CN116509764A - 一种含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液 - Google Patents
一种含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液 Download PDFInfo
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Abstract
一种含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液，包括三部分：（I）酵母发酵产物滤液；（II）酵母溶胞产物；（Ⅲ）重组17型人胶原蛋白。本发明的酵母发酵产物滤液作为化妆品原料，具有保湿、修复、滋养肌肤等效果；本发明提供的制备方法，省略了重组胶原蛋白17的纯化工艺，同时避免了由于纯化造成的蛋白损失、部分蛋白活性减弱等问题；本发明得到的含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液，较复配的17型人胶原蛋白或者传统制备的酵母发酵产物滤液，具有更好的保湿及促细胞生长的性质。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种含有重组17型人胶原蛋白酵母发酵产物滤液。
背景技术
胶原蛋白是生物高分子，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，某些生物体内含量甚至在80%以上。胶原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，因此在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用。
胶原蛋白在护肤产品中，一直具有广泛的应用。胶原蛋白分多种类型，常见的I型、III型、IV型胶原蛋白，胶原分子量都在40kD以上，需要通过水解等方式得到较小的水解胶原，进而渗入皮肤发挥功效。胶原蛋白不仅具有纯天然的保湿、美白、防皱、祛斑等作用，而且胶原蛋白与人体皮肤胶原的结构相似，分子中富含大量氨基酸和亲水基，具有一定的表面活性和很好的生物相容性；同时，其分子中含有大量的羟基，因此它也有着相当好的保湿作用。
目前市售的胶原蛋白产品，大多提取于猪、牛、鱼等动物组织中，虽然这些动物体胶原与人源的胶原蛋白较为相似，但仍存在异源蛋白致敏的风险。尤其对敏感性肌肤，如痤疮、爆痘、过敏等，可能会加剧肌肤问题。相对而言，人源的胶原蛋白，在安全性上更具优势。但是由于人胶原蛋白的分子量过大，不适合直接应用于化妆品产品中，在使用时往往都需要通过水解、酶解等方式，因而一些胶原蛋白不能发挥其全部生物学活性。
人胶原蛋白17（hC17）型属于非纤维类胶原蛋白，是由三个胶原链结构形成的一个同源三聚体，单链分子量达180kDa。人胶原蛋白17型中包含多段重复的螺旋结构序列，可以起到良好的支撑作用，同时具有耐高温、稳定性强等特点。目前，对此类人胶原蛋白的研究及应用并不广泛，尤其是在化妆品领域，应用较少。
利用酵母底盘直接生产含有重组人胶原蛋白17的化妆品原料，具有工艺简单、周期短、产品生物活性高等特点。同时，酵母发酵产物中包含多种天然代谢产物、细胞质成分、细胞壁组分和多糖复合物，经过发酵技术的洗礼，大分子营养物质被分解成小分子，更利于渗透肌肤屏障，深入到肌底滋养皮肤细胞。此外，直接由酵母底盘表达的重组人胶原蛋白17肽，是具有天然生物活性的益肤分子，进一步为皮肤细胞供能，有效维持肌肤活力。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液及其制备方法，以解决如何将17型人胶原蛋白应用于化妆品领域的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明的一种含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液的具体技术方案如下：
一种含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液，包括如下三部分：（I）酵母发酵产物滤液；（II）酵母溶胞产物；（Ⅲ）重组17型人胶原蛋白。
进一步，所述重组17型人胶原蛋白（Ⅲ）的含量为0.01%-0.1%。
进一步，所述的（I）为酿酒酵母菌株发酵产物滤液，其酿酒酵母菌株保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC1002；或经优化的其他酵母菌株，更进一步的是酿酒酵母菌株。
所述的重组17型人胶原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示；
所述SEQ ID No：1氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸；或与上述氨基酸序列至少有80%同源性的，且功能相同或相似的氨基酸序列。
本发明的第二目的在于提供一种含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液的制备方法，包括如下步骤：
步骤A、在质粒YCplac22上插入如SEQ ID No：2所示的核苷酸序列，获得重组17型人胶原蛋白目的片段和表达载体；
步骤B、提取步骤A中的构建质粒的DNA，并线性化，然后与酿酒酵母混合，转化完成后将其涂布于色氨酸缺陷型筛选培养基平板上，筛选阳性克隆，即获得含有重组17型人胶原蛋白基因的酿酒酵母底盘；
步骤C、将步骤B中得到的表达重组17型人胶原蛋白的酿酒酵母菌株，接种至YPDA培养基，并于200rpm、28℃摇床内发酵约60h，通过离心、浓缩等工艺富集发酵产物，并对其进行高压均质破碎，破碎后得到含有多种酵母菌小分子代谢物的酵母溶胞产物（II）；
步骤D、对步骤C中离心收集的发酵滤液，进行过滤除杂等工艺，得到含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液（I），将酵母溶胞产物（II）与酵母发酵滤液（I）按照一定比例进行混合，得到一种含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液。
进一步，所述酵母溶胞产物（II）与酵母发酵产物滤液（I）按照体积配比为1:10~1:1进行混合；
进一步，所述高压均质破碎采用梯度压力法进行，可以更好地保护代谢产物的天然活性，破碎压力依次为400pa、800pa、1200pa。
本发明的一种含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液的制备方法具有以下优点：
1、本发明提供的一种含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液，作为化妆品原料，具有保湿、修复、滋养肌肤等效果；
2、本发明提供的制备方法，省略了重组胶原蛋白17的纯化工艺，同时避免了由于纯化造成的蛋白损失、部分蛋白活性减弱等问题；
3、本发明得到的含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液，较复配的17型人胶原蛋白或者传统制备的酵母发酵产物滤液，具有更好的保湿及促细胞生长的性质。
附图说明
图1为大肠杆菌底盘构建的思路设计示意图；
图2为构建pET28a-SUMO-hC17的质粒图谱；
图3为酵母菌底盘构建的思路设计示意图；
图4为构建YCplac22-hC17的质粒图谱；
图5为不同样品作用下的表皮葡萄球菌生长曲线。
具体实施方式
下面将结合实施方式对本发明的实施方案进行详细描述。但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所述试剂或仪器未注明生产商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在本发明中，所述人胶原蛋白17型的序列是NCBI参照序列，编码为Q9UMD9.3。
重组17型人胶原蛋白hC17的氨基酸序列为SEQ ID No1：GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEA ，其核苷酸序列为SEQ ID No2：GGTAGCCCAGGTCCAAAAGGTGATATGGGAAGCCCAGGTCCGAAAGGTGATCGTGGTTTTCCGGGTACACCAGGTATTCCGGGTCCACTGGGTCATCCAGGTCCGCAAGGTCCGAAAGGCCAGAAAGGTAGCGTGGGTGATCCGGGTATGGAAGGGCCTATGGGGCAGCGTGGGCGTGAAGGGCCGATGGGTCCGCGTGGTGAAGCA。
在本文中，多肽包括以SEQ ID No.1中氨基酸序列中取代、添加、缺失或者插入了1个或多个，或与上述氨基酸序列至少有80%同源性的，且功能相同或相似的氨基酸序列。
本发明中，重组人胶原蛋白可以通过本领域中常规的方法进行。可以按照如下步骤生产：（1）基因表达载体的构建；（2）酿酒酵母基因工程菌的构建；（3）重组人胶原蛋白的诱导和表达。
实施例1基因表达载体的构建及表达
本发明实施例1为获得重组17型人胶原蛋白目的片段和表达载体，图1是实施例提供的思路设计示意图。图2是所构建表达载体的质粒图谱，所构建质粒命名为pET28a-SUMO-hC17。
具体实施步骤如下：
使用商用载体pET28a-SUMO，根据相关序列位置设计酶切位点，并插入重组17型人胶原蛋白hC17的基因序列。通过PCR法扩增重组17型人胶原蛋白hC17，引物为F1：5`-gccgcgcggcagccatGAACAGATTGGTGGAATGG-3`和R1：5`-ccagtcatgctagccaTCAGTGGTGGTGGTGGTG-3`，使用普通DNA产物纯化试剂盒对目的片段进行纯化；
构建的载体质粒为商用载体pET28a-SUMO，是一个含有SUMO促溶标签的大肠杆菌常用表达载体，使用MscI酶对pET28a-SUMO进行单酶切，酶切方法如产品说明书所述，酶切完成后使用普通DNA产物纯化试剂盒对线性载体进行纯化；
上述纯化后的片段和线性载体，使用无缝克隆的方法进行连接，方法参照GibsonMethod试剂盒说明书；
连接后的质粒，转化至DH5α感受态细胞，孵育后涂布含有Kan抗性的LB培养皿中，筛选连接正确的阳性克隆，并提取质粒；
对质粒进行外送测序并比对序列信息，比对无误的质粒即为本实施例所构建的表达载体，命名为pET28a-SUMO-hC17。
实施例2 获得底盘细胞
本发明实施例2为获得含有重组17型人胶原蛋白hC17基因的大肠杆菌底盘。大肠底盘使用商业化的酿酒酵母菌株BL21(DE3)pLysS，具体实施步骤如下：
将大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌株，划线至LB培养基的无菌培养平皿中，于37℃恒温培养箱内倒置培养60h以上，得到活化的菌落；
从平板上挑取新鲜菌落，转接至7ml的LB试管中，于37℃、200rpm摇床内培养约4h，得到活化的高密度大肠杆菌菌株，并离心富悬液约5ml，富集菌株；
使用大肠转化试剂盒，将质粒pET28a-SUMO-hC17转化至上述大肠杆菌中，具体操作步骤参照试剂盒说明；
将转化后的菌株，涂布抗性筛选培养基，于37℃恒温培养箱内倒置培养过夜，直至平板上长出较大菌落；
挑取上述平板上的阳性转化子，转接至LB抗性试管中，于28℃、200rpm摇床内培养约24h，使用紫外分光光度计检测OD600数值为6以上；
取上述发酵液，添加终浓度为25%的甘油，保藏于-80℃冰箱内备用，即得到含有重组17型人胶原蛋白hC17的大肠杆菌底盘细胞，并命名为BL21(DE3)pLysS-hC17。
实施例3 纯化蛋白
本发明实施例3为获得重组17型人胶原蛋白hC17。具体实施步骤如下：
将BL21(DE3)pLysS-hC17接种至100ml的LB摇瓶培养基内，于37℃、200rpm摇床培养过夜培养约16 h，得到发酵种子液；
取上述新鲜种子液，转接至含2L YPD液体培养基的5L摇瓶内，于37℃、200rpm摇床培养至OD600约为0.8，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导，于37℃、200rpm摇床继续培养4h，得到含有大量重组17型人胶原蛋白hC17表达的发酵产物；
上述发酵产物经过离心等工艺，富集发酵菌株，菌株重悬后经均质破碎，收集上清液，得到含有hC17蛋白的组分；
使用AKTA蛋白纯化仪，利用Ni柱纯化hC17蛋白，并使用SDS-PAGE电泳验证蛋白大小。
实施例4 制备酵母发酵滤液
本发明实施例4为获得含有重组17型人胶原蛋白hC17的酵母发酵产物滤液。图3是实施例提供的思路设计示意图。图4是所构建表达载体的质粒图谱。具体实施步骤如下：
获得重组17型人胶原蛋白hC17目的片段和表达载体：通过PCR法扩增hC17目的片段，并无缝连接至商用载体YCplac22上，转化至DH5α感受态细胞，Amp抗性筛选阳性克隆，测序无误后提取质粒，得到构建好的重组17型人胶原蛋白hC17表达载体，并命名为YCplac22-hC17；
获得含有重组17型人胶原蛋白hC17基因的酿酒酵母底盘：使用酵母转化试剂盒，将线性化的质粒YCplac22-hC17转化至酿酒酵母W303中，涂布色氨酸缺陷型筛选培养基，于28℃恒温培养箱内倒置培养约48h，筛选阳性转化子，即得到含有重组17型人胶原蛋白的酿酒酵母底盘细胞，并命名为W303-hC17；
获得含有重组17型人胶原蛋白hC17的酵母发酵产物滤液：将W303-hC17菌种活化后，接种至含2L YPDA液体培养基的5L摇瓶内，于28℃、200rpm摇床培养约60h，并通过离心、浓缩等工艺富集发酵产物，并对其进行高压均质破碎，均质破碎采用梯度压力法进行，可以更好地保护代谢产物的天然活性，破碎压力依次为400pa、800pa、1200pa，破碎后得到含有多种酵母菌小分子代谢物的酵母溶胞产物；
（4）对(3)中离心收集的发酵滤液，进行过滤除杂等工艺，得到含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵滤液，将酵母溶胞产物与酵母发酵滤液按照1:10进行混合，得到一种含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液。
实施例5 活性测试
本发明实施例5为测试重组17型人胶原蛋白hC17及其复配酵母发酵产物的活性。具体实施步骤如下：
接种表皮葡萄球菌至营养肉汤培养基试管，37℃摇床过夜培养，活化菌种；
上述菌液1%转接至100mL摇瓶培养基内，37℃摇床培养3小时，并取样测定其生长曲线，共进行5组实验；
分别向上述摇瓶内，加入10ml样品，样品分别为(a)生理盐水，(b)生理盐水重悬的hC17蛋白，(c)酵母发酵产物滤液，(d)酵母发酵产物滤液重悬的hC17蛋白，(e)酵母发酵hC17蛋白产物滤液，其中，无菌水及酵母发酵产物滤液重悬hC17蛋白的蛋白终浓度约为1.5mg/mL。
37℃摇床继续培养约21h，同时每3h取样监测其生长曲线，汇总上述5组实验的数据，结果见图5。
实施例6 效果测试
本发明实施例5为测试含有重组17型人胶原蛋白hC17及其复配酵母发酵产物的性质。测试的几种样品及相关指标如表1所示。
总蛋白含量测试采用BCA法，干物质含量测试采用比色皿法，保湿度测试使用VISIA皮肤检测仪进行测试，促细胞生长实验方法参见实施例5。
实验结果表明，含有hC17蛋白的组分，其具有更好的促进细胞增长的功效；含有酵母发酵产物滤液组分，其具有更好的保湿性；同时，酵母发酵hC17蛋白产物滤液，相比于复配的酵母发酵产物滤液及hC17蛋白，具有更好的保湿及促细胞生长的性质。
表1 重组17型人胶原蛋白hC17及其酵母发酵产物的参数对比
可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。
Claims (8)
1.一种含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液，其特征在于，所述发酵产物滤液包括三部分：（I）酵母发酵产物滤液；（II）酵母溶胞产物；（Ⅲ）重组17型人胶原蛋白 。
2.根据权利要求1所述的含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液，其特征在于，所述重组17型人胶原蛋白（Ⅲ）的含量为0.01%-0.1%。
3.根据权利要求1所述的含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液，其特征在于，所述酵母菌株为酿酒酵母菌株。
4.根据权利要求3所述的含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液，其特征在于，所述酿酒酵母菌株保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC1002。
5.根据权利要求1所述的含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液，其特征在于，所述重组17型人胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。
6.根据权利要求1所述的含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液的制备方法，包括如下步骤：
步骤A、在质粒YCplac22上插入如SEQ ID No：2所示的核苷酸序列，获得重组17型人胶原蛋白目的片段和表达载体；
步骤B、提取步骤A中的构建质粒的DNA，并线性化，然后与酿酒酵母混合，转化完成后将其涂布于色氨酸缺陷型筛选培养基平板上，筛选阳性克隆，即获得含有重组17型人胶原蛋白基因的酿酒酵母底盘；
步骤C、将步骤B中得到的表达重组17型人胶原蛋白的酿酒酵母菌株，接种至YPDA培养基，并于200rpm、28℃摇床内发酵约60h，通过离心、浓缩等工艺富集发酵产物，并对其进行高压均质破碎，破碎后得到含有多种酵母菌小分子代谢物的酵母溶胞产物（II）；
步骤D、对步骤C中离心收集的发酵滤液，进行过滤除杂等工艺，得到含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液（I），将酵母溶胞产物（II）与酵母发酵滤液（I）按照一定比例进行混合，得到一种含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液。
7.根据权利要求6所述的含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液的制备方法，其特征在于，所述酵母溶胞产物（II）与酵母发酵产物滤液（I）按照体积配比为1:10~1:1进行混合。
8.根据权利要求6所述的含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液的制备方法，其特征在于，所述高压均质破碎采用梯度压力法进行，可以更好地保护代谢产物的天然活性，破碎压力依次为400pa、800pa、1200pa。
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