CN101195809A - α-1,6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了α－1，6－甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株及其构建方法，属于生物工程领域。α－1，6－甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株，保藏号为CGMCCNo.1853。本发明的优点是：本发明构建的α－1，6－甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株，在表达外源糖蛋白时，可阻止过度甘露糖化的发生，减小表达蛋白的免疫原性，因而在生物医学等领域具有重要的应用价值；同时，该菌株还可以应用于进一步的基因敲除或代谢工程改造。本发明还建立了一种通过二次同源重组敲除α－1，6－甘露糖转移酶基因的方法，这种方法可以较为容易的获得突变株，大大降低筛选的工作量，提高成功率。

Description

α-1，6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株及其构建方法

技术领域

本发明涉及α-1，6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株及其构建方法，属于生物工程领域。

背景技术

基因敲除(gene knockout)，是指对一个序列已知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除或用其它基因取代。基因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变，既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。

基因敲除利用了基因同源重组的原理。同源重组从原理上可以被分为单交换同源重组和双交换同源重组。在发生单交换同源重组时，外源基因通过与宿主染色体上的基因在同源序列发生重组而插入到靶序列中；在发生双交换同源重组时，外源基因通过与宿主染色体上的基因在两侧同源序列间发生重组将靶序列去除而整合到基因组上。利用单交换同源重组将外源序列片段插入到靶基因处，也可以使得靶基因失活，但这种方法发生回复突变的几率较高，一般不常用；利用双交换同源重组对目标基因进行敲除，可以大大降低突变株的回复突变几率，得到比较稳定的敲除突变株，在酿酒酵母中，这种基因敲除只需几十至几百个碱基的短同源臂就可获得满意的结果；但在毕赤酵母中，其同源臂即使长至几百乃至上千个碱基，其敲除效率仍很低。

毕赤酵母，作为重要的重组蛋白表达系统，已广泛用于各种重组蛋白表达。它具有像原核细胞系统生长快、便于基因操作和可大规模培养等优点，同时又具有真核细胞翻译后加工、能产生具有生物活性的重组蛋白等特点。但酵母表达蛋白的糖基化修饰，常产生过度糖基化。正常的N-糖基修饰，一般每个糖基含10-20个单糖，分子量为1500-4000。而过度糖基化修饰时，每个糖基可以含数十至上百个甘露糖，分子量为5000至数万，表现为糖蛋白分子量明显增大，而且由于过度糖基化修饰往往不均一，因而糖蛋白分子量也不均一，SDS-PAGE分析时可出现明显“拖尾”。过度糖基化的糖蛋白，在人体中半衰期短、免疫原性高、易被清除。由于该缺陷，限制了毕赤酵母在大部分糖蛋白类药物生产方面的应用。

在毕赤酵母中，α-1，6-甘露糖转移酶(OCH1)是导致过度糖基化的高甘露糖结构生成的起始酶。因此，α-1，6-甘露糖转移酶的敲除可望避免过度甘露糖化的产生，具有重要的应用价值；同时，α-1，6-甘露糖转移酶缺失的菌株还可以应用于进一步的毕赤酵母糖基人源化改造，具有很广阔的应用前景。

由于α-1，6-甘露糖转移酶在毕赤酵母蛋白糖基化过程中具有重要作用，它的敲除可对菌体的生长和代谢产生影响，这使得敲除工作更加困难。Contreras的研究小组进行了敲除α-1，6-甘露糖转移酶的工作，他们首先采用了双交换同源重组的策略，构建的敲除等位基因的同源臂长度达到了3kb，但始终筛选不到阳性克隆，随后又采用了单交换同源重组的策略，即在目标基因阅读框内插入一段序列以中止目标基因的表达，从而获得了OCH1基因缺失的菌株(Contreras R，Vervevken W，et al In Vivo Synthesis ofMammalian-Link，Hybird-Type N-Glycans in Pichia pastoris，Applied andEnvironmental Microbiology，May 2004，2639-2649)。但是，通过单交换使得靶基因插入失活后，菌株在传代的过程中较不稳定，易发生回复突变，需要不断施加筛选压力，限制了其在后续研究和生产应用等方面的发挥。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一株α-1，6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株及其构建方法，属于生物工程领域。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种适当糖基化的HSA/GM-CSF融合蛋白。

本发明要解决的第三个技术问题是提供一种基因敲除的方法，利用两步基因置换法敲除酵母中的目标基因，构建α-1，6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

α-1，6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株，保藏号为CGMCCNo.1853。

α-1，6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株CGMCC No.1853，其编码区被选择性标记ADE基因所取代，且两侧没有大于20bp的同源序列，因而菌株稳定。该菌株用于表达外源糖蛋白时，与野生型毕赤酵母不同，其产物不会被过度甘露糖化，因而在生物制药领域具有广泛的应用前景。该菌株还可用于进一步的糖基工程改造，获得具有杂合型和复杂型N-糖基合成能力的菌株。这些菌株可广泛用于各种糖蛋白的生产。

毕赤酵母菌株CGMCC No.1853在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保藏日为2006年10月30日，保藏号为CGMCC No.1853，参据的微生物株为GJK0601，建议的分类命名为巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris。

α-1，6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株CGMCC No.1853制备的HSA/GM-CSF融合蛋白，是人血清白蛋白(HSA)和人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的融合蛋白，GM-CSF是一个重要的造血生长因子，可用于治疗各种原因引起的造血功能障碍，如肿瘤放化疗、骨髓移植、再生障碍性贫血等，肿瘤，免疫力低下引起的各种疾病，及各种感染，如病毒性肝炎等(马大龙主编，生物技术药物，2001，科学出版社)。HSA是人体血浆的主要蛋白，不易被肾小球滤过，体内半衰期长达2周。HSA与多肽融合可明显延长多肽的体内半衰期(Yao Zet al.Effectof albuminfusion on the biodistribution of interleukin-2.Cancer Immunol Immunother.2004May；53(5)：404-10；唱韶红等人血清白蛋白和人干扰素α2b的融合蛋白在毕赤酵母中的表达生物工程学报2006，22(2)：173-179.)。HSA/GM-CSF正是这样一种通过与HSA融合获得的长效的GM-CSF类药物，在临床上具有广泛的用途。它具有序列表SEQ ID No.13所示的核苷酸序列和序列表SEQ ID No.14所示的氨基酸序列。氨基酸序列中第1-24个氨基酸为信号肽和前肽，在蛋白合成和分泌过程被切除，该融合蛋白的成熟肽含717个氨基酸残基，理论分子量为81KD。其中带下划线的N641和N651为两个N-糖基化位点。但正是由于具有这两个N-糖基化位点，使得该融合蛋白基因用普通毕赤酵母菌，如GS115表达时，会在上述位点加上数十至上百个甘露糖，产生过度糖基化，从而使表达的蛋白分子量明显增加至大于97KD，并且由于糖基化的不均一，SDS-PAGE分析时，可发现明显的拖尾现象(见实施例2及附图5)。这种过度糖基化的蛋白不仅存在分子不均一的问题，而且作为药物注射人体时，具有明显的免疫原性，易被免疫系统清除，体内半衰期短(董志伟、王琰等主编，抗体工程，第174页，2002，北京医科大学出版社)。而用本发明的毕赤酵母菌株CGMCC No.1853制备HSA/GM-CSF融合蛋白则解决了上述问题，表达的融合蛋白不存在过度糖基化现象，表现为分子量明显减小，且消除了拖尾现象(见实施例2及附图5)，因而在临床上有广泛的应用前景。

构建α-1，6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株的方法，包括如下步骤：

a)构建敲除质粒：质粒上包括待敲除基因两侧的同源臂序列，两个同源臂之间插入一个选择性标记，质粒上还带有URA3(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)基因；

b)将敲除质粒以同源臂序列上的单一限制性酶切位点线性化后转入到宿主菌中，用具有选择压力的培养基筛选质粒DNA插入靶序列的阳性克隆；

c)将筛选到的阳性克隆在复杂培养基或含尿嘧啶的简单培养基中进一步扩大培养，用含有5-氟乳清酸和与质粒上同源臂间的选择性标记对应的选择压力的培养基筛选获得目标基因敲除的菌株。

敲除质粒的骨架可以选用各种可以在大肠杆菌中扩增的载体，一般应带有复制位点，筛选标记等，这些载体的构建方法已在许多文献公开(如J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002)，也可以从各种公司购得(如Invitrogen life technologies，carlsbad，california 92008，USA)。

目标基因同源臂、URA3(orotidine-5’-phosphate decarboxylase，5-磷酸乳清酸脱羧酶。其序列在Genebank中已经公开，编号为AF321098)基因以及其它选择性标记基因的调取可以用本领域周知的方法，如提取酵母基因组(如A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000)，用PCR(Saiki等Science.239：487-491，1988)的方法从基因组中调取，还可以利用人工合成的方法获得。

将URA3基因插入到载体中，可以在不破坏其它基因完整性的基础上利用载体已有的限制性酶切位点，通过常规的酶切、连接、转化等方法(如J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002)。

所述同源臂序列是指目标基因两侧的基因序列，在两侧同源臂之间缺失或突变一段目标基因。

目标基因两个同源臂应选择在目标基因两侧，所述同源臂的长度至少大于200bp，最优的大小在500bp-2000bp，两侧同源臂中间缺失或突变一段目标基因。这样，当目标位点发生二次重组后，由于目标基因阅读框的部分或全部的缺失或突变将导致目标基因的失活。同时，在选择同源臂序列时还应考虑到线性化位点的选择，线性化位点是任意一个同源臂上的限制性酶切位点，且在敲除质粒上为唯一，这个位点较优的位置是在靠近这个同源臂的中间位置。

在目标基因两个同源臂之间插入选择性标记。所述选择性标记可以是单拷贝，也可以是串联的多拷贝；这个选择性标记可以是营养缺陷型标记，如腺嘌呤合成基因ADE(PR-aminoimidazolesuccinocarboxamide)、精氨酸合成基因ARG(argininosuccinate lyase)、组氨酸合成基因His4(Histidinol dehydrogenase)等，这些基因可以来源于毕赤酵母，也可以来源于其它物种，如酿酒酵母、大肠杆菌等，毕赤酵母的ADE、ARG、HIS4基因序列在Genebank中已经公开，编号分别是AF321096、AF321097和X56180；这个选择性标记也可以是抗生素抗性基因标记，如Zeocin、G418等，这些抗生素抗性基因可以从商业化载体上扩增，如可以从PICZAα(购自Invitrogen life technologies，carlsbad，california 92008，USA)中扩增Zeocin基因，从PIC9K(购自Invitrogenlife technologies，carlsbad，california 92008，USA)中扩增G418基因。这个选择性标记基因可以先与两段同源臂基因通过融合PCR的方法连接到一起(黄留玉等，《PCR最新技术原理、方法及应用》，化学工业出版社，2004)，再插入到载体中，也可以先将两个同源臂先后插入载体中相邻的位置，再利用两个同源臂之间的限制性酶切位点将选择性标记基因插入。

在构建好敲除质粒后，将敲除质粒以其中一个同源臂上的限制性酶切位点线性化，将质粒转入毕赤酵母宿主菌中。该宿主菌可以是具有URA3缺陷的各种毕赤酵母菌株，如果敲除质粒所带的筛选标记为营养缺陷标记，那么宿主菌需要带有相应的缺陷。这些菌株可以用常规的诱变或敲除的方法获得。LinCereghino，G.P.等(New selectable marker/auxotrophic host strain combinationsfor molecular genetic manipulation of Pichia pastoris.2001，Gene，263，159-69.)及其它文献均详细报道了这类菌株的构建方法，如Lin Cereghino，G.P.等构建的毕赤酵母JC307(ura3-，his4-)、JC308(ade^-、ura3^-、arg^-、his^-)等，均可作为敲除的宿主菌。这些宿主菌也可用其它本领域已知的其它方法构建。

转化方法可以是电转化、PEG转化法等(如J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002)，将转化后的菌体涂布在与质粒中选择性标记相对应的筛选培养基上，筛选阳性克隆，在该培养基上长出的转化子应该为发生了一次重组后敲除质粒整合到染色体目标位点上的克隆，由于敲除质粒的整合将导致目标基因在这一区段的重复。对于这些转化子，可以通过PCR、Southern杂交等方法确证敲除质粒是否整合到染色体上的目标位点。

将确证正确整合的菌株在复合培养基或含尿嘧啶的基本培养基中振荡培养一段时间，最佳时间在12个小时左右。在这个过程中，一些菌体染色体中重复的两个拷贝之间发生同源交换，这将导致质粒的切除以及重复区段中两个拷贝之一的丢失，发生了二次重组的菌株要么为野生型，要么为目标基因敲除的突变株。将扩大培养的菌液均匀涂布在具有相应的筛选压力的5-FOA培养基上。5-FOA培养基可以用于筛选不带有URA3基因的菌株，因为URA3基因所编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶，该酶能把5-FOA转化成对细胞有毒的物质，使得带有URA3基因的菌株不能生长。因此，进行了一次重组的菌株在进一步振荡培养的过程后，那些未发生二次重组的菌株由于带有URA3基因，不能在含有5-FOA的培养基上生长。另外，由于本方法采用了双筛选标记(URA3和两侧同源臂之间的选择性标记)，在发生一次重组时，两个标记全部整合到酵母基因组上，当发生二次重组时，根据交换体的定位，产生野生型菌株的过程中，所切除的部分包括了这两个筛选标记，而产生的突变型菌株的过程中，被切除的部分仅含有URA3这一个筛选标记，另一个筛选标记则被保留，该方法原理示意图见图1。如果两个同源臂之间的选择性标记是营养缺陷型，则将菌液涂布在具有该营养缺陷的5-FOA培养基上，培养基上长出的克隆就可能是基因敲除突变株，再将这些克隆做进一步鉴定；如果两个同源臂之间的选择性标记是抗性标记基因，则先将菌液涂布在5-FOA培养基上，待长出克隆后再挑到含有相应抗生素的培养基上，培养基上长出的克隆就可能是基因敲除突变株，再将这些克隆做进一步鉴定。对于培养基上长出的阳性克隆的进一步鉴定，可以通过PCR、Southern杂交等方法在基因水平验证其目标基因是否被敲除，这些分子生物学方法，为本领域所共知的(如J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002)。

若在基因敲除过程中，只采用URA3为筛选标记，则发生二次重组后产生的野生型菌株和突变株在表型上不能加以区别，因而不能用筛选培养基直接筛选出阳性克隆，可以利用PCR、Southern杂交等方法进行筛选。虽然得到野生型菌株和突变株的机会在理论上是均等的，但在实际应用中，特别是针对一些与菌体生长和代谢等方面相关的基因进行敲除时，得到突变株的几率远低于野生型菌株，比如本研究小组在敲除α-1，6-甘露糖转移酶(OCH1)的工作中，曾采用过URA3单筛选标记的两步基因置换法，而最终没有筛选到突变株。因此，在两步基因置换法敲除目标基因的过程中，采用双筛选标记可以较为容易的获得突变株，大大降低筛选的工作量，提高成功率。

本发明的优点是：本发明构建的α-1，6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株，在表达外源糖蛋白时，可阻止过度甘露糖化的发生，减小表达蛋白的免疫原性，因而在生物医学等领域具有重要的应用价值；同时，该菌株还可以应用于进一步的基因敲除或代谢工程改造。本发明还建立了一种通过二次同源重组敲除α-1，6-甘露糖转移酶基因的方法，这种方法可以较为容易的获得突变株，大大降低筛选的工作量，提高成功率。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对本发明的限制，凡是依照本发明公开内容所做出的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为两步基因置换法原理示意图：通过单交换使质粒整合到染色体目标位点导致OCH 1基因的5’和3’同源臂序列重复，染色体中重复的两个拷贝之间可以发生同源交换，这将导致质粒的切除以及重复区段中两个拷贝之一的丢失，根据交换体的准确定位，发生了二次重组的菌株要么为野生型(a)，要么为目标基因敲除的突变株(b)。

图2为PCR法鉴定敲除质粒整合到染色体上的目标位点：PCR所用的鉴定引物是OCH1基因3’同源臂外的引物序列p1108和ADE基因的5’端引物pADE-5，以及引物p1108和OCH1基因5’同源臂外的引物序列p1107，若质粒整合到染色体上的目标位点，则以p1108和pADE-5为引物，可以扩增出2.4kb左右的片断，而以p1107和p1108为引物，由于两个引物之间的距离过长(约为7kb)，rTaq无法扩增出相应的条带。1：分子量标准，自上而下分别为15000、10000、7500、5000、2500、1000、250bp；2-5：1-4号克隆的基因组以p1108和pADE-5为引物进行的PCR反应；6-9：1-4号克隆的基因组以p1107和p1108为引物进行的PCR反应。

图3为PCR法鉴定OCH1基因的敲除：鉴定引物为染色体上0CH1基因同源臂外的序列p1107和p1108，野生型JC308菌株的OCH1基因全长为2.8kb，敲除突变株中相应等位基因被ADE基因替换后全长在4.8kb左右。A：OCH1敲除突变株；B：野生型菌株GS115；C：分子量标准，自上而下分别为15000、10000、7500、5000、2500、1000、250bp。

图4为HSA/GM-CSF的毕赤酵母表达载体pD2HSAGMCSF结构图。

图5为敲除菌株表达的外源蛋白分析：取α-1，6-甘露糖转移酶敲除的菌株(1，3号样品)和野生型菌株(2，4号样品)的表达的HSA/GM-CSF作SDS-PAGE分析(A)和Western blot(B)分析。野生型菌株表达的HSA/GM-CSF的分子量大于97KD，且表达带产生了明显的拖尾现象，明显大于不被糖基化修饰的HSA/GM-CSF理论分子量(81KD)，而敲除了α-1，6-甘露糖转移酶的菌株分子量约为85KD，且表达带清晰，没有拖尾现象。

具体实施方式

实施例1：

1.敲除质粒的构建

用玻璃珠制备法(A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000)提取毕赤酵母GS 115(购得Invitrogen life technologies，carlsbad，california 92008，USA)的基因组，以该基因组为模板扩增α-1，6-甘露糖转移酶(OCH1)两侧的同源臂、URA3基因和ADE基因(PCR反应所用的pyrobest酶购自宝生物工程有限公司，大连；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，北京)，OCH1两侧的同源臂为900bp，中间缺失1000bp的编码基因，扩增OCH 15’端同源臂所用的引物为p1105(SEQ ID No.5)和p1106(SEQ ID No.6)，引序列分别为：5’-acggatccccggaaaaccgagagaactct-3’和5’-acgcggccgcagagcgatagagaatgttccagg-3’，扩增OCH13’端同源臂所用的引物为p1103(SEQ ID No.3)和p1104(SEQ ID No.4)，引序列分别为：5’-acgcggccgcggatcctaatgaggccaaggaattggagctggct-3’和5’-agggtacctgggaagagatgtcttgtgcac-3’，两个同源臂的PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延伸1min进行30次循环，最后72延伸10min；以毕赤酵母GS115基因组为模板，扩增URA3基因的引物为pURA3-5(SEQ ID No.9)和pURA3-3(SEQ ID No.10)，引序列分别为：5’-aaccaactgcagtggggagataaccacctttgac-3’和5’-tttcggtaccttgctggctactccttgagtctg-3’，PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延伸2min，进行30次循环，最后72延伸10min，目的片断大小在2kb左右；以酿酒酵母基因组为模板，扩增ADE基因所用的引物为pADE-5(SEQ ID No.11)和pADE-3(SEQ ID No.12)，引序列分别为：5’-atttgcggccgctattcacgagtcagtctgactct-3’和5’-atttgcggccgcaatcctcgagaagcaagctattg-3’，PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延伸1min30sec进行30次循环，最后72延伸10min，目的片断大小在1.5kb左右。将PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收(购自鼎国生物技术有限公司，北京)。

以质粒pYes2(购得Invitrogen life technologies，carlsbad，california 92008，USA)为模板，p1101(SEQ ID No.1)和p1102(SEQ ID No.2)为引物进行PCR反应，引序列分别为：5’-atagatctagaacatgtgagcaaaaggc-3’和5’-acagatctggcccgataggccatcccgggcgcggccgcggtaccctagcttttcaattcaattcatca-3’，PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延伸3min，进行30次循环，最后72延伸10min，目的片断在3kb左右。反应产物回收后以限制性内切酶BglII(本试验所用的限制性内切酶均购自宝生物工程有限公司，大连)酶切，酶切产物中加入T4连接酶(购自宝生物工程有限公司，大连)，16℃反应过夜，酶切产物自连生成质粒pGE1201，转化大肠杆菌DH5α(购自天根公司，北京)，用含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆。

将PCR扩增的5’同源臂以BamHI和NotI酶切，克隆到用BamHI/NotI酶解的上述制备的pGE1201质粒上，形成pGE1202，转化大肠杆菌DH5α，用含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆。酶切鉴定正确。再将PCR扩增的3’同源臂以NotI和KpnI酶切，克隆到用NotI/KpnI酶解的pGE1202上，形成pGE1203，转化大肠杆菌DH5α，用含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆。酶切鉴定正确。再以PstI和KpnI酶切PCR扩增的URA3基因，克隆到用PstI/KpnI酶解的pGE1203上，形成pGE1203-URA3，转化大肠杆菌DH5α，用含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆。酶切鉴定正确。将pGE1203-URA3以NotI酶切，再用CIAP(购自宝生物工程有限公司)去磷酸化，与同样用NotI酶切的ADE基因以T4连接酶连接，形成pGE1203-ADE-URA3，转化大肠杆菌DH5α，用含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，经PCR鉴定和酶切鉴定表明筛选出的克隆在NotI位点处插入了两个串联的ADE基因。

2.敲除质粒对毕赤酵母的转化

用毕赤酵母GS115(购得Invitrogen life technologies，carlsbad，california92008，USA)，通过Lin Cereghino，G.P.等(New selectable marker/auxotrophichost strain combinations for molecular genetic manipulation of Pichia pastoris.2001，Gene，263，159-69.)提供的方法构建获得含有(ade^-、ura3^-、arg^-、his^-)标记的毕赤酵母JC308。敲除质粒采用电转化法将敲除质粒转化入毕赤酵母JC308中，电转化的方法为本领域所共知的(如A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000)。电转化前，先将敲除质粒用3’同源臂上Bgl II酶切位点线性化，然后电转入制备好的感受态细胞中，涂布于含有精氨酸和组氨酸的MD培养基(YNB 1.34％，生物素4×10^-5％，葡萄糖2％，琼脂1.5％，精氨酸100mg/ml，组氨酸100mg/ml)上。待培养基上长出克隆后，随机挑取几个克隆提取基因组，通过PCR的方法鉴定敲除质粒是否正确整合到了染色体上的目标位点，PCR反应所用的两对引物分别是：OCH1基因3’同源臂外的引物序列p1108和ADE基因的5’端引物pADE-5，以及引物p1108和OCH1基因5’同源臂外的引物序列p1107。引物p1107(SEQ ID No.7)和p1108(SEQ IDNo.8)的序列分别为：5’-gcctgacagccttaaagagcc-3’和5’-tcttgtcaattcggaaagtgtc-3’，引物pADE-5的序列分别为：5’-atttgcggccgctattcacgagtcagtctgactct-3’。PCR反应所用的酶为rTaq(购自宝生物工程有限公司)，PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延伸3min进行30次循环，最后72延伸10min。通过凝胶电泳分析PCR产物条带的大小，以p1108和pADE-5为引物所扩增的条带在2.4kb左右，以p1107和p1108为引物不能扩增出条带，证明了随机挑选的几个克隆中，敲除质粒已经正确整合到了染色体上的目标位点。电泳图见图2。

将其中一个克隆接种于YPD培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)中，25℃摇床培养12小时后，将菌液涂布于腺嘌呤缺陷的5-FOA培养基(YNB 1.34％，生物素4×10^-5％，葡萄糖2％，琼脂1.5％，精氨酸100mg/ml，组氨酸100mg/ml，尿嘧啶100mg/ml，5-FOA 0.1％)(其中，YNB，为无氨基酸酵母氮源，购自北京欣经科生物技术有限公司，5-FOA为5-氟尿嘧啶，购自Sigma-aldrich P.O.BOX14508，St.Louis，MO 63178USA)，置于25℃培养。

3.PCR鉴定阳性克隆

待腺嘌呤缺陷的5-FOA培养基上长出克隆后，提取这些克隆的基因组，进行PCR鉴定：以基因组为模板，鉴定引物为染色体上OCH1基因同源臂外的序列p1107和p1108，引物p1107(SEQ ID No.7)和p1108(SEQ ID No.8)的序列分别为：5’-gcctgacagccttaaagagcc-3’和5’-tcttgtcaattcggaaagtgtc-3’。同时将以野生型JC308菌株的基因组为模板的PCR反应体系设为对照。PCR反应所用的酶为LA Taq(购自宝生物工程有限公司)，PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延伸3min30sec进行30次循环，最后72延伸10min。将产物进行琼脂糖凝胶电泳，以野生型JC308菌株基因组为模板的PCR产物大小在2.8kb左右，以待鉴定的克隆基因组为模板的PCR产物大小在4.8kb左右，证明了α-1，6-甘露糖转移酶敲除的菌株构建正确。其相应位置已经被ADE基因取代。电泳图见图3。这个通过二次同源重组后，用ADE基因替代JC308菌株基因组中OCH1基因后获得的毕赤酵母菌株被命名为GJK0601，菌种保藏号为CGMCC No.1853。

实施例2.融合蛋白HSA/GM-CSF在OCH1敲除菌中的表达

HSA/GM-CSF是人血清白蛋白(HSA)与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的融合蛋白，具有两个N-糖基化的位点。该融合蛋白可以刺激粒细胞、巨噬细胞增殖，具有重要的临床应用价值，但是普通毕赤酵母表达的该融合蛋白为过度糖基化修饰的，这严重影响了其临床应用。本实施例公开了一种用α-1，6-甘露糖转移酶敲除的菌株表达非过度糖基化修饰的HSA/GM-CSF的方法。

1.HSA/GM-GM-CSF表达

用PCR的方法从人肝胎cDNA文库(购自Clontech Laboratories Inc.1290Terra Bella Ave.Mountain View，CA94043，USA)获得hGM-CSF cDNA，所用的引物为GMCSF1：5’ATGGATCC GCACCC GCC CGC TCG CCC AGC 3’(SEQ ID No.15)和GMCSF2：5’ATGAATTC TTA CTC CTG GAC TGG CTCCCA GCA3’(SEQ ID No.16)。PCR方法为：100μl反应体系中加入1μl人肝胎cDNA文库，20μmol/L的GMCSF1、GMCSF2引物各3μl，2mmol/L的dNTP 10μl，10X反应缓冲液10μl，pfu DNA聚合酶5U，(dNTP、反应缓冲液、pfu DNA聚合酶均为上海生物工程技术服务有限公司产品)。PCR条件为94℃变性1分钟，52℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟，循环35次。凝胶电泳回收hGM-CSF cDNA(约0.5kb)。用BamH I和EcoR I酶切，琼脂糖凝胶电泳回收纯化。

用PCR方法从上述人肝胎cDNA文库获得带有信号肽和前肽编码序列的HSA cDNA，所用的引物为：HSA1：5’GCTTCGAAACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCT3’(SEQ ID No.17)和HSA2：5’TAGGATCCACCACCACCAAGGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC3’(SEQ ID No.18)。PCR条件为：100μl反应体系中，加入1μl人肝胎cDNA文库，20μmol/L的HSA1和HSA2引物各3μl，2mmol/L的dNTP，10μl，10X反应缓冲液10μl，TaqplusI DNA聚合酶5U。PCR条件为94℃变性1分钟，52℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，35个循环后，再72℃延伸10分钟。用DNA片段回收试剂盒回收纯化约1.8KD的HSAcDNA目标带，用NspV/BamHI切。(实验中的TaqplusI DNA聚合酶、内切酶、连接酶、试剂盒等购自上海生工生物工程技术服务有限公司和北京博大泰克生物基因技术有限公司)。

为了将HSA与GM-CSF以融合蛋白形式从毕赤酵母分泌表达，我们选择pHIL-D2质粒作为载体(Invitrogen life technologies，carlsbad，california 92008，USA)。在该载体AOX启动子下游NspV与EcoRI位点间插入HSA/GM-CSF基因，因pHIL-D2载体上有两个NspV位点，为了方便操作，首先pHIL-D2载体用ClaI/Sal酶切成3段，回收4kb片段，自身连接后命名为pD3载体。pD3载体用NspV/EcoRI切，回收线性化载体，与上述用BamHI/EcoRI切的GM-CSFcDNA的片段，及用NspV/BamHI切的HSAcDNA的片段，用T4连接酶催化连接，转化JM109，挑选阳性克隆JM109(pD3HSAGMCSF)，测序正确，其编码融合蛋白的核苷酸序列及对应的氨基酸序列见Seq ID NO.13和Seq IDNO.14。

pD3HSAGMCSF质粒，用ClaI/ScaI切，电泳回收线性化的6.3kb片段，pHIL-D2空载体用ClaI/ScaI切回收约4.2kb的片段。T4连接酶催化连接pD3HSAGMCSF的6.3kb片段与pHIL-D2的4.2kb片段，连接产物转化JM109后，辅于含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂平皿，挑选阳性克隆，抽提质粒，酶切鉴定，获得HSA/GM-CSF表达质粒pD2HSAGMCSF，该质粒的结构见附图4。

用筛选到的α-1，6-甘露糖转移酶缺失的菌株CGMCC No.1853和野生型菌株GS 115(Invitrogen life technologies，carlsbad，california 92008，USA)制备电转感受态，将带有上述表达载体pD2HSAGMCSF以SacI线性化后分别电转入这两种菌的感受态细胞中，将电击后的菌液涂布于含有尿嘧啶和精氨酸的MD培养基(YNB 1.34％，生物素4×10^-5％，葡萄糖2％，琼脂1.5％，精氨酸100mg/ml，尿嘧啶100mg/ml)上，待长出转化子后将其接种到2mlYPD培养基中，25℃培养2天后，以5％的接种量接种到BMGY培养基(YNB 1.34％，生物素4×10^-5％，1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％甘油)中，48小时后加入0.5％甲醇进行诱导表达，每12个小时补加一次甲醇，诱导72小时后离心取上清；

2.SDS-PAGE检测表达产物

取转入融合蛋白HSA/GM-CSF的α-1，6-甘露糖转移酶缺失的菌株和野生型菌株的表达上清进行SDS-PAGE，蛋白质的SDS-PAGE电泳方法为本领域所共知的(如D.R.马歇克等，《蛋白质纯化与鉴定实验指南》，科学出版社，1999)。电泳图见图5A。

由电泳结果可知，野生型菌株表达的HSA/GM-CSF主带的分子量大于97KD。明显大于HSA/GM-CSF蛋白部分的理论分子量(81KD)，其2个糖基的分子量高达15KD，即单个糖基的分子量约为7000-8000Da，且表达带产生了明显的拖尾现象，因而表达的HSA/GM-CSF为过度糖基化蛋白。

而敲除了α-1，6-甘露糖转移酶的菌株表达的HSA/GM-CSF分子量约为85KD，且表达带清晰，没有拖尾现象，其单个糖基的分子量约为2000Da，与正常糖基的分子量相近。因而表达的HSA/GM-CSF为非过度糖基化的蛋白。

3.Western blot检测表达产物

取转入融合蛋白HSA/GM-CSF基因的α-1，6-甘露糖转移酶缺失的菌株和野生型菌株GS115的表达上清进行Western blot检测。一抗为兔抗人血清白蛋白抗体(1∶5000)(自制，人血白蛋白，购自哈尔滨世亨生物工程药业股份有限公司，中国，哈尔滨，免疫方法按刘玉斌等主编的《动物免疫学实验技术》，(吉林大学科学技术出版社，1989，中国吉林)的方法免疫家兔制备)，二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体(1∶10000)(华美生物过程公司，洛阳)，Western blot的操作方法为本领域所共知的(如F.奥斯伯等，《精编分子生物学实验指南》，科学出版社，1998)。用ECL试剂盒(AmershamBiosciences，北京)方法显色，显色照片见图5B。ECL显色结果与SDS-PAGE结果一致，说明表达蛋白为HSA/GM-CSF融合蛋白。

产生这种结果可能的原因是：融合蛋白HSA/GM-CSF有两个糖基化位点，野生型菌株GS115表达的该蛋白由于不均一的糖基化造成了分子量的不均一，使得表达带产生拖尾。

敲除菌株由于α-1，6-甘露糖转移酶的缺失，使得蛋白的糖基化大部分停留在8个甘露糖的结构，所以表达带清晰，没有拖尾，且分子量比野生菌的表达带略小。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所

<120>a-1，6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株及其构建方法

<130>

<160>18

<170>ntIn version 3.3

<210>1

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

atagatctag aacatgtgag caaaaggc                                       28

<210>2

<211>68

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

acagatctgg cccgataggc catcccgggc gcggccgcgg taccctagct tttcaattca    60

attcatca                                                             68

<210>3

<211>44

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

acgcggccgc ggatcctaat gaggccaagg aattggagct ggct      44

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

agggtacctg ggaagagatg tcttgtgcac                       30

<210>5

<211>29

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

acggatcccc ggaaaaccga gagaactct                         29

<210>6

<211>33

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

acgcggccgc agagcgatag agaatgttcc agg     33

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>7

gcctgacagc cttaaagagc c                  21

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<400>8

tcttgtcaat tcggaaagtg tc                  22

<210>9

<211>34

<212>DNA

<213>人工合成

<400>9

aaccaactgc agtggggaga taaccacctt tgac     34

<210>10

<211>33

<212>DNA

<213>人工合成

<400>10

tttcggtacc ttgctggcta ctccttgagt ctg      33

<210>11

<211>35

<212>DNA

<213>人工合成

<400>11

atttgcggcc gctattcacg agtcagtctg actct    35

<210>12

<211>35

<212>DNA

<213>人工合成

<400>12

atttgcggcc gcaatcctcg agaagcaagc tattg    35

<210>13

<211>2241

<212>DNA

<213>人肝胎cDNA文库

<400>13

ttcgaaacca tgaagtgggt aacctttatt tcccttcttt ttctctttag ctcggcttat    60

tccaggggtg tgtttcgtcg agatgcacac aagagtgagg ttgctcatcg gtttaaagat    120

ttgggagaag aaaatttcaa agccttggtg ttgattgcct ttgctcagta tcttcagcag    180

tgtccatttg aagatcatgt aaaattagtg aatgaagtaa ctgaatttgc aaaaacatgt    240

gtagctgatg agtcagctga aaattgtgac aaatcacttc ataccctttt tggagacaaa    300

ttatgcacag ttgcaactct tcgtgaaacc tatggtgaaa tggctgactg ctgtgcaaaa    360

caagaacctg agagaaatga atgcttcttg caacacaaag atgacaaccc aaacctcccc    420

cgattggtga gaccagaggt tgatgtgatg tgcactgctt ttcatgacaa tgaagagaca    480

tttttgaaaa aatacttata tgaaattgcc agaagacatc cttactttta tgccccggaa    540

ctccttttct ttgctaaaag gtataaagct gcttttacag aatgttgcca agctgctgat    600

aaagctgcct gcctgttgcc aaagctcgat gaacttcggg atgaagggaa ggcttcgtct    660

gccaaacaga gactcaaatg tgccagtctc caaaaatttg gagaaagagc tttcaaagca    720

tgggcagtgg ctcgcctgag ccagagattt cccaaagctg agtttgcaga agtttccaag    780

ttagtgacag atcttaccaa agtccacacg gaatgctgcc atggagatct gcttgaatgt    840

gctgatgaca gggcggacct tgccaagtat atctgtgaaa atcaggattc gatctccagt    900

aaactgaagg aatgctgtga aaaacctctg ttggaaaaat cccactgcat tgccgaagtg    960

gaaaatgatg agatgcctgc tgacttgcct tcattagctg ctgattttgt tgaaagtaag    1020

gatgtttgca aaaactatgc tgaggcaaag gatgtcttcc tgggcatgtt tttgtatgaa    1080

tatgcaagaa ggcatcctga ttactctgtc gtgctgctgc tgagacttgc caagacatat    1140

gaaaccactc tagagaagtg ctgtgccgct gcagatcctc atgaatgcta tgccaaagtg    1200

ttcgatgaat ttaaacctct tgtggaagag cctcagaatt taatcaaaca aaactgtgag    1260

ctttttaagc agcttggaga gtacaaattc cagaatgcgc tattagttcg ttacaccaag    1320

aaagtacccc aagtgtcaac tccaactctt gtagaggtct caagaaacct aggaaaagtg    1380

ggcagcaaat gttgtaaaca tcctgaagca aaaagaatgc cctgtgcaga agactatcta    1440

tccgtggtcc tgaaccagtt atgtgtgttg catgagaaaa cgccagtaag tgacagagtc    1500

acaaaatgct gcacagagtc cttggtgaac aggcgaccat gcttttcagc tctggaagtc    1560

gatgaaacat acgttcccaa agagtttaat gctgaaacat tcaccttcca tgcagatata  1620

tgcacacttt ctgagaagga gagacaaatc aagaaacaaa ctgcacttgt tgagcttgtg  1680

aaacacaagc ccaaggcaac aaaagagcaa ctgaaagctg ttatggatga tttcgcagct  1740

tttgtagaga agtgctgcaa ggctgacgat aaggagacct gctttgccga ggagggtaaa  1800

aaacttgttg ctgcaagtca agctgcctta ggccttggtg gtggtggatc cgcacccgcc  1860

cgctcgccca gccccagcac gcagccctgg gagcatgtga atgccatcca ggaggcccgg  1920

cgtctcctga acctgagtag agacactgct gctgagatga atgaaacagt agaagtcatc  1980

tcagaaatgt ttgacctcca ggagccgacc tgcctacaga cccgcctgga gctgtacaag  2040

cagggcctgc ggggcagcct caccaagctc aagggcccct tgaccatgat ggccagccac  2100

tacaagcagc actgccctcc aaccccggaa acttcctgtg caacccagac tatcaccttt  2160

gaaagtttca aagagaacct gaaggacttt ctgcttgtca tcccctttga ctgctgggag  2220

ccagtccagg agtaagaatt c                                            2241

<210>14

<211>741

<212>PRT

<213>人肝胎cDNA文库

<400>214

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1                  5                        10                      15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala

              20                      25                      30

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu

          35                      40                      45

Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val

     50                      55                      60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp

65                      70                      75             80

Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

                  85                      90                      95

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala

              100                     105                     110

Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln

         115                     120                     125

His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

     130                     135                     140

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys

145                     150                     155                     160

Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro

                    165                     170                     175

Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys

             180                     185                     190

Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu

         195                     200                     205

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys

    210                     215                     220

Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val

225                     230                     235                     240

Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser

                  245                     250                     255

Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly

              260                     265                     270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile

         275                     280                     285

Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu

    290                     295                     300

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp

305                     310                     315                     320

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser

                  325                     330                     335

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly

              340                     345                     350

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val

          355                     360                     365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

     370                     375                     380

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu

385                     390                     395                     400

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys

                  405                     410                     415

Glu Leu Phe Lys Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu

             420                     425                     430

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val

         435                     440                     445

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His

    450                     455                     460

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val

465                     470                     475                     480

Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg

                 485                     490                     495

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe

              500                     505                     510

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala

          515                     520                     525

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu

     530                     535                     540

Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys

545                     550                     555                     560

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

                    565                     570                     575

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe

              580                     585                     590

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly

          595                     600                     605

Leu Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr

     610                     615                     620

Gln Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu

625                     630                     635                     640

Asn Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val

                  645                     650                     655

Ile Ser Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg

               660                     665                     670

Leu Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys

         675                     680                     685

Gly Pro Leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro

     690                     695                     700

Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Thr Ile Thr Phe Glu Ser Phe

705                     710                     715                     720

Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp

                  725                     730                     735

Glu Pro Val Gln Glu

              740

<210>15

<211>29

<212>DNA

<213>人工合成

<400>15

atggatccgc acccgcccgc tcgcccagc                29

<210>16

<211>32

<212>DNA

<213>人工合成

<400>16

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<210>17

<211>37

<212>DNA

<213>人工合成

<400>17

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<210>18

<211>41

<212>DNA

<213>人工合成

<400>18

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Claims (10)

1.α-1，6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株，保藏号为CGMCC No.1853。

2.权利要求1所述的α-1，6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株CGMCCNo.1853制备的HSA/GM-CSF融合蛋白，具有序列表SEQ ID No.13所示的氨基酸序列，糖基化蛋白的分子量小于97KD。

3.权利要求1所述的α-1，6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

a)构建敲除质粒：质粒上包括待敲除基因两侧的同源臂序列，两个同源臂之间插入一个选择性标记，质粒上还带有URA3基因；所述同源臂序列是指目标基因两侧的基因序列，在两侧同源臂之间缺失或突变一段目标基因；

b)将敲除质粒以同源臂序列上的单一限制性酶切位点线性化后转入到宿主菌中，用具有选择压力的培养基筛选质粒DNA插入靶序列的阳性克隆；

c)将筛选到的阳性克隆在复杂培养基或含尿嘧啶的简单培养基中进一步扩大培养，用含有5-氟乳清酸和与质粒上同源臂间的选择性标记对应的选择压力的培养基筛选获得目标基因敲除的菌株。

4.根据权利要求3所述的α-1，6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株的构建方法，其特征在于：所述同源臂序列长度大于200bp。

5.根据权利要求4所述的α-1，6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株的构建方法，其特征在于：所述同源臂序列长度为500bp-2000bp。

6.根据权利要求3所述的α-1，6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株的构建方法，其特征在于：所述选择性标记为营养缺陷型标记或抗生素抗性基因标记。

7.根据权利要求6所述的α-1，6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株的构建方法，其特征在于：所述营养缺陷型标记为ADE、ARG或His。

8.根据权利要求6所述的α-1，6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株的构建方法，其特征在于：所述抗生素抗性基因标记为Zeocin或G418。

9.根据权利要求3所述的α-1，6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株的构建方法，其特征在于：所述宿主菌为URA3基因缺失或突变的毕赤酵母菌株

10.根据权利要求9所述的α-1，6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株的构建方法，其特征在于：所述毕赤酵母菌株为JC307或JC308。

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