CN117363679B - 一种河豚鱼精巢蛋白肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种河豚精巢肽，是将河豚的精巢匀浆后加入脱脂浸提液进行脱脂，脱脂后的蛋白溶解后加入蛋白酶进行酶解制备的，其一种具体的肽段的氨基酸序列为GHPGTDL和AVGKEVA。本发明所提供的河豚精巢肽可用于制备抗疲劳或抗氧化的制品。本发明制得的河豚精巢肽可以增加肝糖原的储备量，减少血乳酸和血清尿素氮的产生量，具有抗疲劳和抗氧化功效。
Description
技术领域
本发明属于功能性多肽制备技术领域，具体涉及一种河豚鱼精巢蛋白肽及其应用。
背景技术
疲劳是现代社会一种常见的亚健康状态，长期处于疲劳状态，会使机体发生内分泌紊乱，抵抗力和免疫力逐渐下降，引起早衰，甚至会引发一些潜在的慢性疾病急性发作，出现器质性病变。因此，如何缓解疲劳，改善人体亚健康状态受到人们越来越多的重视，研究开发具有抗疲劳功能的食品或营养品具有很好的市场前景。
研究发现牡蛎肉提取物可以提高小鼠的抗疲劳能力和耐缺氧能力，增强小鼠的免疫力；青石斑鱼肉多肽能降低小鼠血清尿素氮的含量，提高小鼠肝糖原含量，具有较好的抗疲劳作用。而鲑鱼蛋白能显著延长小鼠力竭游泳时间，降低血清尿素氮含量，具有明显的抗疲劳作用。
河鲀是一种高蛋白、低脂肪的鱼类，其精巢具有养精固气、滋阴补阳的功效，在日本民间有用河鲀精巢泡酒饮用的风俗。但已有的研究更多的是开发河豚为对象的食品，对河豚的深加工报道很少。
发明内容
本发明提供了一种河豚精巢肽，及其在制备抗疲劳的功能性食品中的应用。
本发明首先提供了一种河豚鱼精巢蛋白肽，是将河豚的精巢匀浆后加入脱脂浸提液进行脱脂，脱脂后的蛋白溶解后加入蛋白酶进行酶解制备的，
所述的脱脂浸提液，其一种脱脂浸提液是体积比为1:1:4的乙醚-异丙醇-蒸馏水溶液；
所述的酶解，是使用木瓜蛋白酶，在pH值为7.0，温度55℃的条件下进行酶解；
在pH值为7.0，温度55℃的溶液环境中，添加3％木瓜蛋白酶、酶解时间为8h所制备的小分子蛋白肽的效果最佳。
所述的河豚精巢肽，其一种具体的肽段的氨基酸序列为GHPGTDL(SEQ ID NO:1)和AVGKEVA(SEQ ID NO:2)。
本发明所提供的河豚精巢肽可用于制备抗疲劳或抗氧化的制品。
本发明制得的河豚精巢肽可以增加肝糖原的储备量，减少血乳酸和血清尿素氮的产生量，具有抗疲劳和抗氧化功效。
附图说明
图1为单因素对鱼精巢蛋白水解度的影响图，
图2为河豚鱼精巢蛋白肽对小鼠负重游泳时间的影响图，
图3为河豚鱼精巢蛋白肽对小鼠血清乳酸含量的影响图，
图4为河豚鱼精巢蛋白肽对小鼠血清尿素氮的影响图，
图5为河豚鱼精巢蛋白肽对小鼠肝糖原含量的影响图。
图6为河豚鱼精巢蛋白肽的中具有最好抗疲劳效果的组分的RP-HPLC分离洗脱图。
具体实施方式
本发明提取了河豚精巢蛋白肽，并通过小鼠实验测定小鼠的负重游泳时间和血清尿素氮、血清乳酸、肝糖原含量的变化，并研究其抗疲劳功效。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：制备河豚鱼精巢蛋白肽
1.1河豚精巢蛋白肽的提取
将河豚精巢置于高速组织捣碎机中捣碎，用体积比为1∶1∶4的乙醚-异丙醇-蒸馏水脱脂浸提液在恒温摇床中脱脂3h，重复脱脂1次，离心弃上清液。
沉淀加水匀浆，加入蛋白酶进行酶解。酶解结束后用沸水浴灭酶10min，冷却后5000r/min低温离心15min，取上清液冷冻干燥。
1.2最佳提取条件的筛选
选用木瓜蛋白酶，胃蛋白酶，胰蛋白酶对河豚精巢鱼白进行酶解，并对所筛选的蛋白酶的酶解实验的加酶量、液料比、酶解时间、pH值、酶解温度值等条件进行单因素实验。
(a)选酶：原料按液料比20∶1加入蒸馏水，对应调至木瓜蛋白酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶最适pH值，分别加入24000U/g加酶量的木瓜蛋白酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶。30℃恒温提取2h。每组3个平行。
(b)加酶量：原料按液料比20∶1加入蒸馏水，调pH值至6.3，分别加入1.5％，2％，3％，4％，6％，8％的木瓜蛋白酶。30℃恒温提取2h。每组3个平行。
(c)液料比：原料分别按液料比10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1加入蒸馏水，调pH值至6.3，加入3％的木瓜蛋白酶。30℃恒温酶解2h。每组3个平行。
(d)酶解时间：原料按液料比20∶1加入蒸馏水，调pH值至6.3，加入3％的木瓜蛋白酶。30℃恒温提取，提取时间分别为2，4，6，8，10h。每组3个平行。
(e)pH值：原料按液料比20加入蒸馏水，调pH分别为4、5、6、7、8，加入3％的木瓜蛋白酶。35℃恒温酶解2h。每组3个平行。
(f)酶解温度：原料按液料比20∶1加入蒸馏水，调pH值至6.3，加入3％的木瓜蛋白酶。在30、40、50、55、60、70℃下分别恒温酶解2h。每组3个平行。
由图1-A可看出，木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶均能够使河豚精巢蛋白中的蛋白肽键断裂，其中木瓜蛋白酶的水解程度最佳，可以获得更多小分子质量鱼精巢蛋白肽，远优于胃蛋白酶。可能是河豚精巢蛋白中主要成分为精氨酸、赖氨酸和组氨酸，而木瓜蛋白酶相对另外2种酶与这3种氨基酸具有较好的结合能力。采用木瓜蛋白酶试验加酶量、液料比、酶解时间、pH值、酶解温度等工艺条件对水解度的影响如图1-B～图1-F所示。
木瓜蛋白酶添加量对蛋白的水解度影响显著，在未达到3％添加量时，底物充足，少量添加酶都可以迅速提高水解进程，但达到3％后底物的酶解达到饱和，酶的继续增多只会引起水解度在一定范围内上下波动，此外基于经济考虑，酶添加量3％最合适。图1-C证实酶解的液料比具有峰形规律，河豚精巢蛋白溶液过浓过稀都不利于酶解反应的进行。过浓使得溶液黏性大，阻碍了酶与底物的传质过程；过稀又使得酶与底物结合的效率降低，因此在液料比30∶1时，水解度达到峰值，条件最佳。图1-D证实，酶解时间适当延长可使酶解更充分，但达到8h后，由于蛋白水解达到饱和平衡，继续酶解作用不大，因此最佳酶解时间为8h。酶解过程溶液的pH值和温度同样对酶解过程有影响，且均是在较低区域产生较大影响，pH值和温度由低增大，水解程度呈现先快速提高后轻微下降的趋势。pH值和温度主要对木瓜蛋白酶的活性产生影响。
因此，在pH值为7.0，温度55℃的溶液环境中，添加3％木瓜蛋白酶、酶解时间为8h所制备的河豚鱼精巢蛋白肽的效果最佳。
实施例2：河豚鱼精巢蛋白肽的抗疲劳效果
取30只小鼠，体质量为(20±2)g，将小鼠随机分为6组，包括河豚鱼精巢蛋白肽饲喂低、中、高剂量组[50、100、200mg/(kg·d)]、精巢蛋白原样组[100mg/(kg·d)]、阳性对照组[香菇多糖50mg/(kg·d)]和空白对照组(生理盐水)，每组5只小鼠，雌雄各半；分组后25℃适应环境饲养7d，光暗12h∶12h交替；每天灌胃1次，灌胃剂量见分组。灌胃前小鼠称重记录，连续28d。此期间，小鼠自由摄食及饮水。
1、河豚鱼精巢蛋白肽对小鼠体质量的影响
由表1可以看出，空白组、河豚鱼精巢蛋白肽高、中、低剂量剂量组、原样组和阳性组小鼠的体质量随着时间的延长逐渐增长。灌胃饲养相同时间时，空白组、河豚鱼精巢蛋白肽低、中、高剂量组、原样组和阳性组，各组组间小鼠体质量的差异不显著(P>0.05)，说明河豚鱼精巢蛋白肽饲喂对小鼠的体质量没有显著影响(P>0.05)。
表1：河豚鱼精巢蛋白肽对小鼠体质量的影响表
2、负重游泳实验
末次给药30min后，将各组小鼠取出，尾部绑定该只小鼠体质量5％的自制负重物；在游泳箱中放入适量水，水深约40cm，水温保持(25±1)℃；将要进行实验的小鼠充分打湿毛发，防止毛发间的空气对实验产生影响；将小鼠放入游泳箱游泳。每只水箱一次放入5只小鼠。如有小鼠趴在游泳箱边缘部位休息，则用玻璃棒驱离，使其保持运动状态，记录小鼠从游泳开始至力竭的时间(以小鼠身体完全没入水中且持续10s后为判断标准)，为小鼠力竭游泳时间。
灌胃河豚鱼精巢蛋白肽饲养28d后，各组小鼠的负重游泳时间如图2所示。高剂量组小鼠负重游泳时间为45.35min，是空白对照组小鼠负重游泳时间的2.24倍，极显著地延长了小鼠的负重游泳时间(P<0.01)，提示灌胃高剂量精巢肽使小鼠体力明显增加；中、低剂量组和原样组小鼠负重游泳时间分别是空白组的1.41、1.09倍和1.23倍，在一定程度上延长了小鼠负重游泳时间，与空白组无显著差异(P>0.05)。实验结果说明河豚鱼精巢蛋白肽能够延长小鼠负重游泳的时间，且呈现剂量效应。
3、河豚鱼精巢蛋白肽对小鼠血清乳酸含量的影响
末次给药30min后，将各组小鼠取出，尾静脉采血20μL；在游泳箱中保持25℃水温，不负重游泳10min，尾静脉取血20μL；小鼠休息20min后，再次尾静脉取血20μL；利用全血乳酸检测试剂盒说明书分别检测3次血中乳酸的含量，计算全血乳酸曲线下面积。公式为：全血乳酸曲线下面积＝5×(游泳前血乳酸值+3×游泳后0min血乳酸值+2×游泳后休息20min的血乳酸值)。
如图3所示，喂养28d后，各组小鼠无负重游泳1h后，高、中剂量组和阳性对照组的血乳酸含量分别比空白组减少了20.0％、12.4％和19.6％，具有显著差异(P＜0.05)，低剂量组和原样组的血乳酸含量与空白组的血乳酸含量相近。说明河豚鱼精巢蛋白肽可以有效地清除或延缓小鼠体内乳酸堆积，随着剂量的增加，对血乳酸的清除作用逐渐明显，呈现一定的量效关系。
4、河豚鱼精巢蛋白肽对小鼠血清尿素氮含量的影响
末次给药30min后，将小鼠毛发充分打湿，置于游泳箱中不负重游泳90min，取出，擦拭掉水，让小鼠休息60min；小鼠摘取眼球取血，常温放置2h后，1575g离心10min分离血清；解剖小鼠，分离得到小鼠肝脏，生理盐水漂洗后，吸干水分，精确称量100mg，利用尿素氮和肝糖原试剂盒说明书测定血清尿素氮和肝糖原的含量。
各组小鼠喂养28d后，血清尿素氮变化情况如图4所示。高、中、低剂量组、阳性组和原样组分别比空白组降低了37.30％、22.0％、13.7％、25.4％和10.1％，高剂量组血清尿素氮含量与空白组比具有极显著差异(P＜0.01)，低剂量组和原样组则差异不明显。结果表明河豚鱼精巢蛋白肽在一定剂量范围内，不同剂量组给药，能够减轻血清中尿素氮的含量，且随着剂量增加，作用越显著，提示河豚鱼精巢蛋白肽可以提高肾脏清除尿素氮的能力。
如图5所示，饲喂28天后，高、中、低剂量组肝糖原储备量明显增加，且呈现剂量效应。说明河豚鱼精巢蛋白肽被吸收进入体内有助于肌糖原的积累，增加肝糖原的储备量，减少血乳酸和血清尿素氮的产生量，证实河豚鱼精巢蛋白肽具有增加机体糖原储备，增强机体对运动负荷耐受能力的功效。
5、急性毒理实验
每组实验雌雄小鼠各10只，级别为ICR级别，分开饲养。适应一周后，小鼠禁食6h，但饮水不受限制。之后将河豚鱼精巢蛋白肽按剂量15g/kg给小鼠灌胃。小鼠灌胃完成后，观察其状态，一共观察14d，并解剖小鼠，观察小鼠内脏。
以15g/kg剂量给小鼠灌胃河豚鱼精巢蛋白肽，并持续观察14d，结果表明小鼠无死亡现象，体质量变化正常。小鼠的摄食、毛色、大小便、精神状态等行为活动均未发现异常。小鼠眼、鼻腔、口腔未发现分泌异常物质。观察后将小鼠进行解剖，肉眼观察内脏器官未见异常。该结果表明河豚鱼精巢蛋白肽对小鼠无毒。
实施例3：河豚精巢肽的序列鉴定
对实施例1所制备的河豚精巢肽进行RP-HPLC分离纯化，得到的五个不同分子量的洗脱组分(图6)，按照实施例2的方法对不同组分的抗疲劳活性进行检测，其中F3组分具有最好的抗疲劳活性。
通过LC-MS/MS对组分F3进行多肽序列分析，选择置信区间>96％的肽序列，鉴定出高活性肽段2条，其序列分别为GHPGTDL和AVGKEVA。
对序列为GHPGTDL和AVGKEVA的多肽进行合成，经过造模实验摸索，选择以0.4mmol/LH2O2为PC12细胞氧化损伤的造模浓度。功效评价实验结果表明，预孵育多肽GHDPTL、AHVKGAY的PC12细胞的存活率相比于实施例1中制备的多肽的模型组有显著提高，且细胞内ROS水平有明显降低，这就验证了两条多肽对H2O2诱导的细胞氧化损伤有很好的保护作用。
本发明所提供的河豚精巢肽GHPGTDL和AVGKEVA能清除体内自由基，可以提高体内超氧化物歧化酶的活性，进而提高机体的抗氧化能力，使机体更好地维持氧化与抗氧化系统的平衡；能增加机体糖原储备，增强机体对运动负荷耐受能力的功效；能够延长小鼠的负重游泳时间，减少血清尿素氮含量，提高乳酸脱氢酶水平和肝糖原含量，具有抗疲劳和抗氧化功效。为河豚精巢蛋白肽抗疲劳产品的研发提供了新思路。
Claims (4)
1.一种河豚鱼精巢蛋白肽，其特征在于，所述的河豚鱼精巢蛋白肽的氨基酸序列为SEQID NO:1或SEQ ID NO:2。
2.权利要求1所述的河豚鱼精巢蛋白肽在制备抗疲劳制品中的应用。
3.权利要求1所述的河豚鱼精巢蛋白肽在制备抗氧化的制品中的应用。
4.一种抗疲劳、抗氧化的制品，其特征在于，所述的制品中包含有权利要求1所述的河豚鱼精巢蛋白肽。
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