CN109929849B

CN109929849B - 一种优化的pGH基因、蛋白及在提高毕赤酵母分泌表达pGH产量和活性中的应用

Info

Publication number: CN109929849B
Application number: CN201910205418.9A
Authority: CN
Inventors: 张玲华; 贾军皓; 曹丁; 马苗鹏; 明飞平
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-03-18
Filing date: 2019-03-18
Publication date: 2021-05-04
Anticipated expiration: 2039-03-18
Also published as: CN109929849A

Abstract

本发明公开了一种优化的pGH基因、蛋白及在提高毕赤酵母分泌表达pGH产量和活性中的应用。所述优化的pGH基因(即pGH‑C基因)的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明将优化后的pGH基因构建重组表达载体并整合到毕赤酵母中，利用重组毕赤酵母菌株在体外获得大量表达的具有高活性的pGH蛋白，该蛋白能够促进猪的生产性能，在生猪养殖领域有很好的应用前景。通过本发明优化的pGH基因和pGH蛋白可以大大提高毕赤酵母分泌表达pGH的产量和活性，对于推动pGH在生猪养殖业中的应用具有重要意义。

Description

一种优化的pGH基因、蛋白及在提高毕赤酵母分泌表达pGH产量和活性中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种优化的pGH基因(即pGH-C基因)、蛋白及在提高毕赤酵母分泌表达pGH产量和活性中的应用。

背景技术

猪生长激素(porcine Growth Hormone，pGH)是由猪脑垂体前叶嗜酸性细胞合成并分泌的一种多肽类激素，具有促进脂肪分解，提高肌肉重量和蛋白质沉积，提高仔猪日增重、胴体的瘦肉率和眼肌面积的功能，能极大改善生猪胴体质量。我国是生猪养殖业和猪肉消费大国，一旦pGH应用于生猪养殖业，必将带来极大的社会经济效益，能很大程度上改变我国生猪养殖业的产业现状。虽然pGH与人生长激素(hGH)具有一定差异性，但不存在固醇类激素、人工合成的生长调节激素等的残留性问题。

目前国内研究者构建的各类pGH表达菌株普遍存在目的蛋白表达效率低下的问题。采用分泌表达方式时，pGH的表达量一般为100～300mg/L；采用胞内表达方式时，目的蛋白纯化成本高昂，产量一般占细胞总蛋白的1/5～1/3。此外，表达的pGH还存在活性较低的问题，阻碍了pGH在生猪养殖中的进一步运用。因此，构建一种能够高效分泌表达具有高活性的pGH的工程菌，对于推动pGH在生猪养殖业中的应用是十分必要的。

目前，未见有关能够提高pGH分泌表达水平及其活性的改良核苷酸序列或蛋白的报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种优化的pGH基因(即pGH-C基因)，优化的pGH基因能提高毕赤酵母分泌表达pGH产量和活性。

本发明的另一目的在于提供一种优化的pGH蛋白。

本发明的另一目的在于提供一种含有上述优化的pGH基因的表达载体。

本发明的另一目的在于提供一种重组菌株。

本发明的另一目的在于提供上述优化的pGH基因、优化的pGH蛋白、表达载体、重组菌株在提高毕赤酵母分泌表达pGH产量和活性中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种提高毕赤酵母分泌表达pGH产量和活性的方法。

本发明的另一目的在于提供上述优化的pGH蛋白在制备促进猪小肠上皮细胞增殖的制剂中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种优化的pGH基因(即pGH-C基因)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一种优化的pGH蛋白(即pGH-C蛋白)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明利用基因序列优化软件COSstar为基础优化工具，结合优化软件eugene以及mRNA局部能量和密码子优化表，对pGH的编码序列进行综合分析改造，优化pGH基因，优化后的序列如SEQ ID NO:1所示，优化的pGH基因命名为pGH-C基因。进一步将优化的pGH基因构建重组表达载体并整合到毕赤酵母中，利用重组毕赤酵母菌株在体外获得大量表达的具有高活性的pGH蛋白。

因此，通过上述优化的pGH基因、优化的pGH蛋白能提高毕赤酵母分泌表达pGH产量和活性。

本发明还请求保护一种含有上述优化的pGH基因的表达载体，所述表达载体可以是任意一种可高效表达pGH-C基因的载体。

优选地，所述表达载体为毕赤酵母蛋白表达载体。

更优选地，所述表达载体为毕赤酵母蛋白表达载体pPICZA-pGH-C。

本发明构建的含有上述优化的pGH基因的毕赤酵母蛋白表达载体，是将毕赤酵母分泌表达载体pPICZA与上述pGH-C基因高保真PCR产物用Xho I与Xba I进行双酶切，用PCR纯化回收试剂盒和DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒分别对基因和质粒双酶切产物进行回收，将回收的基因与质粒用T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，构建得到的pGH重组毕赤酵母分泌表达载体pPICZA-pGH-C。

本发明还请求保护一种重组菌株，所述重组菌株是由上述表达载体pPICZA-pGH-C经Sac I单酶切线性化后，电击转化毕赤酵母野生型X33感受态细胞，再通过高浓度博来霉素抗性筛选得到的重组菌株。

本发明还请求保护上述优化的pGH基因、优化的pGH蛋白、表达载体、重组菌株在提高毕赤酵母分泌表达pGH产量和活性中的应用。

本发明还请求保护一种提高毕赤酵母分泌表达pGH产量和活性的方法，包括如下步骤：将上述重组菌株接种于BMGY液体培养基，于30℃、230rpm条件下培养至OD_595nm值达到5～6；离心收集菌体沉淀，按(4～5)：1的比例将菌体沉淀转接于含1％甲醇的BMMY液体培养基，于28℃、230rpm诱导发酵48小时，每隔24小时向BMMY液体培养基补加甲醇至1％，48小时后离心收集发酵上清液，即得高产量、高活性的pGH蛋白。

本发明人还发现，优化的pGH蛋白具有促进猪小肠上皮细胞增殖的作用，因此，本发明还请求保护上述优化的pGH蛋白在制备促进猪小肠上皮细胞增殖的制剂中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明将优化后的pGH基因构建重组表达载体并整合到毕赤酵母中，利用重组毕赤酵母菌株在体外获得大量表达的具有高活性的pGH蛋白，该蛋白能够促进猪的生产性能，在生猪养殖领域有很好的应用前景。

(2)通过本发明优化的pGH基因和pGH蛋白可以大大提高毕赤酵母分泌表达pGH的产量和活性，对于推动pGH在生猪养殖业中的应用具有重要意义。

附图说明

图1为pGH-C基因重叠PCR结果。其中，泳道M为DL 2000标准分子量Marker，泳道1为引入酶切位点的pGH(484bp)。

图2为pGH-C连接到pEASY-Blunt后菌落筛选DH5α阳性转化子的PCR结果。其中，泳道M为DL 2000标准分子量Marker，泳道1～5为菌落PCR结果。

图3为pGH-C优化后高抗筛选结果。其中，1号板博来霉素浓度为0.5mg/mL，2号板为博来霉素浓度为1mg/mL，3号板博来霉素浓度为2mg/mL。

图4为pGH-C优化后蛋白SDS-PAGE电泳结果。其中，泳道M为3452宽型蛋白标准分子量Marker，泳道1为pGH-C，泳道2为pGH。

图5为pGH-C优化后蛋白诱导表达Western-blot检测结果。其中，泳道M为DualColor标准分子量预染Marker，泳道1为pGH-C，泳道2为pGH。

图6为pGH-C蛋白镍柱纯化结果。其中，泳道M为3452宽型蛋白标准分子量Marker，泳道1为F液，泳道2为W1液，泳道3为W2液，泳道4～13依次为E1～E10液。

图7为可溶pGH-C蛋白对猪小肠上皮细胞增殖的影响。其中，图中数值均为4个重复的平均值，不同处理组对猪小肠上皮细胞的刺激指数与PBS组比较，对照组为未优化的125μg/L pGH的生物活性；*表示差异显著p<0.05，**表示差异极显著p<0.01。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

天然未经过改造的pGH基因序列如SEQ ID NO:3所示，本发明利用基因序列优化软件COSstar为基础优化工具，结合优化软件eugene以及mRNA局部能量和密码子优化表，对pGH的编码序列进行综合分析改造，优化pGH基因，优化后的序列如SEQ ID NO:1所示，优化的pGH命名为pGH-C。

(1)根据本发明提供的优化的pGH基因的核苷酸序列SEQ ID NO:1为表达基因，分泌表达pGH。优化的pGH基因通过体外全基因合成得到。全基因合成得到的pGH-C基因序列高保真PCR结果如图1所示(目的产物上下游分别引入Xho I与Xba I酶切位点)。

(2)构建pGH毕赤酵母重组分泌表达载体：将毕赤酵母分泌表达载体pPICZA与上述步骤(1)中得到的pGH-C基因高保真PCR产物用Xho I与Xba I进行双酶切，用PCR纯化回收试剂盒和DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒分别对基因和质粒双酶切产物进行回收，将回收的基因与质粒用T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，构建得到pGH重组毕赤酵母分泌表达载体pPICZA-pGH-C，保存载体的菌株命名为DH5α-pPICZA-pGH-C。用质粒通用引物5’AOXI、3’AOX I通过菌落PCR筛选DH5α阳性转化子，结果如图2所示，将所有阳性克隆菌落送样测序，将测序结果完全一致的菌落保种。

(3)pGH-C毕赤酵母分泌表达菌株的构建与高拷贝菌株的筛选：将上述步骤(3)中构建的重组表达载体用Sac I单酶切线性化后，电击转化毕赤酵母野生型X33感受态细胞，涂布YPDSZ筛选平板，置于30℃培养箱中培养至长出单菌落，随机挑取约100个单菌落分别溶于10μL无菌水中，用无菌牙签沾取菌液分别一一对应接种于含0.5mg/mL和1.0mg/mLZeocin的两块YPDZ平板上，将平板置于30℃培养箱中培养，通过高浓度的Zeocin(博来霉素)YPDZ平板筛选具有目的基因高拷贝的毕赤酵母转化子。毕赤酵母转化子的高抗筛选结果如图3所示。

(4)pGH-C毕赤酵母分泌表达菌株的诱导发酵：将上述步骤(3)中得到的抗1.0mg/mL Zeocin的酵母表达菌株接种于BMGY液体培养基，于30℃、230rpm震荡培养至OD_595nm值＝5～6时，按照无菌操作要求，离心收集菌体沉淀，按4:1或5:1的比例(如40或50mL BMGY液体培养基培养物转入10mL BMMY液体培养基中)，将菌体沉淀转接于含1％甲醇的BMMY液体培养基，于28℃、230rpm诱导发酵48小时，每隔24小时向BMMY液体培养基补加甲醇至1％，48小时后离心收集诱导发酵上清液。诱导发酵上清液的SDS-PAGE电泳结果如图4所示；诱导发酵上清液的Western-blot结果如图5所示，Western-blot所用一抗为抗His标签鼠单克隆抗体，二抗为羊抗鼠IgG-HRP抗体。

(5)诱导发酵上清液中pGH-C的Ni亲和层析：按照氨酸亲和层析树脂填料Ni-NTAHis-Bind要求，对上述诱导发酵上清中的pGH-C进行纯化，Ni亲和层析结果如图6所示。pGH-C蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，未优化的pGH的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

(6)优化后的pGH蛋白的发酵产量对比，以未优化的SEQ ID NO:3序列通过质粒转入毕赤酵母并表达为对照，在5L发酵罐内发酵后，pGH和pGH-C的表达水平如表1所示。

表1 pGH和pGH-C在5L发酵罐中的发酵水平

实验组	表达量(mg/L)
		pGH	423
pGH-C	2051

由表1的结果可知，经优化的pGH(即pGH-C)的表达量远高于未优化的pGH。上述结果说明优化后的pGH基因(即pGH-C基因)序列有利于提高pGH在毕赤酵母中的表达量。

实施例2

天然未经过改造的pGH基因序列如SEQ ID NO:3所示，本发明利用基因序列优化软件COSstar为基础优化工具，结合优化软件eugene以及mRNA局部能量和密码子优化表，对pGH的编码序列进行综合分析改造，优化pGH基因，优化后的序列如SEQ ID NO:1所示。优化的pGH命名为pGH-C。

(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的pGH-C基因插入质粒pPICZA，转入与毕赤酵母GS115野生型感受态细胞，利用质粒上的抗性基因，通过高抗筛选得到具有目的基因高拷贝的毕赤酵母重组子，可以获得能高效分泌表达具有高活性pGH的毕赤酵母工程菌。pGH-C蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，未优化的pGH的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

(2)优化后的pGH蛋白的发酵产量对比，以未优化的SEQ ID NO:3序列通过质粒转入毕赤酵母并表达为对照，在5L发酵罐内发酵后，pGH和pGH-C的表达水平如表2所示。

表2 pGH和pGH-C在5L发酵罐中的发酵水平

由表2的结果可知，经优化的pGH(即pGH-C)的表达量远高于未优化的pGH。上述结果说明优化后的pGH基因(即pGH-C基因)序列有利于提高pGH在毕赤酵母中的表达量。

实施例3

天然未经过改造的pGH基因序列如SEQ ID NO:3所示，本发明利用基因序列优化软件COSstar为基础优化工具，结合优化软件eugene以及mRNA局部能量和密码子优化表，对pGH的编码序列进行综合分析改造，优化pGH基因，优化后的序列如SEQ ID NO：1所示。优化的pGH命名为pGH-C。

(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的pGH-C基因插入质粒pPICZA，转入与毕赤酵母KM71野生型感受态细胞，利用质粒上的抗性基因，通过高抗筛选得到具有目的基因高拷贝的毕赤酵母重组子，可以获得能高效分泌表达具有高活性pGH-C的毕赤酵母工程菌。pGH-C蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，未优化的pGH的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

(2)优化后的pGH蛋白的发酵产量对比，以未优化的SEQ ID NO:3序列通过质粒转入毕赤酵母并表达为对照，在5L发酵罐内发酵后，pGH和pGH-C的表达水平如表3所示。

表3 pGH和pGH-C在5L发酵罐中的发酵水平

实验组	表达量(mg/L)
		pGH	216
pGH-C	987

由表3的结果可知，经优化的pGH(即pGH-C)的表达量远高于未优化的pGH。上述结果说明优化后的pGH基因(即pGH-C基因)序列有利于提高pGH在毕赤酵母中的表达量。

实施例4重组猪生长激素生物活性检测

将已获得的纯化的pGH-C蛋白进行透析处理，用于刺激猪小肠上皮细胞，取24小时、36小时、48小时进行MTT法检测细胞增殖水平，结果如图7所示。

由图7结果显示，可溶pGH-C蛋白在3个浓度下25μg/L、75μg/L、125μg/L与对照组(未优化的125μg/L pGH)比较，对猪小肠上皮细胞均有促进增殖作用，并且具有统计学意义，各浓度组之间差异无统计学意义。在相同的时间，125μg/L处理组比25μg/L、75μg/L处理组有更好的促进细胞增殖的效果。在48h时，25μg/L处理组相对增殖率为167％，75μg/L处理组相对增殖率为220％，125μg/L处理组相对增殖率为249％。实验结果说明可溶pGH-C蛋白具有促进猪小肠上皮细胞增殖的作用，其效果显著高于对照组。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种优化的pGH基因、蛋白及在提高毕赤酵母分泌表达pGH产量和活性中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 563

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 1

ttcccagcca tgcccttgtc cagcctattt gccaatgccg tgctccgggc ccagcacctg 60

caccaactgg ctgccgacac ctacaaggag tttgagccgc gcctacatcc cggagggaca 120

gaggtactcc atccagaacg cccaggctgc cttctgcttc tcggagacca tcccagcccc 180

cacgggcaag gacgaggccc agcaagatcg gacgtggagc tgctgcgctt ctcgctgctg 240

ctcatccaga gttggttagg tccagttcct cagcagggtc ttcaccaaca gcctggtgtt 300

tggcacctca gaccgcgtct acgagaagct gaaggacctg gaggagggca tccaggccct 360

gatgcggagc tggaggatgg cagcccccgg gcaggacaga tcctcaagca aaggtacgac 420

aaatttgaca caaacttgcg cagtgatgac gcgctgctta agaactacgg gctgctctcc 480

tgcttcaaga aggacctgac aaggctgaga catacctgcg ggtcacgaag tgtcgccgct 540

tcgtggagag cagctctcgg ttc 581

<210> 2

<211> 187

<212> PRT

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 2

Phe Pro Ala Met Pro Leu Ser Ser Leu Phe Ala Asn Ala Val Leu Arg

1 5 10 15

Ala Gln His Leu His Gln Leu Ala Ala Asp Thr Tyr Lys Glu Phe Glu

20 25 30

Pro Arg Leu His Pro Gly Gly Thr Glu Val Leu His Pro Glu Arg Pro

35 40 45

Gly Cys Leu Leu Leu Leu Gly Asp His Pro Ser Pro His Gly Gln Gly

50 55 60

Arg Gly Pro Ala Arg Ser Asp Val Glu Leu Leu Arg Phe Ser Leu Leu

65 70 75 80

Leu Ile Gln Ser Trp Leu Gly Pro Val Pro Gln Gln Gly Leu His Gln

85 90 95

Gln Pro Gly Val Trp His Leu Arg Pro Arg Leu Arg Glu Ala Glu Gly

100 105 110

Pro Gly Gly Gly His Pro Gly Pro Asp Ala Glu Leu Glu Asp Gly Ser

115 120 125

Pro Arg Ala Gly Gln Ile Leu Lys Gln Arg Tyr Asp Lys Phe Asp Thr

130 135 140

Asn Leu Arg Ser Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Ser

145 150 155 160

Cys Phe Lys Lys Asp Leu Thr Arg Leu Arg His Thr Cys Gly Ser Arg

165 170 175

Ser Val Ala Ala Ser Trp Arg Ala Ala Leu Gly

180 185

<210> 3

<211> 567

<212> DNA

<213> 猪(pig)

<400> 3

tttccagcaa tgccattatc atcactgttc gctaacgcag ttcttagacc caacatcaac 60

accaattggc agcgatactt acaaggagtt cgaaagagct tacatcccag aaggtcaaag 120

atactccatc caaaacgctc aagctcaagc agctttctgc ttcagtgaaa ctattccacg 180

ctccaacagg taaagacgaa gctcaacaaa ggagtgacgt tgaattgctg agattcagtt 240

gttgttgatc cagagttgtc cagttcgaat tcttatcaag agttttcacc aactccttgg 300

ttttcggaac tagtgataga gtctacagaa gttgaaggac ttggaagaag gaatccaagc 360

tctgatgaga gaatagaaga cggatctcca agagcaggtc aaatcttgaa gcgaacctac 420

gacaagttcg atactaatct gagatcagac gcctttatta aagaactacc gattgttgtc 480

atgcttcaag aaggacttgc ataaggcaga gacttcattg agtcatgaag tgcacaagat 540

tcgtcgaatc caatccattg cgctttc 585

<210> 4

<211> 189

<212> PRT

<213> 猪(pig)

<400> 4

Phe Pro Ala Met Pro Leu Ser Ser Leu Phe Ala Asn Ala Val Leu Arg

1 5 10 15

Pro Asn Ile Asn Thr Asn Trp Gln Arg Tyr Leu Gln Gly Val Arg Lys

20 25 30

Ser Leu His Pro Arg Arg Ser Lys Ile Leu His Pro Lys Arg Ser Ser

35 40 45

Ser Ser Ser Phe Leu Leu Gln Leu Asn Tyr Ser Thr Leu Gln Gln Val

50 55 60

Lys Thr Lys Leu Asn Lys Gly Val Thr Leu Asn Cys Leu Asp Ser Val

65 70 75 80

Val Val Asp Pro Glu Leu Ser Ser Ser Asn Ser Tyr Gln Glu Phe Ser

85 90 95

Pro Thr Pro Trp Phe Ser Glu Leu Val Ile Glu Ser Thr Glu Val Glu

100 105 110

Gly Leu Gly Arg Arg Asn Pro Ser Ser Asp Glu Arg Ile Glu Asp Gly

115 120 125

Ser Pro Arg Ala Gly Gln Ile Leu Lys Arg Thr Tyr Asp Lys Phe Asp

130 135 140

Thr Asn Leu Arg Ser Asp Ala Phe Ile Lys Glu Leu Pro Ile Val Val

145 150 155 160

Met Leu Gln Glu Gly Leu Ala Val Gly Arg Asp Phe Ile Glu Ser Ser

165 170 175

Ser Ala Gln Asp Ser Ser Asn Pro Ile His Cys Ala Phe

180 185

Claims

1.一种优化的猪生长激素基因，其特征在于，所述优化的猪生长激素基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种优化的猪生长激素蛋白，其特征在于，所述优化的猪生长激素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求1所述优化的猪生长激素基因。

4.根据权利要求3所述表达载体，其特征在于，所述表达载体为优化的猪生长激素基因的毕赤酵母蛋白表达载体pPICZA-pGH-C，通过将毕赤酵母分泌表达载体pPICZA与pGH-C基因高保真PCR产物用XhoI与XbaI进行双酶切，用PCR纯化回收试剂盒和DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒分别对基因和质粒双酶切产物进行回收，将回收的基因与质粒用T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，构建得到。

5.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株是由权利要求4所述的表达载体优化的猪生长激素基因的毕赤酵母蛋白表达载体pPICZA-pGH-C经SacI单酶切线性化后，电击转化毕赤酵母野生型X33感受态细胞，再通过高浓度博来霉素抗性筛选得到的重组菌株；所述毕赤酵母蛋白表达载体pPICZA-pGH-C通过将毕赤酵母分泌表达载体pPICZA与pGH-C基因高保真PCR产物用XhoI与XbaI进行双酶切，用PCR纯化回收试剂盒和DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒分别对基因和质粒双酶切产物进行回收，将回收的基因与质粒用T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，构建得到。

6.权利要求1所述优化的猪生长激素基因、权利要求2所述优化的猪生长激素蛋白、权利要求3或4所述表达载体、权利要求5所述重组菌株在提高毕赤酵母分泌表达猪生长激素产量和活性中的应用。

7.一种提高毕赤酵母分泌表达猪生长激素产量和活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求5所述重组菌株接种于BMGY液体培养基，于30℃、230rpm条件下培养至OD595nm值达到5～6；离心收集菌体沉淀，按(4～5)：1的比例将菌体沉淀转接于含1％甲醇的BMMY液体培养基，于28℃、230rpm诱导发酵48小时，每隔24小时向BMMY液体培养基补加甲醇至1％，48小时后离心收集发酵上清液，即得高产量、高活性的猪生长激素蛋白。

8.权利要求2所述优化的猪生长激素蛋白在制备促进猪小肠上皮细胞增殖的制剂中的应用。