲ産物を生じる。

また、例１と同様の方法によって、ＡｎｔｒｐＣ除去株は、トリプトファンを含む培地でのみ生育する、すなわちトリプトファン要求性であることを確認した。また、５−ＦＡＡを用いることにより、ＡｎｔｒｐＣが除去できることが示された。

［例４．ＡｓｐｙｒＧ遺伝子及びＡｓｔｒｐＣ遺伝子を欠損した二重破壊株の作製］
以下の手順により、アスペルギルス・ソーヤのＡｓｐｙｒＧ破壊株におけるＡｓｔｒｐＣ遺伝子を、ＡｓｐｙｒＧ遺伝子で破壊した後、導入したＡｓｐｙｒＧをループアウトで除くことにより、ＡｓｐｙｒＧ・ＡｓｔｒｐＣ二重破壊株を作製した。ＡｓｐｙｒＧ・ＡｓｔｒｐＣ二重破壊株の作製手順の概略を図１０に示す。

１．ループアウト可能なＡｓｔｒｐＣ破壊用カセットの作製
例１で作製したプラスミドｐＴｒｐＣ＿ＨＲを鋳型として、Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ及びＰＣＲ産物の精製を実施することにより、ベクター断片を得た。使用したプライマーは配列番号７９〜８０のプライマーである。

アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ及びＰＣＲ産物の精製を実施することにより、ループアウトのための領域２（Ａｓループアウト領域２）を得た。使用したプライマーは配列番号８１〜８２のプライマーである。

得られたベクター断片とＡｓループアウト領域２とを用いて例１の（１−２）に記載の方法に準じて連結し、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトに、Ａｓ上流領域１−Ａｓループアウト領域２−ＡｓｐｙｒＧ−Ａｓ下流領域１の配列が順に連結されたプラスミドを得た。得られたプラスミドをｐＴｒｐＣ＿ＬＯ＿ｐｙｒＧとした。

次いで、例１の（１−３）と同様にして、鋳型ＤＮＡとしてプラスミドプラスミドｐＴｒｐＣ＿ＬＯ＿ｐｙｒＧを用いて、ループアウト可能なＡｓｔｒｐＣ破壊用カセットを増幅した。使用したプライマーは配列番号７〜８のプライマーである。

上記のようにして、Ａｓ上流領域１−Ａｓループアウト領域２−ＡｓｐｙｒＧ−Ａｓ下流領域１の配列が順に連結されたループアウト可能なＡｓｔｒｐＣ破壊用カセットを得た。

２．ＡｓｔｒｐＣ破壊株の作製
例１の（１−４）に記載の方法に準じて、ループアウト可能なＡｓｔｒｐＣ破壊用カセットを用いて、アスペルギルス・ソーヤＫＰ−ｄｅｌ株を形質転換することにより、形質転換アスペルギルス・ソーヤを得た。

ＡｓｔｒｐＣが破壊された形質転換アスペルギルス・ソーヤは、ＡｓｔｒｐＣ遺伝子の位置に挿入されたＡｓｐｙｒＧ遺伝子によって宿主のウラシル／ウリジン要求性が相補され、代わりにトリプトファン要求性になる。

形質転換アスペルギルス・ソーヤが生じたプレートから、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０溶液を用いて分生子を回収した。同溶液で適宜希釈した分生子懸濁液を０．０４％（ｗ／ｖ）５−ＦＡＡ及び１ｍＭ トリプトファンを含むポテトデキストロース寒天培地のプレートに塗沫し、３０℃、４日間インキュベートした。

生じた５−ＦＡＡ耐性株を、１ｍＭ トリプトファンを含む、又は含まないＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少寒天培地のプレートにそれぞれ植菌して、３０℃、４日間インキュベートし、トリプトファンを含む培地でのみ生育する株、すなわち、トリプトファン要求性を示す株を選抜した。

トリプトファン要求性の株から染色体ＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ及びＰＣＲ産物の制限酵素消化を行うことにより、ループアウト可能なＡｓｔｒｐＣ破壊用カセットが相同組換えで導入されていることをアガロースゲル電気泳動により確認した。使用したプライマーは配列番号１３及び８３のプライマーである。

ＡｓｔｒｐＣ破壊株では、８．８ｋｂのＰＣＲ産物が生じ、これをＢａｍＨＩで消化しても切断されなかった。なお、宿主では、８．２ｋｂのＰＣＲ産物が生じ、これをＢａｍＨＩで消化することにより４．３ｋｂ及び３．８ｋｂの断片が生じた。

３．ＡｓｐｙｒＧ・ＡｓｔｒｐＣ二重破壊株の作製
上記で得たＡｓｔｒｐＣ破壊株の分生子を、１ｍＭ トリプトファン、２０ｍＭ ウラシル及び０．３％（ｗ／ｖ）５−ＦＯＡを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少寒天培地のプレートに塗沫し、３０℃、５日間以上インキュベートすることにより、５−ＦＯＡ耐性株を選抜した。なお、５−ＦＯＡ（５−フルオロオロチン酸；Ｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍ社）は、１．２％水溶液をｐＨ６に調整し、次いでフィルターろ過滅菌したものを、最終濃度が上記濃度になるように培地に添加して使用した。

５−ＦＯＡ耐性株から染色体ＤＮＡを抽出して、配列番号１３及び８３のプライマーを使用してＰＣＲを行うことにより、５−ＦＯＡ耐性株は、ループアウトが起きることによってＡｓｔｒｐＣ破壊株からさらにＡｓｐｙｒＧ遺伝子が除去されたＡｓｐｙｒＧ・ＡｓｔｒｐＣ二重破壊株であることを確認した。すなわち、該ＰＣＲにより、ループアウト後に想定されるとおりの３．９ｋｂのＰＣＲ産物が生じたことを確認した。なお、上記のとおりに、ループアウト前に得られるＰＣＲ産物は８．８ｋｂである。

４．トリプトファン要求性及びウラシル要求性の確認
ＡｓｐｙｒＧ・ＡｓｔｒｐＣ二重破壊株を下記（１）〜（４）に示す４種の寒天培地のプレートに植菌し、３０℃、５日間以上インキュベートした。
（１）Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少寒天培地
（２）１ｍＭ トリプトファンを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少寒天培地
（３）２０ｍＭ ウラシルを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少寒天培地
（４）１ｍＭ トリプトファン及び２０ｍＭ ウラシルを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少寒天培地

ＡｓｐｙｒＧ・ＡｓｔｒｐＣ二重破壊株は、上記（４）のトリプトファン及びウラシルを含む培地のみで生育し、トリプトファン及びウラシルの両方に対して要求性を示すことを確認した。

５．５−ＦＯＡ耐性及び５−ＦＡＡ耐性の確認
非破壊株（アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株）、ＡｓｐｙｒＧ破壊株（アスペルギルス・ソーヤＫＰ−ｄｅｌ株）、ＡｓｔｒｐＣ破壊株（例１で作製）及びＡｓｐｙｒＧ・ＡｓｔｒｐＣ二重破壊株を用いて、以下の手順により、これらの菌株の５−ＦＯＡ耐性及び５−ＦＡＡ耐性を評価した。

１ｍＭ トリプトファン、２０ｍＭ ウラシル並びに表３に示す濃度の５−ＦＯＡ及び５−ＦＡＡを含むポテトデキストロース寒天培地のプレートに植菌し、３０℃、４日間インキュベートした。プレートにおけるコロニーの形成の有無により、各菌株の５−ＦＯＡ耐性及び５−ＦＡＡ耐性を確認した。

「＋」：生育、「−」：生育せず

ＡｓｐｙｒＧ破壊株及びＡｓｔｒｐＣ破壊株は、それぞれ培地中に５−ＦＡＡ及び５−ＦＯＡが存在することにより、生育することができなかった。

例１ではΔｔｒｐＣ株の選抜に０．０４％（ｗ／ｖ）５−ＦＡＡを用いた。また、例４では、ΔｐｙｒＧ株の選抜に０．３％（ｗ／ｖ）５−ＦＯＡを用いた。しかし、表３が示すとおり、これらを単独で用いる際の薬剤濃度（０．３％（ｗ／ｖ）５−ＦＯＡ及び０．０４％（ｗ／ｖ）５−ＦＡＡ）での併用ではいずれの菌株も生育しなかった。

一方、両薬剤濃度を１／２、さらに１／４に下げて用いたところ、ＡｓｐｙｒＧ・ＡｓｔｒｐＣ二重破壊株のみが生育した。濃度を１／４に下げても効果を示したことから、５−ＦＯＡ及び５−ＦＡＡは相乗的に効果を示すことが明らかになった。このような培地を用いることでＡｓｐｙｒＧ・ＡｓｔｒｐＣ二重破壊株を選抜できることが判明した。

［例５．マーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子としてのｐｙｒＧ遺伝子及びｔｒｐＣ遺伝子の同時使用］
１．Ａｓｎｐｈ破壊用カセットの作製
破壊対象遺伝子として、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株の公開ゲノムデータベース（ＢｉｏＰｒｏｊｅｃｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＰＲＪＤＡ６０２６５）から、ｓｃａｆｆｏｌｄ０００３３の１９０４０８２−１９０５２４４の領域に予測されるプロテアーゼの遺伝子を対象とすることにした。該遺伝子を、Ａｓｎｐｈ遺伝子とした。

例１の（１−２）に記載の方法に準じて、プラスミドｐＵＣ１９に、相同組換えのための上流領域２（Ａｓ上流領域３）、ループアウトのための領域３（Ａｓループアウト領域３）、ＡｓｐｙｒＧ遺伝子及び相同組換えのための下流領域３（Ａｓ下流領域３）を順に連結させたプラスミドｐＮｐＨ＿ＬＯ＿ｐｙｒＧを作製した。使用したプライマーは配列番号８４〜８９のプライマーである。なお、ＡｓｐｙｒＧ遺伝子のＤＮＡ断片は例１の（１−２）で作製したものを用いた。

得られたプラスミドｐＮｐＨ＿ＬＯ＿ｐｙｒＧを鋳型ＤＮＡとして用いて、上記（１−３）の記載に準じてＰＣＲ及びＰＣＲ産物の精製を実施することにより、Ａｓｎｐｈ破壊用カセットを得た。使用したプライマーは配列番号９０〜９１のプライマーである。

上記のようにして、Ａｓ上流領域３−Ａｓループアウト領域３−ＡｓｐｙｒＧ−Ａｓ下流領域３の配列が順に連結されたＡｓｎｐｈ破壊用カセットを得た。

２．Ａｓｐａｒｐ１・Ａｓｎｐｈ二重破壊株の作製
Ａｓｐａｒｐ１破壊用カセット及びＡｓｎｐｈ破壊用カセットを用いたＡｓｐｙｒＧ・ＡｓｔｒｐＣ二重破壊株の形質転換によるＡｓｐａｒｐ１・Ａｓｎｐｈ二重破壊株の作製から、ＡｓｐｙｒＧマーカー遺伝子及びＡｓｔｒｐＣマーカー遺伝子をループアウトさせて得られるＡｓｐｙｒＧ・ＡｓｔｒｐＣ二重除去株の作製までの手順の概略を図１１に示す。

５００ｍｌ容量の三角フラスコにおいて１ｍＭ トリプトファン、２０ｍＭ ウラシル及び２０ｍＭ ウリジンを含むポテトデキストロース液体培地 １００ｍｌに、例４で作製したアスペルギルス・ソーヤＡｓｐｙｒＧ・ＡｓｔｒｐＣ二重破壊株の分生子を接種し、３０℃で約２４時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト並びに２０μｇのＡｓｐａｒｐ１破壊用カセット（例１で作製したもの）及び２０μｇのＡｓｎｐｈ破壊用カセットを用いて、プロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行い、次いで０．５％（ｗ／ｖ）寒天及び１．２Ｍ ソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地を用いて、３０℃、５日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換アスペルギルス・ソーヤを得た。

宿主であるＡｓｐｙｒＧ・ＡｓｔｒｐＣ二重破壊株のウラシル要求性及びトリプトファン要求性は導入したＡｓｐｙｒＧ遺伝子及びＡｓｔｒｐＣ遺伝子によってそれぞれ相補される。なお、片方のみが相補された株は上記培地では生育できない。

上記（１−５）の記載に準じて、形質転換株から染色体ＤＮＡを抽出してＰＣＲで確認することにより、Ａｓｐａｒｐ１遺伝子及びＡｓｎｐｈ遺伝子の両方が破壊された株を選抜した。使用したプライマーは配列番号２５〜２８及び９２〜９３のプライマーである。

上記のＰＣＲを実施することにより、Ａｓｐａｒｐ１遺伝子由来の４６０ｂｐのＰＣＲ産物及びＡｓｎｐｈ由来の２９１ｂｐのＰＣＲ産物が生じず、破壊対象ではないＡｓＰｔｅｆプロモーター由来の７２０ｂｐのＰＣＲ産物が生じたことをアガロース電気泳動により確認した。アガロースゲル電気泳動の結果を図１２に示す。図１２に示す形質転換株７、９及び１３をＡｓｐａｒｐ１・Ａｓｎｐｈ二重破壊株として選抜した。

選抜したＡｓｐａｒｐ１・Ａｓｎｐｈ二重破壊株について、ＰＣＲで確認することにより、Ａｓｐａｒｐ１破壊用カセット及びＡｓｎｐｈ破壊用カセットが共に相同組換えで導入されていることを確認した。使用したプライマーは配列番号２９〜３０及び９４〜９５のプライマーである。

Ａｓｐａｒｐ１遺伝子が破壊されていることにより９．６ｋｂのＰＣＲ産物が生じた。なお、宿主では５．３ｋｂのＰＣＲ産物が生じた。また、Ａｓｎｐｈ遺伝子が破壊されていることにより８．５ｋｂのＰＣＲ産物が生じた。なお、宿主では５．９ｋｂのＰＣＲ産物が生じた。

３．導入したＡｓｐｙｒＧマーカー遺伝子及びＡｓｔｒｐＣマーカー遺伝子の除去
（３−１）同時ループアウト
Ａｓｐａｒｐ１・Ａｓｎｐｈ二重破壊株の分生子を、１ｍＭ トリプトファン、２０ｍＭ ウラシル、０．０８％（ｗ／ｖ）５−ＦＯＡ及び０．０１％（ｗ／ｖ）５−ＦＡＡを含むポテトデキストロース寒天培地のプレートに塗沫し、３０℃、１０日間以上インキュベートした。

生じた５−ＦＯＡ耐性・５−ＦＡＡ耐性株を同組成の寒天培地のプレートに植菌し、３０℃、４日間にてインキュベートすることにより生育することを確認した。

生育を確認した株から染色体ＤＮＡを抽出して、配列番号２９〜３０、９４〜９５、９〜１０、１１〜１２及び６１〜６２のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ＡｓｐｙｒＧマーカー遺伝子及びＡｓｔｒｐＣマーカー遺伝子が除去された株であることをアガロースゲル電気泳動により確認した。上記２において、Ａｓｐａｒｐ１・Ａｓｎｐｈ二重破壊株として選抜した形質転換株１３のループアウト後の３株を対象としたアガロースゲル電気泳動の結果を図１３Ａ〜図１３Ｂに示す。

図１３Ａが示すとおり、本来Ａｓｐａｒｐ１遺伝子が存在していた領域付近でループアウトが起きることにより、想定どおりに、３．０ｋｂの産物が生じた。なお、ループアウトが起きない場合は、９．６ｋｂのＰＣＲ産物を生じる。

図１３Ｂが示すとおり、本来Ａｓｎｐｈ遺伝子が存在していた領域付近でループアウトが起きることにより、想定どおりに、３．４ｋｂの産物が生じた。なお、ループアウトが起きない場合は、８．５ｋｂのＰＣＲ産物を生じる。

ＡｓｐｙｒＧ遺伝子由来の８６２ｂｐのＰＣＲ産物及びＡｓｔｒｐＣ遺伝子由来の６９２ｂｐのＰＣＲ産物が生じず、破壊対象ではないＡｓｌｉｇ１遺伝子由来の４３９ｂｐのＰＣＲ産物が生じたことをアガロース電気泳動により確認した。結果を図１３Ｃに示す。これらの結果より、上記形質転換株１３のループアウト後の３株をＡｓｐｙｒＧ・ＡｓｔｒｐＣ二重除去株として選抜した。

ＡｓｐｙｒＧ・ＡｓｔｒｐＣ二重除去株を下記（１）〜（４）に示す４種の寒天培地のプレートに植菌し、３０℃、５日間以上インキュベートした。
（１）Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少寒天培地
（２）１ｍＭ トリプトファンを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少寒天培地
（３）２０ｍＭ ウラシルを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少寒天培地
（４）１ｍＭ トリプトファン及び２０ｍＭ ウラシルを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少寒天培地

ＡｓｐｙｒＧ・ＡｓｔｒｐＣ二重除去株は、上記（４）のトリプトファン及びウラシルを含む培地のみで生育し、トリプトファン及びウラシルの両方に対して要求性を示すことを確認した。これにより、２種マーカー遺伝子の同時ループアウトができたことが確認された。

（３−２）２段階ループアウト
Ａｓｐａｒｐ１・Ａｓｎｐｈ二重破壊株の分生子を、２０ｍＭ ウラシル及び０．３％（ｗ／ｖ）５−ＦＯＡを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少寒天培地のプレートに塗沫し、３０℃、５日間以上インキュベートした。５−ＦＯＡ耐性株（ＡｓｐｙｒＧ除去株）が生じたプレートから、０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０溶液を用いて分生子を回収し、同溶液で適宜希釈することこにより、分生子懸濁液を調製した。

得られた分生子懸濁液の適量を、１ｍＭ トリプトファン、２０ｍＭ ウラシル、０．０８％（ｗ／ｖ）５−ＦＯＡ及び０．０１％（ｗ／ｖ）５−ＦＡＡを含むポテトデキストロース寒天培地のプレートに塗沫し、３０℃、４日間にてインキュベートした。

生じた５−ＦＯＡ・５−ＦＡＡ耐性株を同組成の寒天培地のプレートに植菌し、３０℃、４日間にてインキュベートすることにより生育することを確認した。

生育を確認した株から染色体ＤＮＡを抽出して、上記例５の（３−１）に記載の方法により、ＰＣＲを行うことにより、ＡｓｐｙｒＧマーカー遺伝子及びＡｓｔｒｐＣマーカー遺伝子が除去されたＡｓｐｙｒＧ・ＡｓｔｒｐＣ二重除去株であることを確認した。

また、上記例５の（３−１）に記載の方法により、ＡｓｐｙｒＧ・ＡｓｔｒｐＣ二重除去株は、ウラシル及びトリプトファンの両方に対して要求性を示すことを確認した。これにより、２種マーカー遺伝子の２段階ループアウトができたことが確認された。

本発明の一態様である形質転換アスペルギルス属微生物、組成物及び方法は、食品産業において利用価値が高いアスペルギルス属微生物の形質転換を効率良く実施することができ、さらにアスペルギルス属微生物が有する構造若しくは機能が類似又は関連する遺伝子の同時破壊による新たな表現型を迅速に検出することが可能である。

Claims (11)

1. 染色体上の少なくとも２種類のマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子が欠損した、形質転換アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）微生物であって、前記選択マーカー遺伝子はトリプトファン生合成遺伝子及びトリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子を含む、前記形質転換アスペルギルス属微生物。
2. 相同組換え領域の間にループアウト領域及びマーカーリサイクル法に利用可能な選択マーカー遺伝子を含む核酸断片の少なくとも２種類を含む、アスペルギルス属微生物形質転換用組成物であって、前記核酸断片は、前記選択マーカー遺伝子がトリプトファン生合成遺伝子である核酸断片及び前記選択マーカー遺伝子がトリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子である核酸断片を含む、前記組成物。
3. 前記形質転換アスペルギルス属微生物は、宿主生物がアスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）以外のアスペルギルス属微生物である、請求項１〜２のいずれか１項に記載の形質転換アスペルギルス属微生物又は組成物。
4. 前記トリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子は、栄養性物質の要求性を相補し、かつ、該栄養性物質のアナログからの毒性物質の生合成に関与する遺伝子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の形質転換アスペルギルス属微生物又は組成物。
5. 前記トリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子は、ウラシル生合成遺伝子、硫酸塩代謝遺伝子及び硝酸塩代謝遺伝子からなる群から選ばれる選択マーカー遺伝子である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の形質転換アスペルギルス属微生物又は組成物。
6. 前記トリプトファン生合成遺伝子はｔｒｐＣ遺伝子であり、かつ、トリプトファン生合成遺伝子とは異なる遺伝子は、ｐｙｒＧ遺伝子、ｎｉａＤ遺伝子及びｓＣ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の形質転換アスペルギルス属微生物又は組成物。
7. 下記の工程（１）〜工程（３）を含む、染色体上のマーカーリサイクル法に利用可能な第１の選択マーカー遺伝子及びマーカーリサイクル法に利用可能な第２の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物の製造方法であって、該第１の選択マーカー遺伝子及び該第２の選択マーカー遺伝子は、いずれか一方がトリプトファン生合成遺伝子であり、他方が栄養性物質の要求性を相補し、かつ、該栄養性物質のアナログからの毒性物質の生合成に関与する遺伝子である、前記方法：
   （１）染色体上の第１の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を、相同組換え領域の間にループアウト領域及び第１の選択マーカー遺伝子を含む核酸断片を用いて、染色体上の第２の選択マーカー遺伝子を標的として相同組換えすることにより、形質転換アスペルギルス属微生物を得る工程；
   （２）前記工程（１）で得られた形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第２の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の存在下で培養することにより、染色体上に前記第１の選択マーカー遺伝子が挿入され、かつ、染色体上の第２の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程；及び、
   （３）前記工程（２）で選抜された形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第１の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び栄養性物質のアナログ並びに前記第２の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の存在下で培養することにより、染色体上の前記第１の選択マーカー遺伝子及び前記第２の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。
8. 下記の工程（Ａ）〜工程（Ｂ）を含む、マーカーリサイクル法に利用可能な第１の選択マーカー遺伝子及びマーカーリサイクル法に利用可能な第２の選択マーカー遺伝子を利用した、形質転換アスペルギルス属微生物の染色体上の２種類の標的遺伝子の欠損方法であって、該第１の選択マーカー遺伝子及び該第２の選択マーカー遺伝子は、いずれか一方がトリプトファン生合成遺伝子であり、他方が栄養性物質の要求性を相補し、かつ、該栄養性物質のアナログからの毒性物質の生合成に関与する遺伝子である、前記方法：
   （Ａ）染色体上の第１の選択マーカー遺伝子及び第２の選択マーカー遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を、第１の標的遺伝子に対する相同組換え領域の間にループアウト領域及び第１の選択マーカー遺伝子を含む第１の核酸断片及び第２の標的遺伝子に対する相同組換え領域の間にループアウト領域及び第２の選択マーカー遺伝子を含む第２の核酸断片を用いて、該第１の標的遺伝子及び該第２の標的遺伝子を標的として相同組換えすることにより、形質転換アスペルギルス属微生物を得る工程；及び
   （Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第１の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び前記第２の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質の非存在下で培養することにより、染色体上に前記第１の選択マーカー遺伝子及び前記第２の選択マーカー遺伝子が挿入された形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。
9. さらに下記の工程（Ｃ）を含む、請求項８に記載の方法：
   （Ｃ）前記工程（Ｂ）で選抜された形質転換アスペルギルス属微生物を、前記第１の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログ並びに前記第２の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質及び該栄養性物質のアナログの存在下で培養することにより、染色体上の前記第１の選択マーカー遺伝子、前記第２の選択マーカー遺伝子、前記第１の標的遺伝子及び前記第２の標的遺伝子が欠損した形質転換アスペルギルス属微生物を選抜する工程。
10. 前記第１の選択マーカー遺伝子はトリプトファン生合成遺伝子であり、前記第１の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質のアナログは５−ＦＡＡであり、及び該５−ＦＡＡの濃度は０．００５％（ｗ／ｖ）〜０．０２％（ｗ／ｖ）であり、かつ、
    前記第２の選択マーカー遺伝子はｐｙｒＧ遺伝子であり、前記第２の選択マーカー遺伝子に対応する栄養性物質のアナログは５−ＦＯＡであり、及び該５−ＦＯＡの濃度は０．０５％（ｗ／ｖ）〜０．１５％（ｗ／ｖ）である、請求項９に記載の方法。
11. 前記形質転換アスペルギルス属微生物は、宿主生物がアスペルギルス・アクレアタス以外のアスペルギルス属微生物である、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。