CN102120966A

CN102120966A - Ura3缺陷型毕赤酵母x-33菌株的构建及应用

Info

Publication number: CN102120966A
Application number: CN 201010580120
Authority: CN
Inventors: 朱瑞宇; 金坚; 张大成; 许永利; 雷楗勇; 陈蕴
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2010-12-09
Filing date: 2010-12-09
Publication date: 2011-07-13

Abstract

本发明公开了一株乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶(ura3)缺陷型毕赤酵母(P.pastoris)X-33菌株的构建及利用，属于生物工程技术领域。该下程菌株P.pastoris X-33(Δura3)是通过采用同源重组敲除目的基因的方法而获得。该菌株可以利用URA3基因作为选择标记，构建各种工程菌株。而且，工程菌株构建时不要求载体携带的ura3基因来源于相同微生物种属。同时提供了一个对X33后续的工程化改造如糖基化改造提供了更好的平台菌株，具有非常大的潜在应用前景。

Description

URA3缺陷型毕赤酵母X-33菌株的构建及应用

技术领域

一株乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶(ura3)缺陷型毕赤酵母(P.pastoris)X-33菌株的构建及利用，属于生物工程技术领域。

背景技术

酵母嘧啶核苷酸的从头生物合成以谷氨酰胺为原料，经多步生物催化生成乳清昔酸(0MP)，再由OMP脱羧酶催化脱羧生成尿苷酸(UMP)，后者进一步催化生成尿苷三磷酸(UTP)和胞苷三磷酸(CTP)。酵母的AMP脱羧酶(URA3)通常由ura3基因编码，是嘧啶生物合成所必需的酶；若OMP脱羧酶功能缺失，嘧啶生物合成途径将中断，在没有外源尿嘧啶补给条件下酵母无法存活。乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶编码基因ura3做为一种选择性标记基因，常用于酿酒酵母、假丝酵母、克鲁维酵母和裂殖酵母等酵母菌的遗传操作或遗传操作系统的构建。

一般来讲，通过部分或全部缺失ura3基因可构建乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶功能缺失的工程菌株，即尿嘧啶营养缺陷型菌株；而ura3基因连接到载体的适当位置后，就可以作为负向选择标记基因进行遗传操作。或用于向尿嘧啶营养缺陷型菌株中引入新基因，构建各种下程菌株。而且，工程菌株构建时不要求载体携带的ura3基因来源于相同微生物种属。

毕赤酵母表达系统具有像原核生物生长速度快、便于基因操作、成本低廉、便于大规模培养和高密度发酵等特性，同时又具有真核细胞的大部分翻译后加工修饰功能(如糖基化过程等)，已广泛用于各种蛋白的表达，因而用毕赤酵母细胞生产药用蛋白日益引起人们的青睐。毕赤酵母X-33是Invitrogen公司推出的野生型没有转化过任何基因的毕赤酵母原始菌株为甲醇快速利用型，耐受性比较好，转化率和表达量相对而言较高被广泛应用于外源蛋白的表达。因此构建X-33的ura3基因缺陷性菌株对各种药用蛋白工程菌的开发以及进一步的X-33工程化改造如糖基化改造提供了很好的平台。

发明内容

本发明的目的在于构建得到ura3基因缺陷型的X-33(Δura3)菌株。本发明构建获得URA3突变菌株的方法如下.

1)URA3基因的同源置换DNA片段的构建：根据GenBank(AF321098)中报道的毕赤酵母URA3(orotidine-5’-Phosphate decarboxylase)基因序列设计两对寡核苷酸引物。以X-33菌株基因组为模板，用引物URA5F、URA5R和URA3F、URA3R，分别PCR扩增URA3基因两端同源臂片段URA5’和URA3’，各700bp、600bp左右。然后以URA5’和URA3’为模板，URA5F和URA3R为引物，用重叠PCR扩增URA3基因同源置换DNA片段URA 5’-3’，约1300bp。引物序列分别为：

URA5F：5’-ATTTGCGGCCGCCTGCAGAAATGGGGAGATAACCACC-3’

URA3R：5’-ATTTGCGGCCGCACTAGTGGTTTTCTGGGGGTATTTGCTG-3’

URA5R：5’-CAATTGATCCCCTGTACATACTTGTAATTAGGTATCTATCCCTTTGATCAGGTT-3’

URA3F：5’-AACCTGATCAAAGGGATAGATACCTAATTACAAGTATGTACAGGGGATCAATTG-3’

2)敲除毕赤酵母X-33的URA3基因，构建营养缺陷型菌株：将URA3基因两端同源臂融合片段URA5’-3’电击转入X-33感受态细胞，涂布含有5-FOA和尿嘧啶的MD培养基(YNB1.34％，葡萄糖2％，琼脂粉1.5％，尿嘧啶100ug/mL，5-FOA 1mg/mL)上，30℃培养3-5d。挑选上述培养基上长出的单菌落，用牙签分别点种于MD培养基(YNB1.34％，葡萄糖2％，琼脂粉1.5％)和MDU培养基(YNB1.34％，葡萄糖2％，琼脂粉1.5％，尿嘧啶100ug/mL)上，30℃培养3-5d，然后选择在MDU培养基上生长良好而在MD培养基上不能生长的菌株，反复筛选三轮至性状稳定，提取基因组用URA3基因两端引物URA5F、URA3R进行PCR鉴定，筛选出X-33(Δura3)菌株。

本发明获得的毕赤酵母X33菌种经过多次传代，遗传性状稳定。同时X-33(Δura3)菌还可以用于进一步的工程化改造，从而获得更适合生产各种药用蛋白的酵母工程菌。

附图说明

图1重叠PCR得到的URA3基因同源置换DNA片段

M：DNA分子量标准；1：重叠PCR得到的URA3基因同源置换DNA片段。

图2P.pastoris X-33(Δura3)菌株的鉴定。

M：DNA分子量标准；1：野生型P.pastoris X-33以URA5F和URA3R为引物的PCR结果；2：P.pastoris X-33(Δura3)以URA5F和URA3R为引物的PCR结果。

具体实施方式：

实施例一：

URA3基因的克隆及其同源置换DNA片段的构建：从毕赤酵母X-33基因组PCR扩增的URA3基因两端同源臂片段URA5’、URA3’和融合同源臂片段分别为0.7kb、0.6kb和1.3kb(图1)。测序结果表明各序列、及融合顺序均正确。

实施例二：

URA3基因的敲除和鉴定：URA5’-3’融合同源臂片段电击转入酵母后，与基因组中的URA3基因发生双交换同源重组，置换掉URA3基因编码框中约700bp的序列。而未发生同源重组的菌株由于携带URA3基因不能在含有5-FOA的培养基上生长，因此可以在含5-FOA和尿嘧啶的MD培养基上筛选出ura3缺失菌株。挑选经过表型鉴定且性状稳定的菌株，用外部引物URA5F和URA3R进行基因组PCR鉴定，野生型X-33菌的URA3基因大小为2043bp，因此扩增产物为2000bp左右；ura3缺失菌的URA3基因编码框中约700bp的序列被置换掉，扩增产物应为1300bp左右，电泳结果与预期一致(图2)，说明筛选的为P.pastorisX-33(Δura3)。

序列表

<110>江南大学

<120>URA3缺陷型毕赤酵母X-33菌株的构建及应用

<140>201010580120.5

<141>2010-12-09

<160>4

<210>1

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>URA5F

<400>1

atttgcggcc gcctgcagaa atggggagat aaccacc 37

<210>2

<211>40

<212>DNA

<212>人工序列

<220>

<223>URA3R

<400>1

atttgcggcc gcactagtgg ttttctgggg gtatttgctg 40

<210>3

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>URA5R

<400>1

caattgatcc cctgtacata cttgtaatta ggtatctatc cctttgatca ggtt 54

<210>4

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>URA3F

<400>1

aacctgatca aagggataga tacctaatta caagtatgta caggggatca attg 54

Claims

1.一种P.pastoris X-33的OCH1缺陷型菌株。

2.根据权利要求1所述基因工程菌，其构建方法为采用同源重组敲除URA3基因。

3.权利要求1或2在以利用URA3基因作为选择标记，构建各种工程菌株方面的应用。