CN102766648A - 人血清白蛋白与白介素1受体拮抗剂融合蛋白的表达系统 - Google Patents
人血清白蛋白与白介素1受体拮抗剂融合蛋白的表达系统 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种人血清白蛋白与白介素1受体拮抗剂融合蛋白的表达系统,包括宿主细胞和转化入宿主细胞的表达载体,所述表达载体包括插入有融合蛋白基因的第一表达载体和插入有二硫键异构酶基因的第二表达载体,所述融合蛋白基因包括人血清白蛋白基因和白介素1受体拮抗剂基因,所述宿主细胞为毕赤酵母GS115。本发明构建PDI与IGH共表达的宿主,使得IGH的表达量显著提高,由于PDI在胞内表达,而IGH分泌表达到胞外,所以收集的培养基上清中IGH浓度增加的同时不会新产生其他蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白表达系统,尤其涉及一种人血清白蛋白与白介素1受体拮抗剂融合蛋白的表达系统。
背景技术
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近些年来一个较为成功的外源蛋白真核表达系统,与大肠杆菌表达系统相比,它能更好地表达结构复杂的蛋白质,并且能够完成如二硫键形成这样的翻译后修饰。与哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统相比,它具有操作简单、表达量高、容易产业化放大等优势。
白介素1受体拮抗剂(Interleukin 1 receptor antagonist,IL1ra),是一种可与IL1受体结合的蛋白,当其与IL1受体结合后可阻断IL1的生物学活性。因此一定浓度的IL1ra能使这两个细胞因子在生理学和病理生理学以及炎症反应中的生物学活性被中和。2001年11月14日美国FDA正式公布批准美国Amgen公司生产的商品名为Kineret的重组(rh-)IL1ra用于治疗类风湿性关节炎,批准适应症为“18岁以上的中度和严重的类风湿性关节炎患者,在使用一种或多种改善疾病的抗风湿药物后失效时,明显减轻病人的体征和症状”。
由于IL1ra分子量只有17kDa,易被肾小球滤过,因而在临床治疗时,血药半衰期较短,一般需要大剂量频繁用药,如100mg/day。为了提高重组IL1ra在体内的血药时间,中国专利200810060568.7利用基因工程手段将其与HSA融合后插入毕赤酵母中并表达,经融合后的蛋白(IGH)在小鼠体内血药半衰期显著提高,但该融合蛋白基因在毕赤酵母中为单拷贝,蛋白表达量不够高。
发明内容
本发明提供了一种人血清白蛋白与白介素1受体拮抗剂融合蛋白的表达系统,以解决现有表达系统融合蛋白表达量不高的问题。
一种人血清白蛋白与白介素1受体拮抗剂融合蛋白的表达系统,包括宿主细胞和转化入宿主细胞的表达载体,所述表达载体包括插入有融合蛋白基因的第一表达载体和插入有二硫键异构酶基因的第二表达载体,所述融合蛋白基因包括人血清白蛋白基因和白介素1受体拮抗剂基因,所述宿主细胞为毕赤酵母GS115。
二硫键异构酶(PDI)是硫氧化还原酶家族中的一种,主要功能是在内质网上催化新合成的蛋白形成正确的二硫键。在毕赤酵母的内质网上有一套严格的质量控制体系,只有形成正确结构的蛋白才能从内质网分泌到高尔基体当中。如果蛋白没有形成正确的结构,则会被降解或积聚在内质网上,最终降低该蛋白的表达。IGH融合蛋白中含有18对二硫键,更多的PDI可以帮助融合蛋白形成正确的二硫键,以提高表达量。
在第一表达载体中包含IGH融合蛋白基因为目的基因,它插入在启动子的下游,在第二表达载体中包含二硫键异构酶基因为目的基因,它同样插入在启动子的下游。
在第一表达载体中,人血清白蛋白基因和白介素1受体拮抗剂基因可以直接连接,也可以通过连接肽序列连接,所述连接肽序列是指编码连接肽的DNA序列,连接肽用于连接人血清白蛋白和白介素1受体拮抗剂。该连接肽的氨基酸残基序列可以由甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸中的一种或多种连接组成,具体可以为[GGGS]n,n为不大于4的自然数。在融合蛋白基因中,人血清白蛋白基因和白介素1受体拮抗剂基因两者之间的相对位置是任意的。所述融合蛋白基因还包括限制性酶切位点,使得酶切后可以产生粘性末端,便于基因序列的连接。关于融合蛋白的基因结构可以参考中国专利200810060568.7公开的内容。
所述第一表达载体和第二表达载体为真核表达载体,优选的,所述第一表达载体包含信号肽,所述第二表达载体不包含信号肽,如此融合蛋白可以分泌到胞外,而PDI可以存留在胞内,便于融合蛋白的分离纯化。更优选的,所述第一表达载体和第二表达载体的原始载体优选为pPIC系列载体,其中第一表达载体的原始载体优选为pPICZαB,第二表达载体的原始载体优选为pPIC3.5K。
在本发明中第一表达载体可以为单拷贝,但为了提高表达量,最好选用为多拷贝,拷贝数至少为2个,优选为3~4个。
本发明还提供所述表达系统的构建方法,包括:
(a)用限制性内切酶将融合蛋白基因(IGH基因)从pPIC9-IGH上切下并回收;
(b)将步骤(a)中得到的IGH基因插入到pPICZαB相应的酶切位点中;
(c)将步骤(b)中得到的pPICZαB-IGH线性化后电转到表达宿主GS115中,转化了的细胞在含有Zeocin的平板上筛选单克隆;
(d)鉴定步骤(c)中得到的单克隆菌株表达量及IGH基因拷贝数。
(e)将二硫键异构酶(PDI基因)插入pPIC3.5K,得到pPIC3.5K-PDI;
(f)将步骤(e)中得到的pPIC3.5K-PDI载体用BspE I线性化后电转化步骤(d)得到的含有pPICZαB-IGH的GS115菌株,转化后的细胞先涂布到RDB平皿,然后在含有0.5或1.5mg/ml Geneticin的YPD平皿上挑选转化子;
(g)将步骤(f)中挑选到的转化子在摇瓶条件下表达IGH蛋白,培养基上清用SDS-PAGE分析表达量。
步骤(a)中,IGH基因即为本发明所述的融合蛋白基因,其碱基序列如SEQ ID NO.1所示,质粒pPIC9-IGH结构及其构建方法已在中国专利200810060568.7中公开,切下的IGH基因上游序列含有Xho I酶切位点,下游含有Not I酶切位点。
步骤(b)中,空质粒pPICZαB首先用Xho I和Not I酶切,然后与IGH基因连接,得到pPICZαB-IGH质粒。
步骤(c)中,pPICZαB-IGH质粒用Pme I线性化后电转化GS 115表达宿主,转化后的细胞涂布于含有100,700或1500μg/mLZeocin的平板上筛选单克隆菌株。
步骤(d)中,将步骤(c)中挑选的克隆在摇瓶条件下表达IGH蛋白,培养基上清用SDS-PAGE分析表达量,挑选的克隆中IGH基因的拷贝数用RT-PCR鉴定,可参考Norden等(Increasing gene dosage greatly enhancesrecombinant expression of aquaporins in Pichia pastoris,BMC biotechnology,2011)公开的方法。
步骤(e)中,PDI基因的碱基序列可以如SEQ ID NO.2所示。
毕赤酵母GS 115、质粒pPICZαB为商业化产品(Invitrogen Corp.SanDiego.California.USA)。
与现有技术相比较,本发明具有的有益效果为:
(1)毕赤酵母自身分泌到培养基中的蛋白很少,因此,高分泌的外源蛋白易从培养基中分离;另外与酿酒酵母相比,赤酵母不产生过度的糖基化,所分泌的糖蛋白的免疫原性较低,更利于临床应用。
(2)本发明构建PDI与IGH共表达的宿主,使得IGH的表达量显著提高,由于PDI在胞内表达,而IGH分泌表达到胞外,所以收集的培养基上清中IGH浓度增加的同时不会新产生其他蛋白。
附图说明
图1为重组质粒pPICZαB-IGH的构建示意图。
图2为IGH融合蛋白在不同Zeocin浓度下挑选得到的克隆菌株的PAGE分析。a为SDS-PAGE电泳图,其中L1-L5为100μg/mLZeocin的平板上筛选单克隆菌株,H1-H4为700μg/mLZeocin的平板上筛选单克隆菌株;b为所对应的菌株用蛋白定量软件Quantity One定量然后计算出单位菌体表达量比较(方差来自三个平行)。
图3为重组质粒pPIC3.5K-PDI的示意图。
图4为导入了PDI或BiP(immunoglobulin binding protein)基因的多拷贝IGH宿主表达上清SDS-PAGE分析图。a为SDS-PAGE电泳图,其中1为IGH单拷贝菌株,2为步骤(c)得到的多IGH拷贝菌株,3为0.5mg/ml Geneticin的YPD平皿上挑选的转了PDI的多IGH拷贝单克隆菌株,4,5为1.5mg/ml Geneticin的YPD平皿上挑选的转了PDI的多IGH拷贝单克隆菌株,6为0.5mg/ml Geneticin的YPD平皿上挑选的转了BiP的多IGH拷贝单克隆菌株,7,8为1.5mg/ml Geneticin的YPD平皿上挑选的转了BiP的多IGH拷贝单克隆菌株。b为所对应的菌株用Biorad公司的蛋白定量软件Quantity One定量然后计算出单位菌体表达量比较(方差来自三个平行)。
图5为Real Time PCR鉴定PDI是否被诱导结果图。
图6为Real Time PCR鉴定BiP是否被诱导结果图。
具体实施方式
实施例1构建质粒pPIC9-IGH,并获得可表达IGH蛋白的DNA序列
使用专利申请号200810060568.7公开的质粒PGEM-T-HSA和PGEM-T-IL1ra作为模板,根据IL1ra基因和HSA基因的序列设计引物IL1ra up(SEQ ID NO.16)、IL1ra dn(SEQ ID NO.17)、HSAup(SEQ ID NO.18)和HSA dn(SEQ ID NO.19)进行PCR扩增。鉴于BamH I酶切位点的碱基序列正好编码-GS-,特将编码连接肽-GGGGS-的密码子设计在IL1ra dn 5’端,如此也设计入了BamH I酶切位点。且在HSA up 5’端也添加BamHI酶切位点,如此可通过BamH I酶切、连接从而融合IL1ra基因和HSA基因。将IL1ra基因扩增产物用Xho I和BamH I酶切后回收,将HSA基因扩增产物用BamH I和EcoR I酶切后回收,将pPIC9空质粒用Xho I和EcoR I酶切后回收。将酶切后的IL1ra基因、HSA基因和pPIC9基因三片段相连得到质粒pPIC9-IGH,其中IGH表达序列见SEQ ID NO.1。
用Xho I和Not I双酶切质粒pPIC9-IGH,将含有IGH基因片段的酶切产物电泳纯化后用DNA片段回收试剂盒回收纯化目的条带。
实施例2重组质粒pPICZαB-IGH构建
将空pPICZαB载体用Xho I和Not I酶切,电泳回收载体片段。将酶切后的pPICZαB载体和实例1中得到的IGH表达序列以适当比例混合,用T4连接酶在16℃水浴中连接12小时,形成pPICZαB-IGH(构建原理见图1)。pPICZαB-IGH转化入DH5α后,铺于含25μg/mL Zeocin的LB琼脂平皿,37℃培养过夜。挑选平皿上数个克隆接种5mL含25μg/mLZeocin的LB液体培养基中,37℃培养过夜。获得的阳性克隆送上海生工测序验证正确。
实施例3重组质粒pPICZαB-IGH转化GS115
将实例2中得到的验证正确的pPICZαB-IGH质粒用Pme I线性化后以电转化的方式转化入毕赤酵母GS115,转化后的细胞在YPD液体培养基中30℃孵育2小时,然后涂布到含有100,700或1500μg/mL Zeocin的YPDS琼脂平皿(1%yeast extract,2%peptone,2%葡萄糖,1M山梨醇,2%琼脂糖,1M山梨醇)。在30℃培养3天后,100,700或1500μg/mL Zeocin的YPDS琼脂平皿上分别长出约200个,4个,0个单菌落。在100和700μg/mL Zeocin的YPDS琼脂平皿上分别挑取5个(命名为L1~5)和4个(命名为H1~4)单菌落。
实施例4融合蛋白IGH在多拷贝宿主中提高表达
参考Norden等(Increasing gene dosage greatly enhances recombinantexpression of aquaporins in Pichia pastoris,BMC biotechnology,2011)公开的方法,用Real Time PCR确定实施例3中挑选的9个克隆IGH拷贝数,结果见表1。
表1
Strain | IH copy number | Strain | IH copy number |
L1 | 1.2±0.3 | H1 | 2.0±0.3 |
L2 | 0.9±0.2 | H2 | 3.2±0.2 |
L3 | 0.9±0.2 | H3 | 3.5±0.7 |
L4 | 0.8±0.1 | H4 | 3.2±0.3 |
L5 | 1.2±0.1 |
将实施例3中挑选的9个克隆接种至装有30mL BMGY培养基(1%yeast extract,2%peptone,100mmol/L磷酸钾,pH6.0,4×10-5%生物素,1.34%无氨基酸酵母氮源,1%甘油)的100mL锥形瓶,200转/分钟,30℃培养至OD=2~6后,换成30mL BMMY培养基(1%yeast extract,2%peptone,100mmol/L磷酸钾,pH6.0,4×10-5%生物素,1.34%无氨基酸酵母氮源,1%甲醇)。然后每隔24小时补加1%总培养基体积的甲醇,诱导72小时后离心取上清,SDS-PAGE分析表达产物,每个菌株同时表达三份作为平行,SDS-PAGE结果参见图2.a,完整IGH条带用Quantity OneSoftware定量并用培养基OD600均一化后的结果参见图2.b。结合表1和图2可以看出含有3~4个IGH基因拷贝的宿主表达量显著高于单拷贝宿主。
实施例5PDI基因的扩增
用PCR方法从酵母基因组中获得PDI片段,所用的引物PDIup(SEQID NO.3)和PDI dn(SEQ ID NO.4)用寡聚核苷酸合成仪合成。用于扩增的上下游引物中都引入EcoR I酶切位点和保护碱基。
PDI up:5’-GCGAATTCACCATGCAATTCAACTGGGATATT-3’
PDI dn:5’-GCGAATTCTTAAAGCTCGTCGTGAGCGTC-3’
PCR反应条件:50μL反应体系中,加入1μL酵母基因组,10μmol/L的上下游引物各1μL,2.5mmol/L的dNTP mixture 4μL,5×Buffer(Mg2+plus)10μL,PrimeSTAR DNA聚合酶0.5μL,剩余用ddH2O补足。用EPPENDORF公司的(型号为Matstercycler Gradient)PCR仪,PCR反应条件为98℃预变性5min;然后98℃变性20s;55℃退火30s;72℃延伸2min,共30个循环以后,再72℃延伸10min。通过1%凝胶电泳分析得到预期为1573bp的PCR产物。
实施例6重组载体pPIC3.5K-PDI的构建
将实施例5中得到的PDI扩增产物电泳纯化后用DNA片段回收试剂盒回收纯化目的条带。纯化后的PCR产物用EcoR I酶切,电泳回收;质粒pPIC3.5K同样用EcoR I酶切,电泳回收线性化后的片段。将酶切后的PDI片段与载体pPIC3.5K以3∶1比例混合,用T4连接酶在16℃水浴中连接过夜后转化入DH5α感受态细胞中。转化后的DH5α细胞铺于含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂平皿,37℃培养过夜。挑选平皿上数个克隆送上海生工基因测序,测序结果确定PDI插入方向及基因序列正确的DH5α菌株(pPIC3.5K-PDI)用于后续实验。
实施例7pPIC3.5K-PDI转化入含多拷贝IGH的GS115表达菌株
将实施例6中得到的pPIC3.5K-PDI质粒用BspE I线性化后转化入含多拷贝IGH的GS115表达菌株H2(参见表1)。转化后的细胞先铺于RDB琼脂平板(1mol/L山梨醇,1%葡萄糖,4×10-5%生物素,1.34%无氨基酸酵母氮源(YNB,Difeocorp.),0.005%氨基酸混合液(谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸各0.005%),37℃培养3-5天。然后将RDB上的阳性克隆涂布于含有0.5或1.5mg/ml Geneticin的YPD平皿上继续挑选转化子。
实施例8共表达PDI提高IGH表达
选取三个实施例7中得到的转化子用于比较IGH蛋白的表达,其中一个菌株选自0.5mg/ml Geneticin的YPD平皿,两个菌株选自1.5mg/mlGeneticin的YPD平皿。选取单拷贝IGH基因的GS115表达菌株和含有多拷贝IGH基因(用RT-PCR方法确定含有3.2个IGH基因拷贝数)的GS115表达菌株作为对照。将各菌株接种至装有30mL BMGY培养基(1%yeastextract,2%peptone,100mmol/L磷酸钾,pH6.0,4×10-5%生物素,1.34%无氨基酸酵母氮源,1%甘油)的100mL三角瓶,200转/分钟,30℃培养至OD600=2-6后,换成30mL BMMY培养基(1%yeast extract,2%peptone,100mmol/L磷酸钾,pH6.0,4×10-5%生物素,1.34%无氨基酸酵母氮源,1%甲醇),此后添加1%甲醇/24h,诱导3d后离心取上清,SDS-PAGE分析表达产物。
结果参见图2.a,泳道1为单拷贝IGH菌株,泳道2为多拷贝IGH菌株,泳道3为0.5mg/ml Geneticin的YPD平皿上挑选的多拷贝IGH基础上共表达PDI菌株,泳道4和5为1.5mg/ml Geneticin的YPD平皿上挑选的多拷贝IGH基础上共表达PDI菌株,每个菌株表达时做三个平行。图2.b为PAGE条带用软件Qulaitity One分析定量后用菌液的OD600均一化后比较结果,发现当PDI与IGH共表达时,上清中的IGH表达量显著增加。
实施例9共表达PDI菌株中PDI基因mRNA水平鉴定
用RT-PCR来检测共表达宿主(来自实施例3中1.5mg/ml Geneticin的YPD平皿)中的mRNA水平变化,含有多拷贝IGH基因的GS115表达菌株作为对照。
将诱导后的酵母菌体用lyticase破壁,然后用QIAGEN公司的RNeasyMini Kit提取菌体中的mRNA。提取的mRNA作为模板,用TakaRa的PrimeScript RT Reagent Kit试剂盒逆转录为cDNA用于RT-PCR分析。用于PDI转录水平分析的引物分别为RT PDI up(SEQ ID NO.5)和RT PDI dn(SEQ ID NO.6),内参序列为RT ACT up(SEQ ID NO.7)和RT ACT dn(SEQ ID NO.8),用寡聚核苷酸合成仪合成。PCR反应体系:20μL反应体系中,加入2μL cDNA样品,10μmol/L的上下游引物各0.8μL,10μLSYBR Premix Ex Taq II,0.4μL ROX Reference,6μL dH2O。PCR在ABIStepone plus系统上进行,反应条件为95℃预变性30s;然后95℃变性5s;55℃退火30s;72℃延伸30s,共30个循环以后,用溶解曲线分析确定扩增产物特异性良好,每个样品做三个副孔。RT-PCR得到结果用2-ΔΔCt方法计算PDI的mRNA水平变化,结果如图5所示,1号样品为多拷贝IGH菌株,2号样品为1.5mg/ml Geneticin的YPD平皿上挑选的多拷贝IGH基础上共表达PDI菌株,结果显示共表达PDI的菌株中PDI mRNA量提高了约30倍,说明PDI基因可以在pPIC3.5K质粒上启动子的作用下转录水平显著提高。
实施例10在多拷贝IGH基础上共表达BiP
类似实施例5的方法,用PCR方法从酵母基因组中获得BiP(SEQ IDNO.9)片段,所用的引物BiP up(SEQ ID NO.10)和BiP dn(SEQ IDNO.11),用寡聚核苷酸合成仪合成。用于扩增的上下游引物中都引入EcoRI酶切位点和保护碱基。
BiP up:5’-GCGAATTCACCATGCTGTCGTTAAAACCATCT-3’
BiP dn:5’-GCGAATTCCTACAACTCATCATGATCAT-3’
PCR反应采用实施例5的条件,1%凝胶电泳分析得到预期为2056bp的PCR产物。将该片段连接到TaKaRa18-T载体上后,用TaKaRaMutanBEST试剂盒将BiP上本身带有的EcoR I位点除去(不改变翻译后的氨基酸序列),用于突变的引物序列为BiP1125-F(SEQ ID NO.12)和BiP1125-R(SEQ ID NO.13)。突变后的质粒用EcoR I酶切后用1%凝胶电泳回收BiP片段,然后将该片段插入pPIC3.5K相应的位点,经上海生工验证序列以及方向正确的质粒定义为pPIC3.5K-BiP。
类似于实施例7的方法,将pPIC3.5K-BiP质粒转化入含多拷贝IGH的GS115表达菌株(实施例4中的H2菌株)后进行赛选。
类似于实施例8的方法,选取三个含有BiP共表达的转化子用于比较IGH蛋白的表达,其中一个菌株选自0.5mg/ml Geneticin的YPD平皿,两个菌株选自1.5mg/ml Geneticin的YPD平皿。表达上清用SDS-PAGE分析表达产物。结果参见图2.a,泳道3为0.5mg/ml Geneticin的YPD平皿上挑选的多拷贝IGH基础上共表达BiP菌株,泳道4和5为1.5mg/mlGeneticin的YPD平皿上挑选的多拷贝IGH基础上共表达BiP菌株,每个菌株表达时做三个平行。图2.b为PAGE条带用软件Qulaitity One分析定量后用菌液的OD600均一化后比较结果,发现当BiP与IGH共表达时,上清中的IGH表达量反而有所减少。
用RT-PCR来检测BiP共表达宿主(来自实施例3中1.5mg/mlGeneticin的YPD平皿)中的mRNA水平变化,含有多拷贝IGH基因的GS115表达菌株作为对照。用于BiP转录水平分析的引物分别为RT BiP up(SEQ ID NO.14)和RT BiP dn(SEQ ID NO.15),内参序列为RT ACT up(SEQ ID NO.7)和RT ACT dn(SEQ ID NO.8),用寡聚核苷酸合成仪合成。PCR条件和数据处理方法参照实施例9,结果如图6所示,1号样品为多拷贝IGH菌株,2号样品为1.5mg/ml Geneticin的YPD平皿上挑选的多拷贝IGH基础上共表达BiP菌株,结果显示共表达BiP的菌株中BiPmRNA量提高了约10倍,说明BiP基因可以在pPIC3.5K质粒上启动子的作用下转录水平显著提高。但是BiP翻译水平提高后菌株分泌表达的IGH融合蛋白反而有所减少。与共表达PDI菌株表达结果比较后可以发现并非所有的分子伴侣都可以帮助提高IGH融合蛋白表达量。
Claims (10)
1.一种人血清白蛋白与白介素1受体拮抗剂融合蛋白的表达系统,包括宿主细胞和转化入宿主细胞的表达载体,其特征在于,所述表达载体包括插入有融合蛋白基因的第一表达载体和插入有二硫键异构酶基因的第二表达载体,所述融合蛋白基因包括人血清白蛋白基因和白介素1受体拮抗剂基因,所述宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。
2.如权利要求1所述的表达系统,其特征在于,所述融合蛋白基因包括连接人血清白蛋白基因和白介素1受体拮抗剂基因的连接肽序列。
3.如权利要求1所述的表达系统,其特征在于,所述融合蛋白基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
4.如权利要求1所述的表达系统,其特征在于,所述的二硫键异构酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
5.如权利要求1所述的表达系统,其特征在于,所述第一表达载体和第二表达载体的原始载体均为pPIC系列载体。
6.如权利要求5所述的表达系统,其特征在于,所述第一表达载体包含信号肽,所述第二表达载体不包含信号肽。
7.如权利要求6所述的表达系统,其特征在于,所述第一表达载体的原始载体为pPICZαB。
8.如权利要求6所述的表达系统,其特征在于,所述第二表达载体的原始载体为pPIC3.5K。
9.如权利要求1所述的表达系统,其特征在于,所述第一表达载体的拷贝数为3~4个。
10.如权利要求1所述的表达系统,其特征在于,所述第二表达载体的拷贝数为至少两个。
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