CN110628863A - 一种发酵酶解提高河豚鱼皮抗氧化能力的工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种发酵酶解提高河豚鱼皮抗氧化能力的工艺，属于海洋生物技术领域。本发明以河豚鱼皮为原料，集成现代生物分离技术、生物酶解技术、混菌微生物发酵技术，研制开发出高体外抗氧化能力的河豚鱼皮多肽生物制品，其中混菌好氧发酵菌种主要包括黑曲霉和枯草芽孢杆菌。所得河豚鱼皮多肽具有较强的抗氧化能力，提取液可根据应用途径做浓缩、吸附干燥、醇析或树脂纯化等处理，满足在保健、食品、医药等领域的高效利用。该工艺技术简单高效、所得产品抗氧化能力和自由基清除能力强，产品稳定性强，生产成本低，易于工业化规模生产。

Description

一种发酵酶解提高河豚鱼皮抗氧化能力的工艺
技术领域
本发明涉及一种发酵酶解提高河豚鱼皮抗氧化能力的工艺，尤其是一种利用微生物协同发酵联合酶解工艺制备高抗氧化能力的河豚鱼皮多肽生物制品，属于海洋生物技术领域。
背景技术
据史料记载，我国食用河豚鱼已有四千多年的历史，但是古人对食用河豚鱼也是褒贬不一，既有“甘美远胜西子乳，吴王当年未曾知”对河豚鱼肉美味的赞美，又有“庖煎苟失所，入喉为镆铘”对食河豚的规劝。由于河豚含有河豚毒素，每年都有因食用河豚丧命者，因此我国禁食河豚鱼。2016年，国家对红鳍东方鲀和暗纹东方鲀实行解禁，禁止了26年之久的河豚鱼可以被端上消费者的餐桌，这无疑推动了河豚养殖业的发展，也使人们能够一饱口福。随着河豚市场的开放和人工养殖无毒河豚鱼产业的发展，国内的河豚鱼需求将会逐渐增加，研究河豚鱼的营养价值及其副产物的综合利用对未来河豚鱼养殖及加工产业的发展有着重要意义
河豚鱼皮中含有丰富的胶原蛋白，胶原蛋白具有抗氧化、抗肿瘤、降血压、促进伤口愈合以及美容等功效，已被广泛用于食品、化妆品、医药行业。目前，以猪、牛等哺乳动物为来源的胶原蛋白受到口蹄疫、疯牛病等多种感染性疾病的威胁，鱼皮、鱼鳞胶原蛋白是替代它们的较好来源。河豚鱼皮中胶原蛋白含量较高，提取率也较其他哺乳动物胶原蛋白的提取率高。任俊凤测定的红鳍东方鲀鱼皮中蛋白质含量约为鱼皮干重的97.30%，胶原蛋白含量占总蛋白含量的90%。从河豚鱼皮中提取胶原蛋白肽，通过测定其对自由基OH·、DPPH·、O2 —·的清除能力发现河豚鱼皮胶原蛋白肽具有很强的抗氧化性。
目前，我国对河豚鱼的研究利用还处于初级阶段，随着国家对河豚鱼限制的逐渐解除，对河豚鱼的研究将会更加全面。现有技术中，关于河豚鱼皮多肽及其在食品中的应用研究较少，如专利201510951376.5公开了一种复合发酵型河豚鱼皮保健饮料的生产工艺，选用玛河豚鱼皮、海参、枸杞、山楂、山药、红景天、甜叶菊、何首乌、刺五加、人参、肉苁蓉、葛根、甘草为原料通过复合发酵生产工艺生产豚鱼皮保健饮料，但该专利并未公开如何制备高纯度的河豚鱼皮多肽；专利201410078719.7公开了种基于壳寡糖修饰具有抗冻功能的鱼皮蛋白多肽复合物，主要是将鱼皮磨成浆，离心去掉脂肪；接着用超声波处理、复合酶酶解，再对酶解产物离心，取上清液；采用二步超滤上清液，得分子量5000～8000道尔顿的鱼皮蛋白多肽，再与壳寡糖反应，得鱼皮蛋白多肽复合物。比较上述文献可以发现，关于河豚鱼皮多肽的制备多采用复合酶解法，缺少复合微生物发酵关键技术的应用，尤其是缺乏提高河豚鱼皮多肽营养性的研究成为制约产业发展的关键瓶颈。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，满足河豚鱼皮多肽高效提取及高抗氧化能力应用，本申请提供一种发酵酶解提高河豚鱼皮抗氧化能力的工艺，集成现代生物分离技术、生物酶解技术、混菌微生物发酵技术，研制开发出高体外抗氧化能力的河豚鱼皮多肽生物制品，满足保健、医疗、食品等领域对河豚鱼皮多肽的应用需求，该工艺工艺简单高效、所得产品抗氧化能力和自由基清除能力强，生产成本低，易于工业化规模生产。
本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：
一种发酵酶解提高河豚鱼皮抗氧化能力的工艺，其特征在于具体包括如下步骤：
（1）匀浆：将河豚鱼皮粉碎，加水匀浆；
（2）酶解：向匀浆后的加入3000～5000U/g的复合蛋白酶，控温40～60℃条件下酶解4h；
（3）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比3～5%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵12～24h；
（4）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入1～2%的乳酸杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵8～16h；
（5）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；
（6）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；
（7）离心：以10000r/min速率离心分离，上清液即为河豚鱼皮多肽提取液。
上述步骤（1）中最佳加水比例为河豚鱼皮：水=1:8。
优选的，在河豚鱼皮匀浆过程中加入河豚鱼皮蛋白质量比1～2%的金银花。
上述步骤（2）中所述复合蛋白酶为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶中的一种和风味蛋白酶的组合，其质量比为2:1。
最优的，所述复合蛋白酶为中性蛋白酶和风味蛋白酶的组合，其质量比为2:1。
上述步骤（3）中所述复合微生物菌剂为黑曲霉和枯草芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为3:1。
上述步骤（3）中好氧发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.1～0.2m3/m3.min，搅拌转速控制在300r/min。
黑曲霉的种子液的制备方法为：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～40℃条件下培养24h，制得黑曲霉种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
上述枯草芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体枯草芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
本发明提供一种发酵酶解提高河豚鱼皮抗氧化能力的工艺，所得河豚鱼皮多肽具有较强的抗氧化能力，提取液可根据应用途径做浓缩、吸附干燥、醇析或树脂纯化等处理，满足在保健、食品、医药等领域的高效利用。
本发明提供一种发酵酶解提高河豚鱼皮抗氧化能力的工艺，与现有技术相比，具有以下显著优势：
（1）本申请以河豚鱼皮为原料，集成现代生物分离技术、生物酶解技术、混菌微生物发酵技术，显著提升了河豚鱼皮抗氧化能力；尤为重要的是，本申请创造性的发现，在河豚鱼皮蛋白溶解液中加入一定比例的金银花可以显著提高酶解发酵法制备的河豚鱼皮多肽的抗氧化能力，分析原因，清热解毒类中草药金银花尽管对微生物具有一定的抑制作用，但金银花中的活性物质与河豚鱼皮多肽产生复杂的化合反应，突破河豚鱼皮中酶解联合发酵过程中抑制因子的抑制作用，其对单一酶解或发酵工艺仍存在少许抑制作用；试验结果还表明补益类中药（如党参、人参）等并不能提高河豚鱼皮多肽的抗氧化能力；
（2）本申请利用好氧菌（黑曲霉、枯草芽孢杆菌）共同发酵河豚鱼皮提取河豚鱼皮多肽，充分利用微生物间的协同作用，提升河豚鱼皮多肽的提取率和体外抗氧化能力，其中：黑曲霉在发酵过程中会产生各种降解细胞壁的酶类，使得更多的多肽等功能活性物质从细胞壁中释放出来，有利于提升河豚鱼皮多肽的体外抗氧化能力；枯草芽孢杆菌在高温发酵过程中能够杀灭发酵液中的致病菌，并具有较强的产淀粉酶、蛋白酶等能力，可以将大分子淀粉、蛋白物质降解为微生物所利用；黑曲霉与枯草芽孢杆菌的协同作用显著提升了产品的抗氧化能力；
（3）本发明采用乳酸杆菌进行厌氧发酵，提升了河豚鱼皮多肽的稳定性，试验结果表明，在20～80℃范围内，温度和时间对河豚鱼皮蛋白水解肽抗氧化性影响不大，当温度超过100℃时抗氧化性随着温度和时间的增加开始降低，稳定性高于目前报道的技术水平；
（4）本发明采用发酵没法提高河豚鱼皮多肽的抗氧化能力，在本申请工艺条件下直接以河豚鱼皮为原料，无需通过水洗提取胶原蛋白去除非胶原蛋白，节约生产用水；且本发明发酵工艺条件温和，生产成本低，且易于规模化生产。
具体实施方式
在本申请中，黑曲霉和枯草芽孢杆菌的活化方法如下：
（1）黑曲霉种子液制备方法为：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～40℃条件下培养24h，制得黑曲霉种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL；
（2）上述枯草芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体枯草芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
实施例1
一种发酵酶解提高河豚鱼皮抗氧化能力的工艺，具体工艺步骤包括：
（1）匀浆：将河豚鱼皮粉碎，加水匀浆；加水比例为河豚鱼皮：水=1:8；
（2）酶解：向向匀浆后的加入4500U/g的复合蛋白酶，控温40～60℃条件下酶解4h；所述复合蛋白酶为中性蛋白酶和风味蛋白酶的组合，其质量比为2:1；
（3）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比4%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵18h；所述复合微生物菌剂为黑曲霉和枯草芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为3:1；发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.1～0.2m3/m3.min，搅拌转速控制在300r/min；
（4）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的乳酸杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵12h；
（5）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；
（6）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；
（7）离心：以10000r/min速率离心分离，上清液即为河豚鱼皮多肽提取液。
参照任俊凤《河豚鱼皮胶原蛋白肽的制备及抗氧化性的研究》测定提取液中肽得率及对羟自由基（OH·）的清除作用；阳性对照组采用任俊凤采用的实验方法制备的河豚鱼皮提取液，对照1组仅采用酶解法，不含发酵工艺，其余同实施例1；对照2组仅采用发酵工艺，不含酶解工艺，其余同实施例1；实验结果如下：
试验组别 肽得率（%） 羟自由基清除率（%）
阳性对照组 35.28 66.93
实施例1试验组 42.68 71.86
对照1组 28.56 49.86
对照2组 21.87 38.69
实施例2
一种发酵酶解提高河豚鱼皮抗氧化能力的工艺，具体工艺步骤包括：
（1）匀浆：将河豚鱼皮粉碎，加水匀浆；加水比例为河豚鱼皮：水=1:8；
（2）酶解：向向匀浆后的加入4500U/g的复合蛋白酶，控温40～60℃条件下酶解4h；所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的组合，其质量比为2:1；
（3）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比4%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵18h；所述复合微生物菌剂为黑曲霉和枯草芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为3:1；发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.1～0.2m3/m3.min，搅拌转速控制在300r/min；
（4）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的乳酸杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵12h；
（5）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；
（6）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；
（7）离心：以10000r/min速率离心分离，上清液即为河豚鱼皮多肽提取液。
参照任俊凤《河豚鱼皮胶原蛋白肽的制备及抗氧化性的研究》测定提取液中肽得率及对羟自由基（OH·）的清除作用；阳性对照组采用任俊凤采用的实验方法制备的河豚鱼皮提取液，对照1组仅采用酶解法，不含发酵工艺，其余同实施例2；对照2组仅采用发酵工艺，不含酶解工艺，其余同实施例2；实验结果如下：
试验组别 肽得率（%） 羟自由基清除率（%）
阳性对照组 35.28 66.93
实施例2试验组 38.12 63.88
对照1组 32.37 65.03
对照2组 20.53 39.11
实施例3
一种发酵酶解提高河豚鱼皮抗氧化能力的工艺，具体工艺步骤包括：
（1）匀浆：将河豚鱼皮粉碎，加水匀浆；加水比例为河豚鱼皮：水=1:8；在河豚鱼皮匀浆过程中加入河豚鱼皮蛋白质量比1%的金银花；
（2）酶解：向向匀浆后的加入4500U/g的复合蛋白酶，控温40～60℃条件下酶解4h；所述复合蛋白酶为中性蛋白酶和风味蛋白酶的组合，其质量比为2:1；
（3）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比4%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵18h；所述复合微生物菌剂为黑曲霉和枯草芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为3:1；发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.1～0.2m3/m3.min，搅拌转速控制在300r/min；
（4）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的乳酸杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵12h；
（5）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；
（6）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；
（7）离心：以10000r/min速率离心分离，上清液即为河豚鱼皮多肽提取液。
参照任俊凤《河豚鱼皮胶原蛋白肽的制备及抗氧化性的研究》测定提取液中肽得率及对羟自由基（OH·）的清除作用；阳性对照组采用任俊凤采用的实验方法制备的河豚鱼皮提取液，对照1组仅采用酶解法，不含发酵工艺，其余同实施例3；对照2组仅采用发酵工艺，不含酶解工艺，其余同实施例3；实验结果如下：
试验组别 肽得率（%） 羟自由基清除率（%）
阳性对照组 35.28 66.93
实施例1试验组 54.85 82.63
对照1组 26.07 42.41
对照2组 20.55 36.57
实施例4
一种发酵酶解提高河豚鱼皮抗氧化能力的工艺，具体工艺步骤包括：
（1）匀浆：将河豚鱼皮粉碎，加水匀浆；加水比例为河豚鱼皮：水=1:8；在河豚鱼皮匀浆过程中加入河豚鱼皮蛋白质量比2%的金银花；
（2）酶解：向向匀浆后的加入4500U/g的复合蛋白酶，控温40～60℃条件下酶解4h；所述复合蛋白酶为中性蛋白酶和风味蛋白酶的组合，其质量比为2:1；
（3）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比4%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵18h；所述复合微生物菌剂为黑曲霉和枯草芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为3:1；发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.1～0.2m3/m3.min，搅拌转速控制在300r/min；
（4）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入2%的乳酸杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵12h；
（5）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；
（6）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；
（7）离心：以10000r/min速率离心分离，上清液即为河豚鱼皮多肽提取液。
参照任俊凤《河豚鱼皮胶原蛋白肽的制备及抗氧化性的研究》测定提取液中肽得率及对羟自由基（OH·）的清除作用；阳性对照组采用任俊凤采用的实验方法制备的河豚鱼皮提取液，对照1组仅采用酶解法，不含发酵工艺，其余同实施例4；对照2组仅采用发酵工艺，不含酶解工艺，其余同实施例4；实验结果如下：
试验组别 肽得率（%） 羟自由基清除率（%）
阳性对照组 35.28 66.93
实施例1试验组 46.82 76.90
对照1组 25.98 42.55
对照2组 19.79 35.37
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对被发明进行了详细的说明，但对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而对这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种发酵酶解提高河豚鱼皮抗氧化能力的工艺，其特征在于具体包括如下步骤：
（1）匀浆：将河豚鱼皮粉碎，加水匀浆；
（2）酶解：向匀浆后的加入3000～5000U/g的复合蛋白酶，控温40～60℃条件下酶解4h；
（3）好氧发酵：向酶解后的酶解液中加入酶解液质量比3～5%的复合微生物菌剂，在28～35℃条件下好氧发酵12～24h；
（4）厌氧发酵：好氧发酵结束后加入1～2%的乳酸杆菌粉，在28～35℃条件下厌氧发酵8～16h；
（5）过滤：进行粗过滤除去发酵菌体；
（6）灭酶：在100℃条件下灭酶10min；
（7）离心：以10000r/min速率离心分离，上清液即为河豚鱼皮多肽提取液。
2.根据权利要求1所述的一种发酵酶解提高河豚鱼皮抗氧化能力的工艺，其特征在于所述步骤（1）中最佳加水比例为河豚鱼皮：水=1:8。
3.根据权利要求1所述的一种发酵酶解提高河豚鱼皮抗氧化能力的工艺，其特征在于所述匀浆过程中加入河豚鱼皮蛋白质量比1～2%的金银花。
4.根据权利要求1所述的一种发酵酶解提高河豚鱼皮抗氧化能力的工艺，其特征在于所述复合蛋白酶为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶中的一种和风味蛋白酶的组合，其质量比为2:1。
5.根据权利要求4所述的一种发酵酶解提高河豚鱼皮抗氧化能力的工艺，其特征在于所述复合蛋白酶为中性蛋白酶和风味蛋白酶的组合，其质量比为2:1。
6.根据权利要求1所述的一种发酵酶解提高河豚鱼皮抗氧化能力的工艺，其特征在于所述复合微生物菌剂为黑曲霉和枯草芽孢杆菌的混合菌剂，其质量比组成为3:1。
7.根据权利要求1所述的一种发酵酶解提高河豚鱼皮抗氧化能力的工艺，其特征在于所述好氧发酵过程在发酵罐中进行时通风量为0.1～0.2m3/m3.min，搅拌转速控制在300r/min。
8.根据权利要求1所述的一种发酵酶解提高河豚鱼皮抗氧化能力的工艺，其特征在于所述黑曲霉的种子液的制备方法为：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～40℃条件下培养24h，制得黑曲霉种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL；所述枯草芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体枯草芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
9.按权利要求1-8所述工艺制备的河豚鱼皮多肽。
10.权利要求9所述河豚鱼皮多肽在在保健、食品、医药中的应用。
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