CN111011575B - 一种水母促生长肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种水母促生长肽及其制备方法。所述水母促生长肽的制备方法包括：发酵步骤：在含有水母触手颗粒的浆液中接种混合菌种进行发酵培养，得到发酵液；分离步骤：对所述发酵液进行分离处理，获取含所述水母促生长肽的分离产物；其中，所述混合菌种包括嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、假交替单胞菌、产阮假丝酵母菌、酿酒酵母菌、纳豆芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌中的两种或两种以上的组合。本发明的水母促生长肽的分子量更合适，安全性高，且稳定性优异，透皮吸收率高。进一步地，本发明的水母促生长肽对皮肤中的细胞的生长或增殖具有良好的促进作用，能够提高皮肤中的细胞再生能力，增加皮肤弹性。

Description

一种水母促生长肽及其制备方法
技术领域
本发明属于海洋生物技术领域或化妆品领域，具体涉及一种水母促生长肽的制备方法，以及所述制备方法制备得到的水母促生长肽及其应用。
背景技术
水母是一种海洋生物，属于刺胞动物门。近年来，随着人类活动导致的环境变化及气候变化，水母爆发的频率和规模逐渐增加，已经成为干扰海洋生态系统的威胁。在长期研究中发现，水母的性腺十分发达，具有极强的繁殖增生能力，其高水分和低碳的身体特征使其具有比其他海洋生物更快的生长发育速度。水母在捕食或防御天敌的过程中，水母触手会出现断裂、脱落的状况，但受损部位很快会长出新的触手。水母表现出的超强创伤修复能力提示我们水母触手上可能含有某些高生物活性的促生长物质。
目前对于水母分解成小分子片段的方法主要是水解或酶解。水解是利用酸或碱切断大分子结构中的某些分子链，水解反应强度较高，会形成分子量极小的片段；酶解是利用特定的酶作为催化剂来催化分解大分子结构，反应作用单一，特定的酶对特定的物质分解效果好，特定的酶只能作用于某些特定的肽键，所以形成的产物单一。
引用文献1公开了一种海月水母水及其制备方法和应用，并具体公开了按照如下步骤制备：(1)取新鲜或冷冻的海月水母，用去离子水洗净，投入反应釜；(2)保持反应釜内的温度在1-10℃，开启搅拌桨搅碎海月水母，直至反应釜中无肉眼可见的果冻状颗粒，均质，得到海月水母浆；(3)将海月水母浆导入酶反应釜中，加入蛋白酶，30-60℃下反应2-24h，然后加热到90-100℃，保持1-20min，灭活；(4)酶解液冷却到室温，过滤，收集滤液，向滤液中加入稳定剂，搅拌10-30min，即得海月水母水，密封，于阴凉干燥处保存。该引用文献1最终得到的海月水母水中的产物较单一，影响其作用效果。
引用文献2公开了一种高效美白补水面膜液、面膜及其制备方法，并具体公开了所述高效美白补水面膜液，包括以下组分：去离子水100份、保湿剂6～13份、皮肤调理剂3～9份；以重量份计，所述的皮肤调理剂，至少包括以下组分：尿囊素3～7份、神经酰胺1～5份、β-葡聚糖35～44份、欧龙胆根和葡萄籽提取物36～42份、海月水母和大米提取物16～23份。其中，所述的海月水母和大米提取物是先将海月水母和大米用淀粉酶或蛋白酶进行酶解，并加入发酵菌种进行发酵所制得的物质；所述发酵菌种为曲米霉菌株(Aspergillusoryzae)。同样地，该引用文献2需要使用淀粉酶或蛋白酶进行酶解后，其产物较为单一，即使再经发酵菌种进行发酵，也无法获得性能优异的水母提取物。
引用文献：
引用文献1：CN 109770275 A
引用文献2：CN 108143702 A
发明内容
发明要解决的问题
针对以上现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种能够获得具有促进细胞生长或增殖作用的水母促生长肽的制备方法，以及用该方法制备得到的水母促生长肽及其应用。本发明采用多菌种联合发酵技术，经分离处理后选取特定分子量的多肽片段，对细胞的生长或增殖有良好的促进作用。
用于解决问题的方案
本发明提供一种水母促生长肽的制备方法，所述制备方法包括：
发酵步骤：在含有水母触手颗粒的浆液中接种混合菌种进行发酵培养，得到发酵液；
分离步骤：对所述发酵液进行分离处理，获取含所述水母促生长肽的分离产物；
其中，所述混合菌种包括嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、假交替单胞菌、产阮假丝酵母菌、酿酒酵母菌、纳豆芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌中的两种或两种以上的组合。
根据本发明的水母促生长肽的制备方法，其中，所述混合菌种的总接种量为5×102-9×107CFU/mL，优选为5×105-9×106CFU/mL。
根据本发明的水母促生长肽的制备方法，其中，所述混合菌种包括双歧杆菌、酿酒酵母菌和纳豆芽孢杆菌；优选地，所述双歧杆菌、所述酿酒酵母菌与所述纳豆芽孢杆菌的接种比为0.5～5:0.5～5:1。
根据本发明的水母促生长肽的制备方法，其中，所述发酵步骤中，发酵培养前的浆液的pH为6.0～7.5，发酵培养的温度为25～38℃，发酵培养的时间为10～96h。
根据本发明的水母促生长肽的制备方法，其中，所述分离步骤包括：
采用透析装置至少将所述发酵液中的数均分子量小于50D的小分子物质去除，得到透析产物；
利用第一超滤装置至少将透析产物中数均分子量高于10000D的部分去除，得到含所述水母促生长肽的初提液。
根据本发明的水母促生长肽的制备方法，其中，所述分离步骤还包括采用不同规格的其它超滤装置，得到不同分子量范围的水母促生长肽。
根据本发明的水母促生长肽的制备方法，其中，在发酵步骤之前，还包括将混合菌种接种至活化培养基中进行活化的步骤。
根据本发明的水母促生长肽的制备方法，其中，在发酵步骤之前，所述制备方法还包括水母触手颗粒制备步骤，所述水母触手颗粒制备步骤包括将水母触手置于溶剂中浸泡后，对所述水母触手进行干燥后粉碎，得到所述水母触手颗粒。
本发明还提供一种根据本发明的制备方法制备得到的水母促生长肽，其中，所述水母促生长肽的数均分子量为10000D以下，优选为2000D～8000D。
本发明还提供一种根据本发明的水母促生长肽用于制备促进皮肤中的细胞生长或增殖的化妆品或药品中的用途。
发明的效果
本发明的水母促生长肽的分子量更合适，安全性高，且稳定性优异，透皮吸收率高。
进一步地，本发明的水母促生长肽对皮肤中的细胞的生长或增殖具有良好的促进作用，能够提高皮肤中的细胞再生能力，增加皮肤弹性。
本发明的水母促生长肽的制备方法简单易行，原料易于获取，适合大批量生产。
附图说明
图1示出了本发明实施例1的不同分子量的水母促生长肽使用MTT法检测细胞增殖率变化图；
图2示出了本发明实施例2的不同分子量的水母促生长肽使用MTT法检测细胞增殖率变化图；
图3示出了本发明实施例3的不同分子量的水母促生长肽使用MTT法检测细胞增殖率变化图。
具体实施方式
以下，针对本发明的内容进行详细说明。以下所记载的技术特征的说明基于本发明的代表性的实施方案、具体例子而进行，但本发明不限定于这些实施方案、具体例子。
另外，为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
需要说明的是：
本说明书中，单位“D”为道尔顿，作为原子质量单位，定义为碳12原子质量的1/12，1D＝1g/mol。
本说明书中，如有使用“分子量”的表述，其含义是“数均分子量”。
本说明书中，术语“MTT”表示噻唑蓝。
本说明书中，所使用的“水”包括去离子水、蒸馏水、双蒸水、纯净水、离子交换水等任何化妆品领域可行的水。
本说明书中，所述的“室温”的含义可以是10～30℃。
如无特殊声明，本发明所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值，数值范围，均应当理解为包含了工业生产中所允许的误差。
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
<第一方面>
本发明的第一方面提供了一种水母促生长肽的制备方法，所述制备方法包括：
发酵步骤：在含有水母触手颗粒的浆液中接种混合菌种进行发酵培养，得到发酵液；
分离步骤：对所述发酵液进行分离处理，获取含所述水母促生长肽的分离产物。
本发明的水母促生长肽使用多菌种联合培养技术，使水母的生物利用率提高，且最终得到的水母促生长肽的目标产物多样。具体而言：
水母
水母是水生环境中重要的浮游生物，例如：刺胞动物门钵水母纲和立方水母纲。水母的身体外形就像一把透明伞，伞状体的直径有大有小，大水母的伞状体直径可达2米。伞状体边缘长有一些须状的触手，有的触手可长达20-30米。
水母在捕食或防御天敌的过程中，水母触手会出现断裂、脱落的状况，但受损部位很快会长出新的触手。水母表现出的超强创伤修复能力，提示我们水母触手或者水母体内可能含有某些高生物活性的促生长物质。研究证实，水母触手中含有大量促增殖效应的活性物质。经过测序比对，水母触手与人体血管内皮生长因子VEGF类似序列，这为从水母触手中制备促生长肽提供了重要的理论依据。因此，为了获得分子量合适，安全性高，且稳定性优异，透皮吸收率高的水母促生长肽，可以使用水母触手作为原料进行制备。
水母触手颗粒制备步骤
本发明以水母触手作为原料，考虑到水母触手的主要成分，本发明可以对水母触手进行处理，以制备水母触手颗粒。本发明对水母触手颗粒制备步骤的具体步骤不作特定限定，都是本领域常用的一些方法，例如：清洗、浸泡、干燥、粉碎、灭菌等。
所述清洗，可以使用水和/或低沸点的烃类、醇类、醚类、酮类等有机溶剂对水母触手进行清洗，以去除表面污物和浮沫。所述浸泡，可以使用溶剂进行浸泡，所述溶剂可以是水和/或低沸点的烃类、醇类、醚类、酮类等有机溶剂对水母触手进行浸泡，作为优选，浸泡的时间可以是12～36小时，每隔1-3小时换一次溶剂。为了不影响目标产物的性能，优选使用水进行清洗和/或浸泡。
对于干燥，所述干燥可以在加热和/或减压的条件下进行以得到干燥的产品。但是，为了不影响后续的发酵步骤，优选使用冷冻干燥的方式进行处理。
对于粉碎，可以是任意可行的粉碎技术，可列举的粉碎技术有手动或电动切割式粉碎技术、手动或电动研磨粉碎技术、电动球磨粉碎技术等中的一种或两种以上的技术联用。对于粉碎后的粒度，本发明不作特别限定，可以是有利于发酵步骤的任何可行的粒度。作为优选，所述粉碎的水母触手颗粒的平均粒度以目数计可以为20～200目；优选为20～100目；进一步优选为60～80目。
具体地，在本发明中，所述水母触手颗粒制备步骤包括将水母触手置于溶剂中浸泡后，对所述水母触手进行干燥后粉碎并灭菌，得到所述水母触手颗粒。
在本发明的一些优选的实施方案中，所述水母触手颗粒制备步骤包括以下步骤，将水母触手从活体水母上分离，然后进行清洗并浸泡，之后对所述水母触手进行冷冻干燥后粉碎并灭菌，以得到所述水母触手颗粒。
进一步，对于灭菌，一般而言，灭菌常用的方法有化学试剂灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和过滤除菌等。在本发明中，优选使用湿热灭菌，举例而言，将上述粉碎的水母触手颗粒加入到水中，加热到90～110℃进行灭菌。优选地加热温度100℃，灭菌时间为10～20分钟，可以直接得到含有水母触手颗粒的浆液。灭菌后，降温至室温可以直接进行发酵培养的步骤。
发酵步骤
本发明是在含有水母触手颗粒的浆液中接种混合菌种进行发酵培养。通过使用混合菌种，形成多菌种联合培养技术，能够获得分子量合适、稳定性优异，且透皮吸收率高的水母促生长肽。
在本发明中，所述混合菌种包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)、产阮假丝酵母菌(Candida utilis)、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中的两种或两种以上的组合。
进一步，所述发酵步骤中，所述水母触手颗粒浆液中水母触手颗粒的含量为0.5-5g/mL，优选为0.5-4g/mL；所述混合菌种的总接种量为5×102-9×107CFU/mL，优选为5×105-9×106CFU/mL，当混合均菌的总接种量在5×102-9×107CFU/mL的范围内时，能够获得分子量合适的水母促生长肽。作为优选，所述混合菌种包括双歧杆菌、酿酒酵母菌、纳豆芽孢杆菌中的两种或两种以上的组合。
在本发明的一些优选的实施方案中，所述混合菌种为双歧杆菌(Bifidobacterium)、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)的组合；优选地，双歧杆菌、酿酒酵母菌与纳豆芽孢杆菌的接种比为0.5～5:0.5～5:1，具体地，所述接种比可以是0.8～4:0.8～4:1，可以是1～3:1～3:1，可以是1.5～2.5:1.5～2.5:1等。当双歧杆菌、酿酒酵母菌与纳豆芽孢杆菌的接种比为1～3:1～3:1时，所获得的水母促生长肽的分子量更为合适。
在本发明的一些具体的实施方案中，所述发酵步骤中，为了使发酵培养的过程能够有效进行，可以将发酵培养前含有水母触手颗粒的浆液的pH调整为6.0～7.5。
在本发明的一些具体的实施方案中，在进行发酵培养时会对发酵培养的温度和时间进行控制。具体地，所述发酵步骤中，发酵培养的温度为25～38℃；优选为28～35℃；进一步优选为30～35℃；发酵培养的时间为10～96h；优选为24～72h；进一步优选为45～50h。
进一步，本发明对进行发酵培养的装置不作特别限定，可以是本领域常用的一些培养装置。作为优选，在本发明中使用培养箱进行发酵培养。培养箱是指温度可控的，主要用于培养微生物、植物和动物细胞的箱体装置，可以具有制冷和加热的双向调温系统，培养箱的外箱体一般是采用聚氨酯等泡沫塑料作为隔热材料，对外源冷、热都有较好的隔绝能力；培养箱的内腔可以采用不锈钢制作，从而具有较强的抗腐蚀能力；培养箱可以具有加热、制冷以及自动温控装置，从而能够灵敏地调节箱内温度。
在本发明的一些具体的实施方案中，在发酵步骤之前，还包括将混合菌种接种至培养基中进行活化的步骤。具体地，可将混合菌种中的每种菌种单独接种至培养基中进行活化；也可将菌种混合后得到的混合菌种接种至培养基中进行活化。
在一些具体的实施方案中，在对双歧杆菌、酿酒酵母菌与纳豆芽孢杆菌的混合菌种进行活化前，双歧杆菌、酿酒酵母菌与纳豆芽孢杆菌的接种比为0.5～5:0.5～5:1，具体地，所述接种比可以是0.8～4:0.8～4:1，可以是1～3:1～3:1，可以是1.5～2.5:1.5～2.5:1等。当活化前的双歧杆菌、酿酒酵母菌与纳豆芽孢杆菌的接种比为1～3:1～3:1时，所获得的水母促生长肽的分子量更为合适。
在本发明的一些具体的实施方案中，菌种活化的步骤包括：将菌种接入活化培养基中在30～35℃下静止培养12～48小时进行活化。
在本发明的一些具体的实施方案中，菌种活化的步骤中使用的活化培养基可以为基础培养基。具体地，以所述活化培养基的总质量计，所述活化培养基的具体组成为牛肉膏0.5％-1.2％，蛋白胨0.3％-1.5％，氯化钠0.3％-2％，葡萄糖0.5％-2.5％，琼脂1.2％-2.8％，其余为水。
另外，在发酵步骤之后，根据需要还可以对发酵液进行灭菌。同样地，灭菌常用的方法有化学试剂灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和过滤除菌等，作为优选，本发明中采用的是湿热灭菌或干热灭菌，具体为：将发酵液加热到90-110℃，灭菌10-30min。灭菌后，取发酵液的上层清液进行分离。
分离步骤
本发明是通过对发酵液进行分离处理，以获取含所述水母促生长肽的分离产物，进而得到水母促生长肽。本发明中，由于需要特定分子量的水母促生长肽，因此，在进行分离时，优选先去除杂质短肽、氨基酸以及盐等小分子物质后，再除去一部分分子量过高的发酵产物，然后再根据需要继续分离。
具体地，所述分离步骤包括：
采用透析装置至少将所述发酵液中的数均分子量小于50D，优选小于100D，更优选小于200D的小分子物质去除，得到透析产物；
利用第一超滤装置至少将透析产物中数均分子量高于10000D的部分去除，得到所述水母促生长肽的初提液。
通过采用透析装置和第一超滤装置，可以脱除杂质短肽、氨基酸以及盐等小分子物质，并除去一部分数均分子量过高的发酵产物，得到分子量合适的水母促生长肽。
进一步地，所述分离步骤还包括：采用不同规格的其它超滤装置，分离出不同分子量范围的水母促生长肽。本文所述的“其它超滤装置”，其含义是第一超滤装置以外的，且规格小于第一超滤装置的超滤装置。
在本发明中，小分子物质可以是数均分子量低于50D的小分子物质，可以是数均分子量低于100D的小分子物质，还可以是数均分子量低于200D的小分子物质，也可以是数均分子量低于300D的小分子物质，可以根据需要选择合适的透析装置进行透析处理。
在本发明的一些具体的实施方案中，所述分离步骤包括：
(1)将发酵液离心，取上清液过滤后，利用透析装置至少将所述发酵液中的数均分子量小于50D的小分子物质去除，得到透析产物；
(2)利用第一超滤装置至少将透析产物中数均分子量高于10000D的部分去除，得到含所述水母促生长肽的初提液；
(3)采用不同规格的其它超滤装置，分离出不同分子量范围的水母促生长肽。
透析(dialysis)是通过小分子经过半透膜扩散到水(或缓冲液)的原理，将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。具体地，在本发明中，可以使用透析装置进行透析。
透析装置通常是由半透膜制成的管状或袋状容器(例如透析袋)。具体地，可以将本发明的发酵液的上清液分别置于透析装置内，将此透析装置浸入水或缓冲液中，发酵液的上清液中的较大分子量的水母促生长肽被截留在透析装置内，而较小分子量的杂质短肽、氨基酸以及盐等物质不断扩散到透析装置外，直到透析装置内外两边的浓度达到平衡为止，从而能够得到分子量合适的水母促生长肽。
具体地，所述透析装置的规格，可以根据需要进行选择，例如可以是具有如下以数均分子量为规格的超滤装置：50D、100D、150D、200D、250D、300D、350D、400D、450D、500D等。经透析处理后，有利于得到分子量更为合适的水母促生长肽。
举例而言，当使用规格为500D的透析装置时，可以滤出数均分子量低于500D的部分，数均分子量在500D以上的分离产物被截留在透析装置内。再举例而言，当使用规格为100D的透析装置时，可以滤出数均分子量低于100D的部分，数均分子量在100D以上的分离产物被截留在透析装置内。同样地，当使用其它上述可行的透析装置时，截留的分子量可以依据透析装置的规格确定。
对于超滤装置，所述超滤装置是一种孔径规格一致，额定孔径范围为0.01微米以下的微孔过滤装置，例如超滤膜等。一般而言，在超滤装置的一侧施加一定压力，以克服渗透压差，可以筛出所需要的含有特定分子量的水母促生长肽的滤液。具体地，对于超滤装置的规格，可以根据需要进行选择，例如具有如下以数均分子量为规格的超滤装置：10000D、9000D、8000D、7000D、6000D、5000D、4000D、3000D、2000D、1000D等。本发明的第一超滤装置为规格为10000D的超滤装置，通过使用第一超滤装置处理，有利于得到分子量更为合适的水母促生长肽。
举例而言，当使用规格为10000D的超滤装置时，可以将数均分子量高于10000D的部分截留在超滤装置内，得到的数均分子量在10000D以下的滤液。再举例而言，当使用规格为5000D的超滤装置时，可以截留数均分子量高于5000D的部分截留在超滤装置内，得到数均分子量在5000D以下的滤液。同样地，当使用其它上述可行的超滤装置时，截留的分子量可以依据超滤装置的规格确定。
对于所述分离步骤中步骤(3)，具体操作步骤可举例如下：第1步中所获得的含所述水母促生长肽的初提液经过规格为2000D的超滤装置，可以截留数均分子量高于2000D的部分，得到数均分子量为200～2000D的水母促生长肽A；剩余的初提液继续经过4000D的超滤装置，可以截留数均分子量高于4000D的部分，得到数均分子量为2000～4000D的水母促生长肽B；剩余的初提液继续经过6000D的超滤装置，可以截留分子量高于6000D的部分，得到数均分子量为4000～6000D的水母促生长肽C；剩余的初提液继续经过8000D的超滤装置，可以截留分子量高于8000D的部分，得到数均分子量为6000～8000D的水母促生长肽D；最后剩余数均分子量为8000～10000D的水母促生长肽E。
后处理步骤
对于本申请通过分离步骤获得的含所述水母促生长肽的分离产物，可以采用检测细胞增殖率的方法对分离产物进行筛选，以获得数均分子量范围更加合适的水母促生长肽。
优选地，所述细胞可以是皮肤中的细胞，优选是成纤维细胞。
一般而言，检测细胞增殖率的方法包括细胞培养的步骤，具体地，可以使用少量获得的不同数均分子量的水母促生长肽，进行细胞培养。对于细胞培养的步骤本发明不作特别限定，可以是本领域常规培养细胞的步骤。
作为优选，以成纤维细胞为例，具体的细胞培养方法可以包括：取对数生长期的成纤维细胞，计数后，按500～5000个/孔接种于多孔培养板，用10％小牛血清培养液培养12～48h后，换RIPM-1640培养液继续培养12～48h；
然后取不同数均分子量的分离产物分别加入到培养孔中进行培养，添加量为15～50μg/mL，选取其中的一个孔不添加该分离产物，作为空白对照组，继续培养24～96h。
在本发明中，为了提高检测效果，可以采用MTT法检测细胞增殖率。在上述培养孔中加入MTT继续孵育4h后，加入150μl二甲基亚砜DMSO充分振荡，在酶标仪上于490nm读取吸光度值A。
具体计算公式如下：
细胞增殖率(％)＝加入水母促生长肽的样品吸光度值/空白对照组样品吸光度值×100％
<第二方面>
本发明还提供了一种根据<第一方面>所述的制备方法制备得到的水母促生长肽，所述水母促生长肽的数均分子量为10000D以下；优选为2000D～8000D，例如：3000D～7000D，再如：4000D～6000D等。
本发明的所获得的水母促生长肽的数均分子量适中，安全性高，且稳定性优异，透皮吸收率高。进一步地，本发明的水母促生长肽对皮肤中的细胞的生长或增殖具有良好的促进作用，提高皮肤中的细胞再生能力，增加皮肤弹性。
<第三方面>
本发明还提供了一种根据<第一方面>所述的制备方法得到的水母促生长肽用于制备促进皮肤中的细胞生长或增殖的化妆品或药品中的用途。另外，本发明的水母促生长肽还可以用于制备促进皮肤中的细胞生长或增殖的保健品、食品、营养强化剂、动物饲料、日化用品等中的用途。
作为优选，本发明的水母促生长肽用于制备促进皮肤中的细胞生长或增殖的化妆品中的用途。
所述化妆品包括水剂型、乳剂型、霜剂型。所述水剂型护肤品包括：修护水、化妆水、卸妆水或保湿水等；所述乳剂型护肤品包括：润肤乳液、护肤精华、眼部精化、面膜、补水啫喱、洁面乳、防晒乳或隔离乳等；所述霜剂型护肤品包括护肤膏霜、防晒霜、BB霜、隔离霜或眼霜等。
实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
双歧杆菌(Bifidobacterium)：GIM1.520，广东省微生物菌种保藏中心；
酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)：GIM2.213，广东省微生物菌种保藏中心；
纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)：BNCC337815，北纳生物菌种保藏中心；
水母为海月水母(Aurelia aurita)，在广州南沙水产市场购得；
成纤维细胞是人真皮成纤维细胞：CP-H103，武汉普诺赛生命科技有限公司。
实施例1
将水母触手从活体水母上分离出来，进行清理，去除表面污物和浮沫；将清洗过的水母触手放在去离子水中浸泡24小时，每隔2小时换水一次；浸泡完毕，将水母触手捞出沥干水分，放入冷冻室冷冻干燥，冷冻后粉碎，得到以目数计，平均粒度为60目的水母触手颗粒。将上述粉碎后的水母触手颗粒以2g/mL的浓度加入到去离子中，加热到100℃灭菌20分钟，冷却后，得到含有水母触手颗粒的浆液。
将双歧杆菌、酿酒酵母菌、纳豆芽孢杆菌菌种以1：2：1的接种比混合接种到活化培养基中在33℃下静止培养24h进行活化。以所述活化培养基的总质量计，所述活化培养基的具体组成为牛肉膏0.8％，蛋白胨1.0％，氯化钠0.5％，葡萄糖1.2％，琼脂2.0％，其余为水。
在所述水母触手颗粒的浆液中接种活化后的混合菌种，总接种量为6×105CFU/mL，置于培养箱中发酵培养，发酵培养的pH为6.3，发酵培养的温度为35℃，发酵培养的时间为45h，得到发酵液；发酵完成后，将发酵液加热到100℃，20min进行灭菌处理，将灭菌后的发酵液离心20分钟，取上层清液。
将上层清液通过规格为100D的透析袋去除数均分子量低于100D的盐类等小分子物质，再通过规格为9000D的超滤膜去除数均分子量高于9000D的部分，得到含所述水母促生长肽的初提液。
初提液经过规格为2000D的超滤膜，可以截留数均分子量高于2000D的部分，得到分子量为100～2000D的滤液为水母促生长肽A；剩余的初提液继续经过规格为4000D的超滤膜，可以截留数均分子量高于4000D的部分，得到数均分子量为2000～4000D的滤液为水母促生长肽B；剩余初提液继续经过规格为6000D的超滤膜，可以截留数均分子量高于6000D的部分，得到数均分子量为4000～6000D的滤液为水母促生长肽C；剩余初提液继续经过规格为8000D的超滤膜，可以截留数均分子量高于8000D的部分，得到数均分子量为6000～8000D的滤液为水母促生长肽D；剩余的数均分子量为8000～9000D的初提液为水母促生长肽E。
MTT法细胞增殖实验：取对数生长期的成纤维细胞，计数后，按1500个/孔接种于96孔培养板，用10％小牛血清培养液在37℃培养箱中培养24h后，换RIPM-1640培养液继续培养24h；
然后取上述不同数均分子量的水母促生长肽A～E分别加入到不同的培养孔中进行培养，每种水母促生长肽添加量为15μg/mL，选取其中的一个孔不添加水母促生长肽，作为空白对照组，继续培养48h。
加入MTT继续孵育4h后，加入150μl二甲基亚砜DMSO充分振荡，在酶标仪上于490nm读取吸光度值A，并计算细胞增殖率。
其中，细胞增殖率(％)＝加入水母促生长肽的样品吸光度值/空白对照组样品吸光度值×100％
不同分子量的水母促生长肽使用MTT法检测细胞增殖率变化如图1所示。
实施例2
将水母触手从活体水母上分离出来，进行清理，去除表面污物和浮沫；将清洗过的水母触手放在去离子水中浸泡24小时，每隔2小时换水一次；浸泡完毕，将水母触手捞出沥干水分，放入冷冻室冷冻干燥，冷冻后粉碎，得到以目数计，平均粒度为80目的水母触手颗粒。将上述粉碎后的水母触手颗粒以2g/mL的浓度加入到去离子水中，加热到100℃灭菌20分钟，冷却后，得到含有水母触手颗粒的浆液。
将双歧杆菌、酿酒酵母菌、纳豆芽孢杆菌菌种以2：2：1的接种比混合接种到活化培养基中在34℃下静止培养28小时进行活化。以所述活化培养基的总质量计，所述活化培养基的具体组成为牛肉膏0.8％，蛋白胨1.0％，氯化钠0.5％，葡萄糖1.2％，琼脂2.0％，其余为水。
在所述水母触手颗粒的浆液中接种活化后的混合菌种，接种量为7×105CFU/mL，置于培养箱中发酵培养，发酵培养的pH为6.5，发酵培养的温度为34℃，发酵培养的时间为48h，得到发酵液；发酵完成后，将发酵液加热到100℃，20min进行灭菌处理，将灭菌后的发酵液离心20分钟，取上层清液。
将上层清液通过规格为200D的透析袋去除数均分子量低于200D的盐类等小分子物质，再通过规格为10000D的超滤膜去除数均分子量高于10000D的部分，得到含所述水母促生长肽的初提液。
初提液经过规格为2000D的超滤膜，可以截留数均分子量高于2000D的部分，得到分子量为200～2000D的滤液为水母促生长肽A；剩余的初提液继续经过规格为4000D的超滤膜，可以截留数均分子量高于4000D的部分，得到数均分子量为2000～4000D的滤液为水母促生长肽B；剩余的初提液继续经过规格为6000D的超滤膜，可以截留数均分子量高于6000D的部分，得到数均分子量为4000～6000D的滤液为水母促生长肽C；剩余的初提液继续经过规格为8000D的超滤膜，可以截留数均分子量高于8000D的部分，得到数均分子量为6000～8000D的滤液为水母促生长肽D；剩余的数均分子量为8000～10000D的初提液为水母促生长肽E。
MTT法细胞增殖实验：取对数生长期的成纤维细胞，计数后，按1500个/孔接种于96孔培养板，用10％小牛血清培养液在37℃培养箱中培养24h后，换RIPM-1640培养液继续培养24h；
然后取上述不同数均分子量的水母促生长肽A～E分别加入到不同的培养孔中进行培养，每种水母促生长肽添加量为15μg/mL，选取其中的一个孔不添加该滤液，作为空白对照组，继续培养48h。
加入MTT继续孵育4h后，加入150μl二甲基亚砜DMSO充分振荡，在酶标仪上于490nm读取吸光度值A，并计算细胞增殖率。
其中，细胞增殖率(％)＝加入水母促生长肽的样品吸光度值/空白对照组样品吸光度值×100％
不同分子量的水母促生长肽使用MTT法检测细胞增殖率变化图如图2所示。
实施例3
将水母触手从活体水母上分离出来，进行清理，去除表面污物和浮沫；将清洗过的水母触手放在去离子水中浸泡24小时，每隔2小时换水一次；浸泡完毕，将水母触手捞出沥干水分，放入冷冻室冷冻干燥，冷冻后粉碎成70目的水母触手颗粒。将上述粉碎后的水母触手颗粒以2g/mL的浓度加入到去离子水中，加热到100℃灭菌20分钟，冷却后，得到含有水母触手颗粒的浆液。
将双歧杆菌、酿酒酵母菌、纳豆芽孢杆菌菌种以2：1：1的接种比混合接种到活化培养基中在32℃下静止培养32小时进行活化。以所述活化培养基的总质量计，所述活化培养基的具体组成为牛肉膏0.8％，蛋白胨1.0％，氯化钠0.5％，葡萄糖1.2％，琼脂2.0％，其余为水。
在所述水母触手颗粒的浆液中接种活化后的混合菌种，总接种量为6×106CFU/mL，置于培养箱中发酵培养，发酵培养的pH为6.7，发酵培养的温度为33℃，发酵培养的时间为50h，得到发酵液；发酵完成后，将发酵液加热到100℃，20min进行灭菌处理，将灭菌后的发酵液离心20分钟，取上层清液。
将上层清液通过规格为300D的透析袋去除低于数均分子量300D的盐类等小分子物质，再通过规格为8000D的超滤膜去除数均分子量高于8000D的部分，得到含所述水母促生长肽的初提液。
初提液经过规格为1000D的超滤膜，可以截留数均分子量高于1000D的部分，得到分子量为300～1000D的滤液为水母促生长肽A；剩余的初提液继续经过规格为3000D的超滤膜，可以截留分子量高于数均3000D的部分，得到数均分子量为1000～3000D的滤液为水母促生长肽B；剩余的初提液继续经过规格为5000D的超滤膜，可以截留数均分子量高于5000D的部分，得到数均分子量为3000～5000D的滤液为水母促生长肽C；剩余的初提液继续经过规格为7000D的超滤膜，可以截留数均分子量高于7000D的部分，得到数均分子量为5000～7000D的滤液为水母促生长肽D；剩余的分子量为7000～8000D的初提液为水母促生长肽E。
MTT法细胞增殖实验：取对数生长期的成纤维细胞，计数后，按1500个/孔接种于96孔培养板，用10％小牛血清培养液在37℃培养箱中培养24h后，换RIPM-1640培养液继续培养24h；
然后取上述不同数均分子量的水母促生长肽A～E分别加入到不同的培养孔中进行培养，每种水母促生长肽添加量为15μg/mL，选取其中的一个孔不添加该滤液，作为空白对照组，继续培养48h。
加入MTT继续孵育4h后，加入150μl二甲基亚砜DMSO充分振荡，在酶标仪上于490nm读取吸光度值A，并计算细胞增殖率。
其中，细胞增殖率(％)＝加入水母促生长肽的样品吸光度值/空白对照组样品吸光度值×100％
不同分子量的水母促生长肽使用MTT法检测细胞增殖率变化图如图3所示。
产业上的可利用性
本发明所述的水母促生长肽的制备方法，以及所述制备方法制备得到的水母促生长肽及其应用，可以在工业上实施。
本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种水母促生长肽用于制备促进皮肤中的成纤维细胞生长或增殖的化妆品中的用途，其特征在于，所述水母促生长肽的制备方法包括：
发酵步骤：在含有水母触手颗粒的浆液中接种混合菌种进行发酵培养，得到发酵液；
分离步骤：对所述发酵液进行分离处理，获取含所述水母促生长肽的分离产物；
其中，所述混合菌种包括双歧杆菌、酿酒酵母菌和纳豆芽孢杆菌；所述双歧杆菌、所述酿酒酵母菌与所述纳豆芽孢杆菌的接种比为0.5~5:0.5~5:1；
所述分离步骤包括：
采用透析装置至少将所述发酵液中的数均分子量小于50D的小分子物质去除，得到透析产物；
利用第一超滤装置至少将透析产物中数均分子量高于10000D的部分去除，得到含所述水母促生长肽的初提液；
所述分离步骤还包括采用不同规格的其它超滤装置，得到不同分子量范围的水母促生长肽；
所述水母促生长肽的数均分子量为2000D~8000D。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述混合菌种的总接种量为5×105-9×107CFU/mL。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述混合菌种的总接种量为5×105-9×106CFU/mL。
4.根据权利要求1-3任一项所述的用途，其特征在于，所述发酵步骤中，发酵培养前的浆液的pH为6.0~7.5，发酵培养的温度为25~38 ℃，发酵培养的时间为10~96 h。
5.根据权利要求1-3任一项所述的用途，其特征在于，在发酵步骤之前，还包括将混合菌种接种至活化培养基中进行活化的步骤。
6.根据权利要求1-3任一项所述的用途，其特征在于，在发酵步骤之前，所述制备方法还包括水母触手颗粒制备步骤，所述水母触手颗粒制备步骤包括将水母触手置于溶剂中浸泡后，对所述水母触手进行干燥后粉碎，得到所述水母触手颗粒。
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