CN115960211B - 一种重组人源ⅵ型胶原蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种重组人源Ⅵ型胶原蛋白及其制备方法和应用，属于生物工程技术领域。本发明的重组人源Ⅵ型胶原蛋白，是从人Ⅵ型胶原蛋白氨基酸序列中优化筛选后选取的序列，并基于此提供了重组表达载体和重组工程菌以及该胶原蛋白的制备方法，本发明中已经证实该胶原蛋白不但能够实现人Ⅵ型胶原蛋白于毕赤酵母的高效分泌表达，而且还具有更为优异的细胞粘附活性，并且可工业化应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组人源Ⅵ型胶原蛋白及其制备方法和应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
胶原蛋白是动物机体中重要的细胞外基质组成成分，在细胞迁移、细胞代谢、细胞信号通路应答、血小板凝聚、细胞、组织、器官的正常生理功能的维护、调节及损伤修复等方面有重要作用。胶原蛋白作为重要的天然生物蛋白具有良好的生物相容性、生物活性和可降解性，可广泛应用于化工、医药、食品、化妆品等众多领域。
目前胶原蛋白的主要获取方式为利用酸、碱、酶解法处理动物组织获得的胶原提取物，动物组织中提取胶原蛋白的技术已较为成熟，但此方法在生产过程中提取的胶原肽性质不均、批间差异大、有病毒感染的安全隐患，且动物源胶原氨基酸序列与人源蛋白的序列差异较大，易导致免疫原性以及过敏反应。另外，胶原蛋白的获取是通过基因工程技术表达，目前主要利用包括大肠杆菌、毕赤酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞以及植物等系统进行表达生产，以上表达系统中，也存在一些不足，如大肠杆菌系统表达产物后续纯化难度大；哺乳动物细胞表达成本高、产量低；昆虫细胞表达系统同样成本较大高、成量低，并且翻译后与人细胞有较大差异；植物表达周期较长，不适合工厂化生产；毕赤酵母表达系统虽然拥有可高密度发酵生产、极低的培养成本、短周期、高表达等规模化工业生产的优点，但是也无法确定可以适用于所有类型的胶原蛋白表达。
目前，研究较多的重组人胶原蛋白多以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型为主，对Ⅵ型胶原蛋白的研究甚少，人Ⅵ型胶原是存在于所有细胞外基质（ECM）中的一类胶原，能够结合ECM的不同物质，从而将细胞桥接到周围的结缔组织，并组织骨骼肌，肌腱，骨骼和软骨的三维组织结构。通过与基底层中的Ⅳ型胶原和其它珍珠白蛋白结合，Ⅵ型胶原可以在肌肉细胞和ECM之间建立紧密的联系。Ⅵ型胶原作为细胞外基质的主要成分，能够在创面修复中促进纤维细胞的粘附，并能够增强软骨细胞的再生，在创面愈合中发挥重要的作用。
人Ⅵ型胶原天然状态下的高级结构为哑铃装，中间为不连续的三螺旋区，N端和C端为长度和数量不一的球状结构，人Ⅵ型胶原有6条不同的单链，大小范围130KD到300 KD以上。目前市面上未有关于重组的Ⅵ型胶原商品，也未有通过毕赤酵母表达系统获取该类胶原蛋白的报道，并且该类胶原重组表达有技术难度，天然序列在重组表达过程中会很容易被降解。
所以，本技术领域亟需一种具备良好稳定性、具有生物学活性并能够重组表达的Ⅵ型胶原蛋白。
发明内容
本发明的目的在于，克服现有技术中存在的一些技术问题，通过对人天然Ⅵ型胶原序列进行选取以及设计，利用毕赤酵母菌株构建表达系统，成功表达出具有生物学活性的Ⅵ型胶原。
为此，本发明提供一种重组人源Ⅵ型胶原蛋白、编码该胶原蛋白的多核苷酸、含有编码该胶原蛋白的多核苷酸的重组载体、工程菌、制备该胶原蛋白的方法、包含该胶原蛋白的组合物、该胶原蛋白的应用。本发明的Ⅵ型胶原蛋白，是从人Ⅵ型胶原蛋白的第257-590位氨基酸序列中优化筛选后选取的序列，并在此基础上，选取第183-307位氨基酸进一步重组后的序列。本发明中已经证实该胶原蛋白不但能够实现人Ⅵ型胶原胶原蛋白于毕赤酵母的高效分泌表达，而且还具有更为优异的细胞粘附活性，并且可工业化应用。
本发明提供了一种重组人源Ⅵ型胶原蛋白，所述胶原蛋白具有生物学活性。
所述重组人源Ⅵ型胶原蛋白，包括A所示的氨基酸序列或以A为基础单元串联重复得到的氨基酸序列，所述A为一下任一：
（1）包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
（2）在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列基础上进行一定程度上的氨基酸替换、插入、取代、添加、缺失等修改后的氨基酸序列；
（3）与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有大于80%同一性的氨基酸序列；
其中每个A相同或不同并且以A为基础单元串联重复，每个相同或不同的A之间直接通过肽键相连接。
进一步的，所述A为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
进一步的，所述基础单元重复次数为4次，所述重组人源Ⅵ型胶原蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供编码上述重组人源Ⅵ型胶原蛋白的多核苷酸，优选的，所述多核苷酸包括编码A的核苷酸序列或以编码A的核苷酸序列为基础单元串联重复得到的核苷酸序列，进一步的，所述多核苷酸包括SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列、或其简并序列。
本发明还提供了包含编码上述胶原蛋白的多核苷酸的重组表达载体。
本发明还提供由上述重组表达载体构建的工程菌，所述工程菌的宿主细胞优选为毕赤酵母。所述工程菌菌种保藏编号分别是：CGMCC No.26125、CGMCC No.26126。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2022年11月11日。分类命名：巴斯德毕赤酵母（Komagataella phaffii，也有写为Pichia pastoris）。
本发明还提供上述胶原蛋白的制备方法，包括如下步骤：
对本发明构建的工程菌分批补料培养，将工程菌接入含种子培养基YPG中，培养得到种子液；将种子液接种至发酵培养基；发酵过程中添加补料培养基和诱导培养基，进行培养以及诱导表达，获得重组胶原蛋白发酵上清液。
发酵培养基：包括NH4H2PO4 190.4g/L、KH2PO4 10.06g/L、CaSO4•2H2O 1.18g/L、K2SO4 18.2g/L、MgSO4•7H2O 14.9g/L、甘油40g/L；发酵培养基高温灭菌后待温度降至室温加入PTM1，用氨水调节pH至5.0。
补料培养基：50%W/V甘油，每升加12mL PTM1微量元素；
诱导培养基：100%甲醇，每升加入12mL PTM1微量元素。
还包括所得到胶原蛋白的纯化：
配制缓冲液A包括：20mM KH2PO4，pH4.0；
配制缓冲液B包括：20mM KH2PO4、1M NaCl，pH4.0。
以缓冲液A平衡阳离子交换介质至A215吸光值和电导率值都保持不变后，
上样，检测紫外A215吸光值，当其上升时，开始接样。待上样结束后，关闭接样，再以缓冲液A平衡阳离子层析介质，当A215吸光值下降时，打开接样，直至紫外和电导降至最低且不再变化，停止接样。收集洗脱液，分别检测确定好组份后，进行透析（透析液为超纯水），随后浓缩、冷冻干燥，收集冻干胶原蛋白海绵
本发明中，以SDS-PAGE电泳对表达的蛋白质进行初步鉴定，判断其有效分泌表达的能力，结果证明了本发明的重组人Ⅵ型胶原蛋白能够高效分泌表达。
根据本发明的一个实施例，对得到的胶原蛋白细胞黏附活性实验，实验验证其具有良好的细胞黏附活性。
本发明还提供一种组合物，所述组合物包含所述的重组人源胶原蛋白、或所述的多核苷酸、或所述的重组表达载体、或所述方法制备的重组人源Ⅵ型胶原蛋白、或所述的重组工程菌。
本发明还提供一种制品，所述制品包含所述的重组人源胶原蛋白、或所述的多核苷酸、或所述的重组表达载体、或所述的重组工程菌、或所述方法制备的重组人源Ⅵ型胶原蛋白、或所述的组合物；优选地，所述制品选自药物、医疗器械、生物材料、组织工程产品、化妆品或保健品。
本发明还提供所述胶原蛋白、多核苷酸、重组表达载体、重组工程菌、组合物或制品在制备药物、药物组合物、医疗器材、生物材料、组织工程产品、化妆品、保健品中的用途。
本发明还提供所述胶原蛋白、多核苷酸、重组表达载体、重组工程菌、组合物或制品在制备保湿产品、修复产品中的用途。
本发明的有益效果：
（1）本发明设计的重组人源Ⅵ型胶原蛋白6201能够在毕赤酵母表达系统下成功表达，并高效分泌；本发明选择的基础氨基酸单元序列，荷电性较强，细胞生物学活性集中，且避免潜在的降解位点，进行串联重复，保证了整个序列的稳定性，能在毕赤酵母中进行高效分泌表达，不会因为连接处氨基酸序列的问题引起序列不稳定。
本发明的重组人源Ⅵ型胶原蛋白在摇瓶阶段主条带占90%以上，发酵罐中主条带占80%以上；且纯化后主带占比依然很高，本发明的方法和设计的重组人源Ⅵ型胶原蛋白能有效缓解或抑制降解。
（2）本发明涉及的重组胶原蛋白经纯化后获得的样品具有较高的生物学活性，对细胞的粘附、增殖具显著的效果。本发明的胶原蛋白制备方法适于工业化大规模生产，并且制备出的产品没有动物来源的感染源，因此生物安全性更高。
（3）本发明选择的毕赤酵母是真核微生物，能够对表达产物进行一定的修饰（尤其是糖基化修饰），有力支撑蛋白质生物学功能的实现，目的蛋白可分泌至胞外，毕赤酵母自身分泌蛋白很少，简化了纯化工艺，细胞壁成分中不含内毒素、肽聚糖。毕赤酵母遗传背景清楚，本发明以其建立表达系统拥有可高密度发酵生产、极低的培养成本、短周期、高表达等规模化工业生产。本发明首次通过毕赤酵母表达系统表达成功重组人源Ⅵ型胶原蛋白。
附图说明
图1为重组胶原蛋白HC62S摇瓶表达上清（诱导24h）的SDS-PAGE（左图）以及WB检测（右图）结果。
图2为重组胶原蛋白6201摇瓶表达上清（诱导24h）的SDS-PAGE图。
图3为重组胶原蛋白6201在5L罐发酵上清的SDS-PAGE图。
图4为重组胶原蛋白6201层析过程样和冻干海绵的SDS-PAGE图。
图5为重组胶原蛋白6201冻干海绵照片。
图6为重组胶原蛋白6201、人胶原蛋白、牛血清白蛋白和对照PBS吸光度检测结果。
图7为重组胶原蛋白HC62S经酶解后Nano-HPLC-MS/MS质谱检测肽段与理论序列进行比对结果。
图8为重组胶原蛋白6201经酶解后Nano-HPLC-MS/MS质谱检测肽段与理论序列进行比对结果。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面对本发明的较佳实施例进行详细的阐述，但是如下实施例并不限制本发明的保护范围。
本发明的实施例中，没有多作说明的都是采用常规实验方法完成，实施例中所涉及过程没有多作说明的都是本领域技术人员根据产品说明书或本领域基础知识可以理解并且容易实现的，因此不再详细描述。
本发明中所涉及的各培养基或其他试剂材料等，如MD平板、YPD平板、BMGY培养基等，如无特殊说明均为常规配制或购买得到。
以本发明序列重复次数不同也能达到相同的效果、对本发明涉及的序列利用不同的质粒载体，以及不同的宿主菌、对本发明涉及的序列进行相应的延长或缩短也能达到类似的效果，均属于本发明的保护范围。
实施例1：
（1）氨基酸序列的设计
以Ⅵ型胶原α2链（序列在数据库登录连接：https://www.uniprot.org/uniprotkb/P12110/entry，序列号P12110）序列中截取第257-590位为单体，N端添加6×His标签，C端添加Strep-Tag II，命名记为HC62S，其序列如SEQ ID NO.1所示：
HHHHHHPSGPKGYRGQKGAKGNMGEPGEPGQKGRQGDPGIEGPIGFPGPKGVPGFKGEKGEFGADGRKGAPGLAGKNGTDGQKGKLGRIGPPGCKGDPGNRGPDGYPGEAGSPGERGDQGGKGDPGRPGRRGPPGEIGAKGSKGYQGNSGAPGSPGVKGAKGGPGPRGPKGEPGRRGDPGTKGSPGSDGPKGEKGDPGPEGPRGLAGEVGNKGAKGDRGLPGPRGPQGALGEPGKQGSRGDPGDAGPRGDSGQPGPKGDPGRPGFSYPGPRGAPGEKGEPGPRGPEGGRGDFGLKGEPGRKGEKGEPADPGPPGEPGPRGPRGVPGPEGEPGPPGDPGLTWSHPQFEK
以HC62S为母链，截取其第183-307位，如SEQ ID NO.2所示；并以HC62S第183-307位为基础单元串联重复4次，每个基础单元之间直接通过肽键相连接，其序列如SEQ IDNO.3所示；在SEQ ID NO.3的C端添加6×His标签，命名为6201，其序列如SEQ ID NO.4所示。
其中基础单元的重复次数不限于4次，优选为4次。
SEQ ID NO.2：
GSPGSDGPKGEKGDPGPEGPRGLAGEVGNKGAKGDRGLPGPRGPQGALGEPGKQGSRGDPGDAGPRGDSGQPGPKGDPGRPGFSYPGPRGAPGEKGEPGPRGPEGGRGDFGLKGEPGRKGEKGEP
SEQ ID NO.3：
GSPGSDGPKGEKGDPGPEGPRGLAGEVGNKGAKGDRGLPGPRGPQGALGEPGKQGSRGDPGDAGPRGDSGQPGPKGDPGRPGFSYPGPRGAPGEKGEPGPRGPEGGRGDFGLKGEPGRKGEKGEPGSPGSDGPKGEKGDPGPEGPRGLAGEVGNKGAKGDRGLPGPRGPQGALGEPGKQGSRGDPGDAGPRGDSGQPGPKGDPGRPGFSYPGPRGAPGEKGEPGPRGPEGGRGDFGLKGEPGRKGEKGEPGSPGSDGPKGEKGDPGPEGPRGLAGEVGNKGAKGDRGLPGPRGPQGALGEPGKQGSRGDPGDAGPRGDSGQPGPKGDPGRPGFSYPGPRGAPGEKGEPGPRGPEGGRGDFGLKGEPGRKGEKGEPGSPGSDGPKGEKGDPGPEGPRGLAGEVGNKGAKGDRGLPGPRGPQGALGEPGKQGSRGDPGDAGPRGDSGQPGPKGDPGRPGFSYPGPRGAPGEKGEPGPRGPEGGRGDFGLKGEPGRKGEKGEP
SEQ ID NO.4：
GSPGSDGPKGEKGDPGPEGPRGLAGEVGNKGAKGDRGLPGPRGPQGALGEPGKQGSRGDPGDAGPRGDSGQPGPKGDPGRPGFSYPGPRGAPGEKGEPGPRGPEGGRGDFGLKGEPGRKGEKGEPGSPGSDGPKGEKGDPGPEGPRGLAGEVGNKGAKGDRGLPGPRGPQGALGEPGKQGSRGDPGDAGPRGDSGQPGPKGDPGRPGFSYPGPRGAPGEKGEPGPRGPEGGRGDFGLKGEPGRKGEKGEPGSPGSDGPKGEKGDPGPEGPRGLAGEVGNKGAKGDRGLPGPRGPQGALGEPGKQGSRGDPGDAGPRGDSGQPGPKGDPGRPGFSYPGPRGAPGEKGEPGPRGPEGGRGDFGLKGEPGRKGEKGEPGSPGSDGPKGEKGDPGPEGPRGLAGEVGNKGAKGDRGLPGPRGPQGALGEPGKQGSRGDPGDAGPRGDSGQPGPKGDPGRPGFSYPGPRGAPGEKGEPGPRGPEGGRGDFGLKGEPGRKGEKGEPHHHHHH
（2）DNA序列的合成与重组表达载体的构建
委托南京金斯瑞生物科技股份有限公司合成：根据密码子优化方案合成表达HC62S、6201的DNA片段，将合成后的基因片段克隆至pPIC9K空载体（购自赛默飞世尔科技公司）中，使目的片段准确插入到含有分泌信号α-因子的分泌型载体读码框内，获得表达HC62S、6201的重组表达质粒。
HC62S（氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示）的DNA片段序列如SEQ ID NO.5所示：
catcatcatcatcatcatccatcaggaccaaaaggttacagaggacaaaagggagcaaaaggaaacatgggagagccaggagagcctggtcaaaagggtagacaaggagatccaggtattgaaggtcctattggttttccaggtcctaaaggtgttccaggttttaagggtgaaaaaggagagttcggtgctgatggtagaaagggtgctcctggtttggctggtaaaaacggtactgatggtcaaaagggtaaattgggtagaatcggtccacctggttgtaagggagatccaggtaatagaggtccagatggttaccctggtgaagctggttctcctggagagagaggagatcaaggtggtaaaggagatccaggtagacctggtagaagaggtccacctggtgaaattggtgctaagggttctaaaggttatcagggtaactctggtgctccaggttctcctggtgttaagggtgctaaaggtggtccaggtcctagaggtccaaagggagagcctggtagaagaggagatccaggtactaaaggttctccaggttctgatggtccaaaaggtgaaaaaggagatccaggtcctgagggtccaagaggtttggctggtgaagttggtaataagggtgctaaaggagatagaggtttgcctggacctagaggaccacaaggtgctttgggagagcctggtaaacaaggttctagaggagatccaggagatgctggtcctagaggagattctggtcagccaggtccaaagggagatccaggtagacctggtttttcttacccaggtcctagaggtgctccaggtgaaaagggagagccaggtcctagaggtcctgaaggtggtagaggagatttcggtttgaaaggagagccaggtagaaagggagagaaaggagagccagctgatcctggtccacctggtgaacctggaccaagaggtccaagaggtgttccaggtcctgagggtgagcctggtcctcctggtgaccctggtttgacttggtctcatccacagtttgaaaaa
HC62S的第183-307位（氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示）的DNA片段序列如SEQ IDNO.6所示：
ggttctccaggttctgatggtccaaaaggtgaaaaaggagatccaggtcctgagggtccaagaggtttggctggtgaagttggtaataagggtgctaaaggagatagaggtttgcctggacctagaggaccacaaggtgctttgggagagcctggtaaacaaggttctagaggagatccaggagatgctggtcctagaggagattctggtcagccaggtccaaagggagatccaggtagacctggtttttcttacccaggtcctagaggtgctccaggtgaaaagggagagccaggtcctagaggtcctgaaggtggtagaggagatttcggtttgaaaggagagccaggtagaaagggagagaaaggagagcca
SEQ ID NO.3所示氨基酸序列对应的DNA片段序列如SEQ ID NO.7所示：
ggttctccaggttctgatggtccaaaaggtgaaaaaggagatccaggtcctgagggtccaagaggtttggctggtgaagttggtaataagggtgctaaaggagatagaggtttgcctggacctagaggaccacaaggtgctttgggagagcctggtaaacaaggttctagaggagatccaggagatgctggtcctagaggagattctggtcagccaggtccaaagggagatccaggtagacctggtttttcttacccaggtcctagaggtgctccaggtgaaaagggagagccaggtcctagaggtcctgaaggtggtagaggagatttcggtttgaaaggagagccaggtagaaagggagagaaaggagagccaggttctccaggttctgatggtccaaaaggtgaaaaaggagatccaggtcctgagggtccaagaggtttggctggtgaagttggtaataagggtgctaaaggagatagaggtttgcctggacctagaggaccacaaggtgctttgggagagcctggtaaacaaggttctagaggagatccaggagatgctggtcctagaggagattctggtcagccaggtccaaagggagatccaggtagacctggtttttcttacccaggtcctagaggtgctccaggtgaaaagggagagccaggtcctagaggtcctgaaggtggtagaggagatttcggtttgaaaggagagccaggtagaaagggagagaaaggagagccaggttctccaggttctgatggtccaaaaggtgaaaaaggagatccaggtcctgagggtccaagaggtttggctggtgaagttggtaataagggtgctaaaggagatagaggtttgcctggacctagaggaccacaaggtgctttgggagagcctggtaaacaaggttctagaggagatccaggagatgctggtcctagaggagattctggtcagccaggtccaaagggagatccaggtagacctggtttttcttacccaggtcctagaggtgctccaggtgaaaagggagagccaggtcctagaggtcctgaaggtggtagaggagatttcggtttgaaaggagagccaggtagaaagggagagaaaggagagccaggttctccaggttctgatggtccaaaaggtgaaaaaggagatccaggtcctgagggtccaagaggtttggctggtgaagttggtaataagggtgctaaaggagatagaggtttgcctggacctagaggaccacaaggtgctttgggagagcctggtaaacaaggttctagaggagatccaggagatgctggtcctagaggagattctggtcagccaggtccaaagggagatccaggtagacctggtttttcttacccaggtcctagaggtgctccaggtgaaaagggagagccaggtcctagaggtcctgaaggtggtagaggagatttcggtttgaaaggagagccaggtagaaagggagagaaaggagagcca
6201（氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示）的DNA片段序列如SEQ ID NO.8所示：
ggttctccaggttctgatggtccaaaaggtgaaaaaggagatccaggtcctgagggtccaagaggtttggctggtgaagttggtaataagggtgctaaaggagatagaggtttgcctggacctagaggaccacaaggtgctttgggagagcctggtaaacaaggttctagaggagatccaggagatgctggtcctagaggagattctggtcagccaggtccaaagggagatccaggtagacctggtttttcttacccaggtcctagaggtgctccaggtgaaaagggagagccaggtcctagaggtcctgaaggtggtagaggagatttcggtttgaaaggagagccaggtagaaagggagagaaaggagagccaggttctccaggttctgatggtccaaaaggtgaaaaaggagatccaggtcctgagggtccaagaggtttggctggtgaagttggtaataagggtgctaaaggagatagaggtttgcctggacctagaggaccacaaggtgctttgggagagcctggtaaacaaggttctagaggagatccaggagatgctggtcctagaggagattctggtcagccaggtccaaagggagatccaggtagacctggtttttcttacccaggtcctagaggtgctccaggtgaaaagggagagccaggtcctagaggtcctgaaggtggtagaggagatttcggtttgaaaggagagccaggtagaaagggagagaaaggagagccaggttctccaggttctgatggtccaaaaggtgaaaaaggagatccaggtcctgagggtccaagaggtttggctggtgaagttggtaataagggtgctaaaggagatagaggtttgcctggacctagaggaccacaaggtgctttgggagagcctggtaaacaaggttctagaggagatccaggagatgctggtcctagaggagattctggtcagccaggtccaaagggagatccaggtagacctggtttttcttacccaggtcctagaggtgctccaggtgaaaagggagagccaggtcctagaggtcctgaaggtggtagaggagatttcggtttgaaaggagagccaggtagaaagggagagaaaggagagccaggttctccaggttctgatggtccaaaaggtgaaaaaggagatccaggtcctgagggtccaagaggtttggctggtgaagttggtaataagggtgctaaaggagatagaggtttgcctggacctagaggaccacaaggtgctttgggagagcctggtaaacaaggttctagaggagatccaggagatgctggtcctagaggagattctggtcagccaggtccaaagggagatccaggtagacctggtttttcttacccaggtcctagaggtgctccaggtgaaaagggagagccaggtcctagaggtcctgaaggtggtagaggagatttcggtttgaaaggagagccaggtagaaagggagagaaaggagagccacatcatcaccaccatcac
（3）重组工程菌株的构建、菌种筛选
将步骤（2）得到的重组表达质粒10μg分别用限制性内切酶SalⅠ（购自大连TaKaRa公司，具体操作按试剂盒说明书进行）37℃酶切消化过夜，使其线性化，再使用PCR产物纯化试剂盒（购自生工生物工程(上海)股份有限公司）回收线性化质粒，控制体积在10μL左右。
将线性化质粒分别电转化入宿主菌种毕赤酵母GS115（购自赛默飞世尔科技公司）感受态细胞，将电转后的菌液涂布于MD平板上，每100μL～200μL涂布一块平板，室温静置10min，于30℃倒置培养2-5天，直至单菌落（阳性转化子）出现。
向MD平板表面加入2mL无菌双蒸水，然后用无菌三角涂布器轻轻刮下平板表面的His+转化子，并转移到50mL离心管中。以无菌双蒸水稀释菌悬液，105个细胞涂布于含有0.5mg/mL G418的YPD平板上，倒置，30℃培养3～4d后至单菌落出现。从YPD平板上挑取菌落至无菌96孔板中（200μLYPD/孔），混匀，于30℃培养48h；混匀孔中菌液，各取10μL接入至一块新的无菌96孔板，于30℃培养24h后再重复一次此操作；24h后，从第三块96孔板中取出1μL分别点在含有1.0mg/mL和4mg/mL G418的YPD平板上，于30℃继续培养96h～120h。毕赤酵母转化子若能在含高浓度G418的平板上生长，说明该转化子含有多拷贝的目的基因，即有多个重组片段进入了毕赤酵母体内并通过同源重组整合到酵母的染色体上。经过这一步筛选可得到的高拷贝、可高效表达的重组酵母工程菌种。
构建的2种工程菌样本均送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏编号分别是：表达HC62S的工程菌保藏编号为CGMCC No.26125，表达6201的工程菌保藏编号为CGMCC No.26126。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2022年11月11日。分类命名：巴斯德毕赤酵母（Komagataella phaffii, 也有命名写为Pichia pastoris）。
（4）诱导表达与重组胶原蛋白的鉴定
分别取表达HC62S、6201的毕赤酵母工程菌种，置于装有10mL BMGY培养基的100mL三角瓶中，于28-30℃、220rpm培养至OD600为2~6(16-18h)。室温下1500~3000g离心5min，收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体，使OD600为2左右，放置于28-30℃、220rpm的摇床上继续生长3天，每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为1.0%。加甲醇诱导16h以上，就可收取菌液样品，取样量为1mL，置于1.5mL EP管中，4℃下以12000g离心5min，收集表达上清，待检测样品于-80℃保存备用。
收取的表达上清，加入5×上样缓冲液（250mMTris-HCl、pH6.8，10％SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β-巯基乙醇），置于100℃金属浴加热10min，进行SDS-PAGE检测以及Western Blot实验。结果如图1、图2所示，图1为重组胶原蛋白HC62S摇瓶表达上清（诱导24h）的SDS-PAGE（左图）以及WB检测（右图）结果，图中为3个不同单克隆菌株的平行表达样。图2为重组胶原蛋白6201摇瓶表达上清（诱导24h）的SDS-PAGE图，图中为不同单克隆菌株的平行表达样。各胶原均能高效分泌于培养基上清，且表达纯度高，并且，条带大小与预期相符。
将图1、图2中的预期条带切割下来，用胰蛋白酶将其酶解，Nano-HPLC-MS/MS质谱检测重组胶原的胰蛋白酶解后肽段（交由苏州普泰生物技术有限公司完成），并将检测到肽段与理论序列进行比对。对比结果如图7、图8所示，结果表明，HC62S、6201被酶解后检测到的肽段均属于HUMAN Collagen alpha-2(VI)的理论序列，说明本发明的重组人源Ⅵ型胶原成功表达。
实施例2：高密度发酵与纯化试验
（1）对基因工程菌进行高密度发酵试验，重组6201胶原蛋白规模化表达生产，获取含有重组胶原蛋白的发酵液。
种子培养基YPG：包括酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、甘油10g/L；
发酵培养基：包括NH4H2PO4 190.4g/L、KH2PO4 10.06g/L、CaSO4•2H2O 1.18g/L、K2SO4 18.2g/L、MgSO4•7H2O 14.9g/L、甘油40g/L；发酵培养基高温灭菌后待温度降至室温加入PTM1，用氨水调节pH至5.0。
补料培养基：50%W/V甘油，每升加12mL PTM1微量元素；
诱导培养基：100%甲醇，每升加入12mL PTM1微量元素；
其中PTM1：用0.22μm的滤膜过滤除菌，4℃保存。
工程菌株分批培养条件和诱导表达条件为：
采用分批补料培养方法，培养温度30℃。工程菌接入含200mL种子培养基YPG的1L摇瓶，220rpm、30℃，培养18-20h，至OD600=2~10，得到种子液。使用5L发酵罐（保兴生物），装液量为2L发酵培养基，2%甘油分开灭菌，接种前调节转速为300rpm，通气量为4L/min，温度为30℃，用浓氨水配制好的碱液调节pH值，设置pH为4.5，并维持培养过程不低于4.5（因为酵母菌在快速生长时会产酸，而过酸的环境会抑制菌的生长速度）。然后先接入0.9mLPTM1，再将制备好的200mL种子液接入罐内（火焰圈接种），然后点击溶氧电极校百，校百后开始发酵。
待生长溶氧第一次掉至30%，采用溶氧串级转速功能，保持生长溶氧30%；等待培养基中甘油耗完，溶氧反弹、溶氧大于70%（OD600值约20），取消溶氧串级转速，调高搅拌速度至650rpm，甘油采用30%联动补料，补料80mL。停止补甘油，溶氧反弹至70%以上后，设置pH值为4、温度29℃，以甲醇、甘油混合碳源（甲醇：50%甘油=7：3）进行诱导培养。手动补加5mL（这里补的是补料培养基和诱导培养基以体积比3:7的比例，总量为5mL），待溶氧反弹至70%以上后，设定补料速度为8mL/h，一小时后提高到10mL/h，一小时后再次提高到20mL/h。待溶氧值低于30%，停止补料，等待溶氧反弹，溶氧回升至30%后联动补料（这里补的是诱导培养基）。诱导40~60h，UV测量蛋白浓度增长幅度不明显或下降即可放罐。
UV蛋白定量公式：C(mg/mL)＝0.144*(A215-A225)，A215<1.5，A215和A225分别为蛋白在215nm和225nm处测得的吸光度值。
收集发酵上清进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图3所示，图3中，M(Marker)的左边3个泳道为发酵24h后的上清样，右边3个泳道为发酵48h后的上清样。在高密度发酵条件下，6201主条带位置清晰，且灰度分析主条带占比超过85%。同时可以证明本发明提供的6201能够进行从摇瓶阶段放大到发酵罐，并且能够高效分泌表达，纯度也很高。
以SDS-PAGE电泳对表达的蛋白质进行初步鉴定，HC62S序列能够在毕赤酵母表达系统下成功表达并且分泌，但其降解严重，无法进行大规模生产；重组的6201以SDS-PAGE电泳鉴定显示，同样能够在毕赤酵母表达系统下成功表达并且分泌，其降解相比HC62S大大降低，主带清晰，目的条带占90%以上，大小符合胶原蛋白的表观迁移特征。
（2）纯化
各缓冲液采用去离子水配制：
缓冲液A包括：20mM KH2PO4，pH4.0；
缓冲液B包括：20mM KH2PO4、1M NaCl，pH4.0。
收集得到的发酵液，2000g、30min、4℃离心分离菌体和发酵上清。以缓冲
液A平衡阳离子交换介质（层析填料为苏州纳微产UniGel-80sp，装载于利穗科技产XK50/30层析柱，使用GEAKTAPure蛋白质分离层析纯化系统）至A215吸光值和电导率值都保持不变后，设置20ml/min的流速上样，上样体积0.5L/次，检测紫外A215吸光值，当其上升时，开始接样。待上样结束后，关闭接样，再以缓冲液A平衡阳离子层析介质，当A215吸光值下降时，打开接样，直至紫外和电导降至最低且不再变化，停止接样。设置20mL/min的流速以缓冲液B进行洗脱，当A215上升时分段收集洗脱液，分别检测确定好组份后，进行透析（透析液为超纯水），随后浓缩、冷冻干燥，收集冻干胶原蛋白海绵。取纯化后冻干海绵溶于超纯水，以及层析过程样进行SDS-PAGE电泳，结果如图4所示，得到的冻干海绵如图5所示。图4为重组胶原蛋白6201层析过程样和冻干海绵的SDS-PAGE图，图中，从左至右，第2和第3个泳道均为层析过程中的取样，第4和第5个泳道均为重组胶原蛋白6201冻干海绵的取样。图中可以看到，本发明6201发酵上清液在层析中的过程样，和超滤、冻干后海绵在SDS-PAGE胶图中为单一清晰条带，并且胶图上条带位置符合理论值大小；结果证明了本发明6201六型胶原表达工程菌株在经发酵后获得含六型胶原的发酵上清液，发酵上清再经层析、超滤、冻干一系列纯化步骤后就能获得高纯度的重组胶原蛋白6201，并且该六型胶原在经过超滤冻干后仍为单一条带，其稳定性良好。
实施例3：重组胶原蛋白细胞黏附活性实验
正常培养NIH/3T3细胞（购自中国科学院细胞库，货号GNM6，培养、传代方法参照细胞说明书执行）。取重组6201胶原蛋白冻干海绵、对照人胶原蛋白(Sigma，货号C7774)及牛血清白蛋白（BSA，购自生工生物（上海）股份有限公司）溶解（超纯水或1M HCl溶液），以UV蛋白定量经验公式：C(mg/mL)＝0.144*(A215-A225)测定蛋白浓度，再以PBS（pH7.4）稀释至0.5mg/mL。
向96孔细胞培养板中加入100μL各种蛋白溶液和空白PBS溶液对照，设置每组3个平行。室温静置60min；再向每孔中加入105个培养状态良好的NIH/3T3细胞，37℃、5%CO2孵育60min。以PBS清洗4次孔中细胞。使用LDH检测试剂盒(Roche，04744926001)检测570nm的吸光度值（具体操作参照说明书执行）。检测结果见图6。图6中吸光度表征胶原蛋白样品的细胞粘附活性，吸光度越高，说明蛋白粘附的细胞越多，黏附活性越高，胶原蛋白越能在短时间内帮助细胞贴壁或粘附于细胞外基质之上，更利于构建合适的细胞外环境，图6可以看到，本发明的胶原蛋白细胞黏附活性更高。
实施例4：重组胶原蛋白保湿剂的制备
规格：500mL：0.5g，浓度0.1%
重组胶原蛋白保湿剂配方：
重组胶原蛋白： 1（g）
甘油： 100（mL）
透明质酸钠（140W）： 2.5（g）
透明质酸钠（230W）： 2.0（g）
乙酰化透明质酸钠 ： 0.1（g）
甘草酸二钾 ： 1（g）
纯化水： 900（mL）
注射用水： 1000mL（分装2瓶）
制备过程：
量取处方量体积注射用水于配液罐中，称取处方量甘油、透明质酸钠（140W）、透明质酸钠（230W）、乙酰化透明质酸钠、甘草酸二钾加至水中，搅拌15分钟使完全溶解后，加入处方量胶原蛋白，搅拌15分钟使其完全溶解。溶液过0.45μm滤膜，滤液过0.22μm滤膜。将滤液分装（500mL/瓶）、熔封。
实施例5：重组胶原蛋白修复精华的制备
规格：50mL：0.5g，浓度1%
重组胶原蛋白修复精华配方：
重组胶原蛋白： 10（g）
甘油： 50（mL）
卡波姆940： 2.0（g）
羟苯甲酯： 2.0（g）
三乙醇胺 ： 2.0（g）
凝血酸 ： 1.0（g）
甘草酸二钾： 1.0（g）
纯化水： 950（mL）
注射用水： 1000mL（分装20瓶）
制备过程：
量取处方量体积注射用水于配液罐中，称取处方量甘油、卡波姆940、羟苯甲酯、三乙醇胺、凝血酸、甘草酸二钾加至水中，搅拌15分钟使完全溶解后，加入处方量胶原蛋白，搅拌15分钟使其完全溶解。溶液过0.45μm滤膜，滤液过0.22μm滤膜。将滤液分装（50mL/瓶）、熔封。
本发明所提供的胶原蛋白，根据上述实施例中验证的本发明的胶原蛋白具有的理化性质和其含有的活性位点，以及其所具有生物学活性、细胞黏附活性，证明了本发明的胶原蛋白具有胶原蛋白基础的功效保湿和修复，并且能有更好的保湿或修复的效果。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
Claims (12)
1.重组人源Ⅵ型胶原蛋白，其特征在于，所述重组人源Ⅵ型胶原蛋白以A为基础单元串联重复得到的氨基酸序列，
每个A之间直接通过肽键相连接，所述A为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，所述基础单元重复次数为4次。
2. 根据权利要求1所述的重组人源Ⅵ型胶原蛋白，其特征在于，所述重组人源Ⅵ型胶原蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述重组人源Ⅵ型胶原蛋白。
4. 根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包括SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列、或其简并序列。
5.重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求3或4所述的多核苷酸。
6.工程菌或细胞，其特征在于，所述工程菌或细胞包含权利要求3或4所述的多核苷酸，或权利要求5所述的重组表达载体。
7.根据权利要求6所述的工程菌或细胞，其特征在于，所述工程菌或细胞的宿主细胞为毕赤酵母。
8. 根据权利要求6所述的工程菌或细胞，所述工程菌或细胞的菌种保藏编号是：CGMCCNo.26126。
9.权利要求1所述重组人源Ⅵ型胶原蛋白的制备方法，包括如下步骤：
将权利要求8所述的工程菌接入含种子培养基YPG中，培养得到种子液；将种子液接种至发酵培养基，调节pH值；发酵过程中添加甘油补料，以甲醇、甘油混合碳源进行诱导培养，获得重组胶原蛋白。
10.制品，所述制品包含所述的权利要求1所述的重组人源Ⅵ型胶原蛋白、或权利要求9所述方法制备的重组人源Ⅵ型胶原蛋白；所述制品选自药物、医疗器械、生物材料、组织工程产品、化妆品或保健品。
11.权利要求1所述的重组人源Ⅵ型胶原蛋白、或权利要求9所述方法制备的重组人源Ⅵ型胶原蛋白在制备药物、药物组合物、医疗器材、生物材料、组织工程产品、化妆品、保健品中的用途。
12.权利要求1所述的重组人源Ⅵ型胶原蛋白、或权利要求9所述方法制备的重组人源Ⅵ型胶原蛋白在制备保湿产品、修复产品中的用途。
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