CN112111415B - 一种pyrG筛选标记循环利用的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的pyrG筛选标记循环利用的方法及其应用，属于生物技术领域。该方法可从真菌基因组中剔除pyrG筛选标记而不依赖于pyrG两端的同向重复序列，不会在基因组上残留多余重复序列片段，剔除pyrG的重组菌能再次作为出发菌株使用pyrG进行遗传转化，实现pyrG筛选标记的循环利用。本发明的pyrG循环利用方法适用于以乳清苷‑5’‑磷酸脱羧酶编码基因URA3/pyrG表达元件作为遗传筛选标记的真菌，操作简便易行，不影响菌株遗传背景和性状，应用前景广阔。

Description

一种pyrG筛选标记循环利用的方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新的pyrG筛选标记循环利用的方法及应用。

背景技术

真菌是自然界的一大类真核生物。它们之中有的为人类提供了食物，有的成为对人类有益的工、农业菌种，也有对人类有害的致病种类。在功能基因组时代，遗传操作体系的建立对进一步利用有益真菌和防治真菌病害，都离不开对这些真菌开展研究和遗传操作。在遗传转化过程中，需要快速筛选到目标转化子，后续转化子的传代培养也要避免重组基因的丢失，保持转基因所获得的新的遗传特性。这些都必须依赖高效、特异的遗传筛选标记，利用特定的培养基，使真菌在特定的筛选压力下进行选择性培养。

乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因URA3/pyrG是一类常用的真菌遗传转化营养缺陷筛选标记，其编码产物是真菌尿嘧啶核苷酸合成过程中的关键酶，突变或敲除该基因使乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶失活或缺失，表现为尿苷或尿嘧啶营养缺陷，只能通过外源添加尿苷或尿嘧啶才能在培养基上生长。URA3筛选标记最早是在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）转化中应用的，后来扩大应用到其他酵母科真菌的转化筛选，如白念珠菌（Candida albicans）（Botstein D et al. Gene, 1979, 8(1): 17-24；Struhl K et al.PNAS, 1979, 76(3): 1035-1039；Boeke JD et al. Molecular and General GeneticsMGG, 1984, 197(2): 345-346；Huang G, et al. PNAS, 2006, 103(34):12813-12818.）。由于尿嘧啶生物合成途径非常保守，在丝状真菌中也有相似的合成过程。黄曲霉（Aspergillus flavus）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）和土曲霉（Aspergillus terreus）等真菌中的pyrG基因都与酿酒酵母URA3基因同源，在遗传转化中也得到广泛应用（Nie X et al. J Agric Food Chem, 2016, 64(35):6772-6782；Du T etal. Fungal Genet Biol, 2019, 128:20-28；Christmann M et al. PLoS Genet. 2013,9(2):e1003275；Zhang MK et al. J Agric Food Chem, 2018, 66(21):5401-5409；Kobayashi T et al. Biosci Biotechnol Biochem, 2017, 81(5):1041-1050.）。

除了URA3/pyrG筛选标记外，还有一些常见的筛选标记，如氮源和碳源营养缺陷标记基因、药物抗性标记基因等。但在菌株间进行性状比较时，携带不同的筛选标记会造成菌株间遗传背景的不同和性状的差异，从而影响研究结果的准确性。URA3/pyrG环出系统的出现解决了这一难题。该系统仅用URA3/pyrG一个筛选标记，配合5-氟乳清酸（5-FOA）的负筛选，使URA3/pyrG筛选标记插入真菌细胞的基因组-环出-再插入-再环出，如此循环使用，进行多次遗传操作（Chang PK et al. J Microbiol Methods, 2010, 81(3):240-6；Kumakura N et al. Mol Plant Pathol, 2019, 20(3):447-459.）。但该URA3/pyrG环出系统在应用中也存在缺陷：比如使用该系统前必须先要在URA3/pyrG基因两端分别插入一段同向的重复序列，该操作过程繁琐耗时，且由于两段同向重复序列的存在，PCR扩增基因重组片段时特别容易造成引物的错配，出现非特异条带；此外，URA3/pyrG环出后会在基因组上残留一段重复序列，该重复序列对菌株的性状是否有影响还未可知。

针对上述问题，本发明人经过广泛研究，建立了一种新的pyrG筛选标记循环利用的方法。该方法不依赖于pyrG基因两端的同向重复序列，因此在PCR扩增基因改造片段时操作简便、扩增特异性高，不易因引物的错配而出现非特异条带，且从转化子基因组中剔除pyrG筛选标记后不会在基因组上残留多余重复序列，不会对菌株的遗传背景和性状研究造成干扰。该新的pyrG筛选标记循环利用方法适用于以乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因URA3/pyrG作为遗传筛选标记的真菌，应用前景广阔。

发明内容

为解决真菌遗传转化操作过程中遗传筛选标记受限、不同遗传筛选标记对真菌遗传背景和性状研究造成影响以及传统URA3/pyrG环出系统存在的重复序列残留问题，本发明提供了一种新的乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因pyrG遗传筛选标记循环利用的方法。该方法仅需一个pyrG遗传筛选标记的循环利用即可实现多次遗传转化操作，避免不同遗传筛选标记的差异对真菌遗传背景和性状研究造成影响，且用该方法剔除基因组中的pyrG遗传筛选标记不需要依赖同向重复序列，剔除pyrG筛选标记后在基因组上也不会残留重复序列，不影响重组菌的遗传背景和性状。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

以基因组上整合了乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶编码基因pyrG筛选标记的重组菌为出发菌制备原生质体；将pyrG整合位点上、下游DNA融合片段导入重组菌原生质体细胞，并在含有5-氟乳清酸、尿苷和尿嘧啶的培养基上培养，筛选剔除pyrG筛选标记重组菌，所获得的重组菌即可再次作为出发菌，循环利用pyrG筛选标记进行遗传转化（如图1所示）。

优选的，所述出发菌，为黄曲霉（A. flavus），更优选的，为敲除了ku70基因的黄曲霉。

优选的，所述pyrG筛选标记来源于曲霉,更优选的,来源于烟曲霉（A. fumigatus）。

优选的，pyrG整合位点上、下游DNA融合片段为包含pyrG整合位点上游的核苷酸片段和pyrG整合位点下游的核苷酸片段的融合核苷酸片段，更优选的，pyrG整合位点上、下游DNA融合片段所包含pyrG整合位点上、下游核苷酸片段的长度均大于1.0 kb。

优选的，5-氟乳清酸负筛选为在培养基中添加5-氟乳清酸、尿苷和尿嘧啶来培养真菌，筛选pyrG基因缺失的尿嘧啶营养缺陷型菌株，更优选的，在培养基中添加的5-氟乳清酸工作浓度为2 mg/ml，尿苷和尿嘧啶的终浓度均为1 g/L 。

所述方法的步骤如下：

1）以pyrG基因缺失的尿嘧啶营养缺陷型黄曲霉为受体菌，通过PCR法将需进行基因改造的任一DNA片段、同源重组臂及源于烟曲霉的pyrG基因表达元件一起构建融合片段，将该融合片段导入上述黄曲霉受体菌的原生质体，获得基因组上整合有pyrG筛选标记的重组菌；

2）制备步骤1）中所述重组菌的原生质体，通过PCR法构建包含步骤1）所述重组菌的pyrG筛选标记整合位点上、下游DNA片段的融合片段，将该融合片段导入重组菌原生质体，并在含有5-氟乳清酸、尿苷和尿嘧啶的培养基上培养，筛选获得剔除pyrG筛选标记的重组菌，该重组菌可再次作为出发菌循环利用pyrG筛选标记进行遗传转化。

烟曲霉pyrG表达元件（SEQ 1）：

GCCTCAAACAATGCTCTTCACCCTCTTCGCGGGTCTGAAATACCCTCACCTGGCAACAGCAATTGGCGCTTCATGGCTGTTTTTCCGATCTCTCTACTTGTACGGCTATGTGTACTCGGGTAAGCCACAAGGCAAGGGCAGATTGCTGGGAGGTTTCTTCTGGTTTTCTCAAGGCGCTCTGTGGGCTCTGAGTGTGTTTGGTGTTGCCAAAGACATGATCTCTTACTGAGAGTTATTCTGTGTCTGACGAAATATGTTGTGTATATATATATATGTACGTTAAAAGTTCCGTGGAGTTACCAGTGATTGACCAATGTTTTATCTTCTACAGTTCTGCCTGTCTACCCCATTCTAGCTGTACCTGACTACAGAGTAGTTTAATTGTGGTTGACCCCACAGTCGGAGGCGGAGGAATACAGCACCGATGTGGCCTGTCTCCATCCAGATTGGCACGCAATTTTTACACGCGGAAAAGATCGAGATAGAGTACGACTTTAAATTTAGTCCCCGGCGGCTTCTATTTTAGAATATTTGAGATTTGATTCTCAAGCAATTGATTTGGTTGGGTCACCCTCAATTGGATAATATACCTCATTGCTCGGCTACTTCAACTCATCAATCACCGTCATACCCCGCATATAACCCTCCATTCCCACGATGTCGTCCAAGTCGCAATTGACTTACGGTGCTCGAGCCAGCAAGCACCCCAATCCTCTGGCAAAGAGACTTTTTGAGATTGCCGAAGCAAAGAAGACAAACGTTACCGTCTCTGCTGATGTGACGACAACCCGAGAACTCCTGGACCTCGCTGACCGTACGGAAGCTGTTGGATCCAATACATATGCCGTCTAGCAATGGACTAATCAACTTTTGATGATACAGGTCTCGGTCCCTACATCGCCGTCATCAAGACACACATCGACATCCTCACCGATTTCAGCGTCGACACTATCAATGGCCTGAATGTGCTGGCTCAAAAGCACAACTTTTTGATCTTCGAGGACCGCAAATTCATCGACATCGGCAATACCGTCCAGAAGCAATACCACGGCGGTGCTCTGAGGATCTCCGAATGGGCCCACATTATCAACTGCAGCGTTCTCCCTGGCGAGGGCATCGTCGAGGCTCTGGCCCAGACCGCATCTGCGCAAGACTTCCCCTATGGTCCTGAGAGAGGACTGTTGGTCCTGGCAGAGATGACCTCCAAAGGATCGCTGGCTACGGGCGAGTATACCAAGGCATCGGTTGACTACGCTCGCAAATACAAGAACTTCGTTATGGGTTTCGTGTCGACGCGGGCCCTGACGGAAGTGCAGTCGGATGTGTCTTCAGCCTCGGAGGATGAAGATTTCGTGGTCTTCACGACGGGTGTGAACCTCTCTTCCAAAGGAGATAAGCTTGGACAGCAATACCAGACTCCTGCATCGGCTATTGGACGCGGTGCCGACTTTATCATCGCCGGTCGAGGCATCTACGCTGCTCCCGACCCGGTTGAAGCTGCACAGCGGTACCAGAAAGAAGGCTGGGAAGCTTATATGGCCAGAGTATGCGGCAAGTCATGATTTCCTCTTGGAGCAAAAGTGTAGTGCCAGTACGAGTGTTGTGGAGGAAGGCTGCATACATTGTGCCTGTCATTAAACGATGAGCTCGTCCGTATTGGCCCCTGTAATGCCATGTTTTCCGCCCCCAATCGTCAAGGTTTTCCCTTTGTTAGATTCCTACCAGTCATCTAGCAAGTGAGGTAAGCTTTGCCAGAAACGCCAAGGCTTTATCTATGTAGTCGATAAGCAAAGTGGACTGATAGCTTAATATGGAAGGTCCCTCAGGACAAGTCGACCTGTGCAGAAGAGATAACAGCTTGGCATCACGCATCAGTGCCTCCTCTCAGAC。

本发明的优点与应用：

本发明提供的pyrG遗传筛选标记循环利用的方法解决了真菌遗传转化操作过程中遗传筛选标记受限、不同遗传筛选标记的差异对真菌遗传背景和性状研究造成影响的问题，本发明的方法仅需一个pyrG遗传筛选标记的循环利用即可实现多次遗传转化操作，使多基因、多位点的真菌遗传改造不再受遗传筛选标记的限制，同时能够避免不同遗传筛选标记的差异对真菌遗传背景和性状造成影响，使研究结果的更为准确性。

本发明提供的pyrG遗传筛选标记循环利用的方法优于传统的URA3/pyrG环出系统，操作简单易行，不需要繁琐地在URA/pyrG两端插入重复序列，按常规方法用pyrG遗传筛选标记进行任一基因改造所获得的重组菌，均可用本发明提供的方法剔除pyrG遗传筛选标记，且不存在传统URA3/pyrG环出系统在真菌基因组上残留重复序列的问题，不影响菌株的遗传背景。

本发明提供的pyrG遗传筛选标记循环利用的方法应用范围广范，凡是以乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因URA3/pyrG表达元件作为遗传筛选标记遗传筛选标记的真菌，均可使用本发明的方法剔除URA3/pyrG遗传筛选标记。

附图说明

图1 本发明所述pyrG筛选标记循环利用方法的示意图。其中“pyrG+重组菌” 表示按常规方法以pyrG作为遗传筛选标记进行任一基因位点改造后的重组菌，“up”表示pyrG+重组菌基因组中位于pyrG筛选标记上游的DNA序列，“down”表示pyrG+重组菌基因组中位于pyrG筛选标记下游的DNA序列，“pyrG-重组菌” 表示pyrG筛选标记被剔除后的重组菌。

图2 GHS(pyrG+)重组菌中pyrG筛选标记的剔除方法示意图。其中“GHS(pyrG+)重组菌”表示按常规方法以pyrG作为遗传筛选标记进行黄曲霉sumO基因位点改造后的重组菌，“GHS(pyrG-)重组菌” 表示pyrG筛选标记被剔除后的黄曲霉sumO基因位点改造重组菌，“5’-UTR”表示黄曲霉sumO基因上游非转录区DNA片段，“pyrG”表示来源于烟曲霉的pyrG表达元件，“gpdA(p)”表示来源于构巢曲霉的3’-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子序列，“HA”表示来源流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇HA标签蛋白编码序列，“sumO CDS”表示来源于黄曲霉的翻译产物为SumO蛋白的编码核苷酸序列，“3’-UTR”表示黄曲霉sumO基因下游非翻译区DNA片段。

图3 GHS(pyrG+)重组菌的构建。（A）PCR扩增图2所示各片段及融合片段的凝胶电泳图谱，M为DS10000 DNA分子量标准，1为长度约1.2 kb的sumO基因上游非转录区5’-UTR片段，2为长度约1.9 kb的pyrG表达元件，3为长度约1.5 kb的gpdA(p) 片段，4为长度约0.6kb的HA-sumO CDS-3’-UTR片段，5为长度约5.2 kb的5’-UTR-pyrG-gpdA(p)-HA-sumO CDS- 3’-UTR融合片段；（B）Western blot免疫杂交分析GHS(pyrG+)重组菌的SUMO化修饰状态，1为CA14PTs（∆ku70 ∆pyrG）菌株总蛋白，2为WT菌株（∆ku70）总蛋白，3为GHS(pyrG+)重组菌总蛋白，B上为抗HA抗体杂交结果，B下为抗Actin抗体杂交结果用于标定各泳道上样量。

图4 GHS(pyrG+)重组菌基因组中pyrG筛选标记整合位点上、下游DNA融合片段的构建。（A）PCR分别扩增 GHS(pyrG+)重组菌基因组中pyrG筛选标记整合位点上游1.2 kb的5’-UTR和下游1.5 kb的gpdA(p)片段的琼脂糖凝胶电泳图谱；（B）融合PCR法构建长度约2.4kb的包含5’-UTR-gpdA(p)融合片段的琼脂糖凝胶电泳图谱。

图5 GHS(pyrG-)重组菌阳性转化子的筛选与鉴定。（A）PCR扩增1.9 kb的pyrG筛选标记的琼脂糖凝胶电泳图谱，M为DS2000 DNA分子量标准，1的模板为蒸馏水，2和3的模板为CA14PTs（∆ku70 ∆pyrG）菌株基因组，4的模板为GHS(pyrG+)重组菌基因组，5的模板为GHS(pyrG-)重组菌T3#转化子基因组，6的模板为GHS(pyrG-)重组菌T7#转化子基因组，7的模板为GHS(pyrG-)重组菌T10#转化子基因组，8的模板为GHS(pyrG-)重组菌T11#转化子基因组；（B）PCR扩增基因组上sumO基因位点5’-UTR至gpdA(p)之间DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图谱，M为DS5000 DNA分子量标准，1的模板为蒸馏水，2的模板为GHS(pyrG+)重组菌基因组，3的模板为GHS(pyrG-)重组菌T3#转化子基因组，4的模板为GHS(pyrG-)重组菌T7#转化子基因组，5的模板为GHS(pyrG-)重组菌T10#转化子基因组，6的模板为GHS(pyrG-)重组菌T11#转化子基因组。

图6 GHS(pyrG-)重组菌阳性转化子基因组上sumO基因位点5’-UTR至gpdA(p)之间DNA片段的测序结果。

图7 GHS(pyrG-)重组菌阳性转化子的尿嘧啶营养缺陷表型。取GHS(pyrG-)重组菌阳性转化子的10³个孢子，分别接种至不含尿苷、尿嘧啶的YGT固体培养基和添加了尿苷、尿嘧啶的YGTUU固体培养基上，37℃静置培养3天。

图8 GHS(pyrG-)重组菌阳性转化子中蛋白的SumO化修饰状态分析。1为蛋白分子量标准，2为WT菌株（∆ku70）总蛋白，3为GHS(pyrG+)重组菌总蛋白，4为GHS(pyrG-)重组菌T3#转化子总蛋白，5为GHS(pyrG-)重组菌T7#转化子总蛋白，6为GHS(pyrG-)重组菌T11#转化子总蛋白，上图为各蛋白样品用抗HA标签抗体进行Western blot免疫杂交的分析结果，下图为各蛋白样品SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色的结果，用于标定各泳道蛋白样品的上样量。

具体实施方式

发明人经过细致的研究，建立了一种新的乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因pyrG遗传筛选标记循环利用的方法。该方法仅需一个pyrG遗传筛选标记的循环利用即可实现多次遗传转化操作，避免不同遗传筛选标记的差异对真菌遗传背景和性状研究造成影响，且用该方法剔除基因组中的pyrG遗传筛选标记不需要依赖同向重复序列，剔除pyrG筛选标记后在基因组上也不会残留重复序列，不影响重组菌的遗传背景和性状，能够解决真菌遗传转化操作过程中遗传筛选标记受限、不同遗传筛选标记对真菌遗传背景和性状研究造成影响以及传统URA3/pyrG环出系统存在的重复序列残留问题。

下面将结合具体的实施例，进一步阐述本发明所提供的方法。应理解，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York: Cold Spring HarborLaboratory Press，1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

1、材料和方法

本发明所用菌株信息如下：黄曲霉WT菌株（∆ku70）和CA14PTs（∆ku70 ∆pyrG）菌株为公开发表菌株（DOI:10.1016/j.mimet.2010.03.010.），由美国农业部南方研究中心Perng-Kuang Chang教授惠赠，黄曲霉GHS（pyrG+）菌株为本发明构建，构巢曲霉FGSC A4菌株（ATCC 38163）和烟曲霉AF293菌株（ATCC MYA-4609）为本实验室购买。

质粒pUC18-HA-SumO的原始载体为pUC18商业质粒（Takara，货号D3218），质粒上携带的639 bp HA-sumO CDS-3’-UTR核苷酸片段为通用生物系统（安徽）公司全基因合成片段，序列如SEQ ID No.2所示：

HA-SumO编码核苷酸序列（SEQ 2）

ATGTACCCCTACGACGTCCCCGACTACGCCGGTTACCCCTACGACGTCCCCGACTACGCCGGTTACCCCTACGACGTCCCCGACTACGCCGGTGGTGCCGGTGCCGGTGCCGGTGCCGGTGCCATGGCCGATGCAGGACTCCCCACTGGCGATGCCCCTGCTCCCGTTGAGCATCTCAATATCAAAGTGACCGACAACAACAATGAAGTCTTCTTCAAGATCAAGCGTTCGACGCAGCTCAAGAAGCTGATGGACGCGTTCTGTGAGCGTCAAGGGAAGCAGATCTCCACTGTCCGTTTCTTGTTCGACGGAACTCGTGTACGCCCGGAAGACACGCCAGACACTCTGGAGATGGCCGACGGCGATACCTTGGAAGTTCACCAGGAGCAGATCGGTGGTTAGGAGGCCCATCCGATCGTTTTGTTTCACTTCTTGTCACTTCCTTTTTTCCTTCATCCTTCGCATTTTTTTGAGACACACAGGCGCAATGGTGTTTTGGCCCGGTCGGGCTTTAGCTGGAACGGGGTCGCCTACGGGCTTGACTTAAGCTTAGAAAAGCTTTAGACACAAGCGAACTAAAAACATGCTGGGCTGTGGATAGGCTATTTAAGTATTACGAATTAACTACTTACGACATAG。

高保真DNA聚合酶和rTaq DNA聚合酶购买自上海翊圣公司，凝胶回收试剂盒为OMEGA公司产品，酵母提取物和琼脂糖为奥赛公司产品，DNA分子量标准购自东盛公司，蛋白分子量标准为Thermo Fisher公司产品，RIPA裂解液购自上海碧云天生物技术公司，TRIpure总RNA提取试剂为无锡百泰克公司产品，反转录试剂盒购自北京全式金生物公司，5-氟乳清酸、尿苷和尿嘧啶均购自上海生工公司，其他常规化学试剂购自上海生工公司和国药集团。

本实施方式中所使用的各种溶液和培养基具体成分如下：

1000×微量元素母液（100 mL）：ZnSO₄·7H₂O 2.2 g；H₃BO₃ 1.1 g；MnCl₂·4H₂O0.5 g；FeSO₄·7H₂O 0.16 g；CoCl₂·5H₂O 0.16 g；CuSO₄·5H₂O 0.16 g； (NH4)6Mo₇O₂₄·4H₂O 0.11 g； Na₄EDTA 5 g 溶于去离子水，过滤除菌。

YGT液体培养基（1 L）：酵母提取物 5g；葡萄糖 20 g；1000×微量元素母液1 mL。在YGT液体培养基中加入尿苷（Uridine 0.001 g/L）和尿嘧啶（Uracil 0.001 g/L）即为YGTUU液体培养基。在以上两种液体培养基中加入琼脂（Agar 20 g/L）即得固体培养基。

复苏培养基（1 L）：蔗糖 342.3 g；NaNO₃ 3 g；KCl 0.5 g；MgSO₄ 0.5 g；K₂HPO₄ 1g；FeSO₄ 0.01 g；Agar 5 g（上层）或15 g（下层）。

50×5-氟乳清酸母液：1 g 5-氟乳清酸粉末溶于10 ml DMSO即得。

黄曲霉基因组DNA提取、总RNA提取与反转录、黄曲霉原生质体制备和转化、总蛋白的提取、电泳和免疫杂交方法均参考已公开发表的文献（DOI: 10.1016/j.mimet.2010.03.010; DOI: 10.1021/acs.jafc.6b02199）。

具体实施过程中所用引物见表1。

表1 引物序列表

2、实施例

1）构建基因组上整合有pyrG筛选标记的重组菌

以pyrG基因缺失的尿嘧啶营养缺陷型黄曲霉CA14PTs（∆ku70 ∆pyrG）菌株为受体菌，构建GHS（pyrG+）重组菌，构建策略如图2所示，具体步骤如下：

利用引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4从黄曲霉CA14PTs（∆ku70 ∆pyrG）菌株基因组中PCR法扩增长度为1171 bp的sumO基因上游非转录区5’-UTR片段（图3A）；

利用引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6从烟曲霉AF293菌株基因组中PCR法扩增长度为1890 bp的包含启动子、pyrG基因和终止子的pyrG表达元件（图3A）；

利用引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8从构巢曲霉FGSC A4菌株基因组中PCR法扩增长度为1510 bp的3’-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子gpdA(p) 片段（图3A）；

利用引物SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10以质粒pUC-18-HA-SumO为模板，PCR法扩增长度为639 bp的包含HA标签、SumO蛋白的编码核苷酸片段以及sumO基因下游非翻译区“3’- UTR”片段的全基因合成片段HA-sumO CDS-3’-UTR（图3A）；

将上述各片段用融合PCR法连接到一起，以巢式引物SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12扩增长度为5146 bp的融合片段5’-UTR-pyrG-gpdA(p)-HA-sumO CDS-3’-UTR（图3A），转化黄曲霉CA14PTs（∆ku70 ∆pyrG）菌株原生质体，使融合核苷酸片段整合到黄曲霉基因组的sumO基因座上替换掉内源的sumO基因，在不含尿苷和尿嘧啶的复苏培养基上37℃培养3天后筛选鉴定，获得GHS（pyrG+）重组菌。提取GHS（pyrG+）重组菌的总蛋白，并用抗HA标签抗体进行Western blot免疫杂交分析，实验结果表明，GHS（pyrG+）重组菌中可以检测到HA-SumO蛋白单体的条带，此外被SUMO化修饰的靶标蛋白条带也能被检测到，呈现阶梯状分布，而对照CA14PTs（∆ku70 ∆pyrG）菌株中检测不到特异性条带，抗Actin抗体杂交结果作为上样量对照（图3B）。

2）剔除重组菌基因组上整合的pyrG筛选标记

制备GHS（pyrG+）重组菌的原生质体；

利用引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.13从黄曲霉GHS（pyrG+）重组菌基因组中PCR法扩增长度为1171 bp的sumO基因上游非转录区5’-UTR片段（图4A）；

利用引物SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.8从黄曲霉GHS（pyrG+）重组菌基因组中PCR法扩增长度为1510 bp的3’-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子gpdA(p) 片段（图4A）；

将上述两个片段用融合PCR法连接到一起，用巢式引物SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.15从扩增长度为2372 bp的融合片段5’-UTR-gpdA(p) （图4B），转化黄曲霉GHS（pyrG+）重组菌原生质体，在含有2 mg/ml 5-氟乳清酸、1 mg/L尿苷和1 mg/L尿嘧啶的复苏培养基上37℃培养3天。挑取转化子单克隆于YGTUU固体培养基，再转接至YGTUU液体培养基中培养并抽提基因组DNA用于PCR鉴定。

实验结果如图4所示，利用引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6可以从GHS（pyrG+）重组菌基因组DNA中扩增出约1.9 kb的pyrG片段，而无法从转化子T3#、T7#、T10#和T11#的基因组DNA中扩增pyrG片段（图5A）；同时，利用引物SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.15可以从GHS（pyrG+）重组菌基因组DNA中扩增出约4.3 kb的5’-UTR-pyrG-gpdA(p)片段，而从转化子T3#、T7#和T11#的基因组DNA中扩增出约2.4 kb的5’-UTR-gpdA(p)片段，转化子T10没有扩增出DNA片段（图5B），说明转化子T3#、T7#和T11#基因组上的pyrG筛选标记已被成功剔除，为正确的阳性转化子。进一步利用引物SEQ ID NO.11将从转化子T3#、T7#和T11#中PCR扩增出的约2.4 kb的5’-UTR-gpdA(p)片段进行测序，结果表明该2.5 kb的DNA片段的实际序列与5’-UTR-gpdA(p)的理论序列一致（图6）。这些结果说明，GHS（pyrG+）重组菌基因组上整合的pyrG筛选标记确实已被剔除，且剔除过程不需要依赖pyrG筛选标记两端的同向重复序列，剔除pyrG筛选标记后GHS（pyrG-）阳性转化子基因组上也没有残留重复序列，除了pyrG筛选标记外， GHS（pyrG-）阳性转化子与GHS（pyrG+）重组菌的遗传背景一致。

接下来，我们将GHS（pyrG-）阳性转化子T3#、T7#和T11#的孢子分别接种于YGT和YGTUU固体培养基上，37℃培养3天，验证它们的营养缺陷表型。实验结果表明，转化子T3#、T7#和T11#在YGTUU固体培养基上能够正常生长出细密的菌丝，而在YGT固体培养基上则不能正常生长，呈现尿嘧啶营养缺陷表型（图7）。这一结果证明，GHS（pyrG-）阳性转化子T3#、T7#和T11#的营养缺陷表型性状是正确的。

进一步，我们提取了GHS（pyrG+）重组菌和GHS（pyrG-）阳性转化子T3#、T7#和T11#的总蛋白，通过Western blot免疫杂交分析从蛋白水平上比较pyrG筛选标记剔除的SUMO化饰状态是否有差异，并以SDS-PAGE考马斯亮蓝染色作为上样量内参对照。从实验结果上看，阴性对照菌株检测不到特异性杂交条带，只呈现较弱的各个菌株共有的HA抗体的非特异性杂交条带，而GHS（pyrG+）重组菌和GHS（pyrG-）阳性转化子T3#、T7#和T11#都特异性地表达了HA-SumO单体蛋白，体内还有许多不同分子量的被SUMO化修饰的靶标蛋白，呈现出阶梯式的分布条带，且GHS（pyrG+）重组菌和GHS（pyrG-）各个阳性转化子之间没有表达量和表达模式的差异（图8）。这些结果说明，GHS（pyrG-）阳性转化子T3#、T7#和T11#的蛋白表达模式是正确的。

最终，按本发明提供的方法，我们从GHS（pyrG+）重组菌中成功剔除了pyrG筛选标记，获得了GHS（pyrG-）重组菌。除了pyrG筛选标记外，GHS（pyrG-）重组菌的遗传背景和表型性状都与GHS（pyrG+）重组菌一致。所得GHS（pyrG-）重组菌可继续利用pyrG筛选标记进行其他遗传转化操作。

综合以上结果，说明本发明所提供的一种新的乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因pyrG遗传筛选标记循环利用的方法，能够在不依赖重复序列的情况下实现pyrG遗传筛选标记的循环利用，剔除pyrG筛选标记后在基因组上也不会残留重复序列，不影响重组菌的遗传背景和性状，能够解决真菌遗传转化操作过程中遗传筛选标记受限、不同遗传筛选标记对真菌遗传背景和性状研究造成影响以及传统URA3/pyrG环出系统存在的重复序列残留问题。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种pyrG筛选标记循环利用的方法及应用

<130> 15

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1890

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcctcaaaca atgctcttca ccctcttcgc gggtctgaaa taccctcacc tggcaacagc 60

aattggcgct tcatggctgt ttttccgatc tctctacttg tacggctatg tgtactcggg 120

taagccacaa ggcaagggca gattgctggg aggtttcttc tggttttctc aaggcgctct 180

gtgggctctg agtgtgtttg gtgttgccaa agacatgatc tcttactgag agttattctg 240

tgtctgacga aatatgttgt gtatatatat atatgtacgt taaaagttcc gtggagttac 300

cagtgattga ccaatgtttt atcttctaca gttctgcctg tctaccccat tctagctgta 360

cctgactaca gagtagttta attgtggttg accccacagt cggaggcgga ggaatacagc 420

accgatgtgg cctgtctcca tccagattgg cacgcaattt ttacacgcgg aaaagatcga 480

gatagagtac gactttaaat ttagtccccg gcggcttcta ttttagaata tttgagattt 540

gattctcaag caattgattt ggttgggtca ccctcaattg gataatatac ctcattgctc 600

ggctacttca actcatcaat caccgtcata ccccgcatat aaccctccat tcccacgatg 660

tcgtccaagt cgcaattgac ttacggtgct cgagccagca agcaccccaa tcctctggca 720

aagagacttt ttgagattgc cgaagcaaag aagacaaacg ttaccgtctc tgctgatgtg 780

acgacaaccc gagaactcct ggacctcgct gaccgtacgg aagctgttgg atccaataca 840

tatgccgtct agcaatggac taatcaactt ttgatgatac aggtctcggt ccctacatcg 900

ccgtcatcaa gacacacatc gacatcctca ccgatttcag cgtcgacact atcaatggcc 960

tgaatgtgct ggctcaaaag cacaactttt tgatcttcga ggaccgcaaa ttcatcgaca 1020

tcggcaatac cgtccagaag caataccacg gcggtgctct gaggatctcc gaatgggccc 1080

acattatcaa ctgcagcgtt ctccctggcg agggcatcgt cgaggctctg gcccagaccg 1140

catctgcgca agacttcccc tatggtcctg agagaggact gttggtcctg gcagagatga 1200

cctccaaagg atcgctggct acgggcgagt ataccaaggc atcggttgac tacgctcgca 1260

aatacaagaa cttcgttatg ggtttcgtgt cgacgcgggc cctgacggaa gtgcagtcgg 1320

atgtgtcttc agcctcggag gatgaagatt tcgtggtctt cacgacgggt gtgaacctct 1380

cttccaaagg agataagctt ggacagcaat accagactcc tgcatcggct attggacgcg 1440

gtgccgactt tatcatcgcc ggtcgaggca tctacgctgc tcccgacccg gttgaagctg 1500

cacagcggta ccagaaagaa ggctgggaag cttatatggc cagagtatgc ggcaagtcat 1560

gatttcctct tggagcaaaa gtgtagtgcc agtacgagtg ttgtggagga aggctgcata 1620

cattgtgcct gtcattaaac gatgagctcg tccgtattgg cccctgtaat gccatgtttt 1680

ccgcccccaa tcgtcaaggt tttccctttg ttagattcct accagtcatc tagcaagtga 1740

ggtaagcttt gccagaaacg ccaaggcttt atctatgtag tcgataagca aagtggactg 1800

atagcttaat atggaaggtc cctcaggaca agtcgacctg tgcagaagag ataacagctt 1860

ggcatcacgc atcagtgcct cctctcagac 1890

<210> 2

<211> 639

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgtacccct acgacgtccc cgactacgcc ggttacccct acgacgtccc cgactacgcc 60

ggttacccct acgacgtccc cgactacgcc ggtggtgccg gtgccggtgc cggtgccggt 120

gccatggccg atgcaggact ccccactggc gatgcccctg ctcccgttga gcatctcaat 180

atcaaagtga ccgacaacaa caatgaagtc ttcttcaaga tcaagcgttc gacgcagctc 240

aagaagctga tggacgcgtt ctgtgagcgt caagggaagc agatctccac tgtccgtttc 300

ttgttcgacg gaactcgtgt acgcccggaa gacacgccag acactctgga gatggccgac 360

ggcgatacct tggaagttca ccaggagcag atcggtggtt aggaggccca tccgatcgtt 420

ttgtttcact tcttgtcact tccttttttc cttcatcctt cgcatttttt tgagacacac 480

aggcgcaatg gtgttttggc ccggtcgggc tttagctgga acggggtcgc ctacgggctt 540

gacttaagct tagaaaagct ttagacacaa gcgaactaaa aacatgctgg gctgtggata 600

ggctatttaa gtattacgaa ttaactactt acgacatag 639

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggatcgttga tgctaatc 18

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gggtgaagag cattgtttga ggcggttctt gactagttgt aag 43

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcctcaaaca atgctcttca ccc 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtctgagagg aggcactgat gc 22

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcatcagtgc ctcctctcag acgaggaatt ggaggtagca tag 43

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gatgaatata ctgaagatgg g 21

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

accccgcttg agcagacatc acatgtaccc ctacgacgtc cc 42

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctatgtcgta agtagtta 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ctgccaggtg ttcgcttc 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aatagcctat ccacagcc 18

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

caagccttcg acatccggat gggttcttga ctagttgtaa g 41

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cttacaacta gtcaagaacc catccggatg tcgaaggctt g 41

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ggcggacaga cggggcaaag 20

Claims (3)

1.一种pyrG筛选标记循环利用的方法，其特征在于，以基因组上整合了乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶编码基因pyrG筛选标记的重组菌为出发菌，利用pyrG筛选标记整合位点上、下游DNA融合片段的同源重组和5-氟乳清酸负筛选来剔除重组菌中的pyrG筛选标记，使菌株能够再次作为出发菌循环利用pyrG筛选标记进行遗传转化；

所述出发菌为黄曲霉（Aspergillus flavus）；

所述pyrG筛选标记源于曲霉；

所述pyrG筛选标记整合位点上、下游DNA融合片段为包含pyrG筛选标记整合位点上游的核苷酸片段和pyrG筛选标记整合位点下游的核苷酸片段的融合核苷酸片段；

所述5-氟乳清酸负筛选为在培养基中添加5-氟乳清酸、尿苷和尿嘧啶来培养真菌，筛选pyrG基因缺失的尿嘧啶营养缺陷型菌株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）以pyrG基因缺失的尿嘧啶营养缺陷型黄曲霉为受体菌，以源于烟曲霉（Aspergillus fumigatus）的pyrG基因表达元件作为筛选标记进行任一基因改造，获得基因组上整合有pyrG筛选标记的重组菌；

2）制备步骤1）中所述重组菌的原生质体，向原生质体细胞中导入pyrG筛选标记整合位点上、下游DNA融合片段，并在含有5-氟乳清酸、尿苷和尿嘧啶的培养基上培养，筛选剔除pyrG筛选标记的重组菌。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）以pyrG基因缺失的尿嘧啶营养缺陷型黄曲霉为受体菌，通过PCR法将需进行基因改造的任一DNA片段、同源重组臂及源于烟曲霉的pyrG基因表达元件一起构建融合片段，将该融合片段导入黄曲霉受体菌的原生质体，获得基因组上整合有pyrG筛选标记的重组菌；

2）制备步骤1）中所述重组菌的原生质体，通过PCR法构建包含步骤1）所述重组菌的pyrG筛选标记整合位点上、下游DNA片段的融合片段，将该融合片段导入重组菌原生质体，

并在含有2 mg/ml 5-氟乳清酸、1 mg/L尿苷和1 mg/L尿嘧啶的培养基上培养，筛选剔除pyrG筛选标记的重组菌，该重组菌再次作为出发菌循环利用pyrG筛选标记进行遗传转化。

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