CN105063140A - 一种中华鳖胶原蛋白肽的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中华鳖胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)预处理；(2)酶解：将步骤(1)所得的胶原蛋白溶液，向其中加入木瓜蛋白酶进行酶解，将胶原蛋白转化成胶原蛋白肽；(3)灭酶：(4)离心：将步骤(3)的酶解液离心，取上清液；(5)膜分离：通过膜分离截留上清液中分子量小于10000Da的胶原蛋白肽组分；(6)浓缩；(7)冻干，同时还提供了胶原蛋白肽在具有免疫增强功能的药品、保健品、护肤美容用品的制备中的应用，与现有技术相比，本发明的优点在于采用一次性酶法结合膜分离技术提取中华鳖裙边胶原蛋白肽，用时仅为2～4h，相对一般研究的5-6h，有效降低了酶解时间，另外，分离得到小于10000Da的胶原蛋白肽，能显著地提高胶原蛋白肽产品的肽含量和纯度。

Description

一种中华鳖胶原蛋白肽的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种中华鳖胶原蛋白肽的制备方法及其应用，属于天然活性物质领域。

背景技术

海洋来源的多糖、蛋白聚糖和胶原蛋白肽是十分重要的天然海洋食品资源，常常具有显著的生活活性，如海参多糖、海藻多糖等均有许多的研究报道，证实其具有显著的生物活性。

中华鳖(Pelodiscussinensis)，又称甲鱼，具有重要的经济和药用价值，是我国传统的滋补佳品。《本草纲目》、《中国中医药药典》等历史著作中论其功能有治疗疾病和养生益寿的双重功效，中华鳖还含有较多的氨基酸、多肽和多糖，对人体的生理活性同样具有很重要的功能。然而，以中华鳖为原料，从中分离提取制备胶原蛋白肽的研究报道国内外尚很少见，迄今未见有从中分离提取具有免疫增强活性的胶原蛋白肽的报道。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是针对上述现有技术提供一种体外抗氧化能力强和免疫活性强的中华鳖胶原蛋白肽的制备方法。

本发明所要解决的另一个技术问题是针对上述现有技术提供一种通过上述制备方法所得的中华鳖胶原蛋白肽的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该中华鳖胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)预处理：将中华鳖的裙边洗净剪碎，经磷酸缓冲液处理除去杂蛋白及杂质，便于酶解；

(2)酶解：将步骤(1)所得的胶原蛋白溶液，向其中加入木瓜蛋白酶进行酶解，将胶原蛋白转化成胶原蛋白肽；

(3)灭酶：对步骤(2)所得到的酶解液进行灭酶，冷却；

(4)离心：将步骤(3)的酶解液离心，取上清液；

(5)膜分离：通过膜分离截留上清液中分子量小于10000Da的胶原蛋白肽组分；

(6)浓缩：将膜分离所得的胶原蛋白肽组分旋转蒸发浓缩，便于冻干；

(7)冻干：将浓缩后上清液冷冻干燥成粉末，即为成品，于干燥条件下贮存起来。

进一步地，所述步骤(1)中磷酸缓冲液的浓度为1.25％，该磷酸缓冲液的添加量为中华鳖的裙边质量的10～15倍。

在酶解的过程中对于的酶解条件得进行综合控制，才能保证胶原蛋白多肽的高提取率。作为优选，所述步骤(2)中所述木瓜蛋白酶的加酶量为3000～4000U/g、酶解温度为45～55℃、酶解时间为2～4h、pH值为7.0～8.5，所得胶原蛋白肽提取率为40～48.6％。

进一步地，所述步骤(3)中的灭酶步骤为：对步骤(2)所得到的酶解液放入50～55℃的沸水浴中加热灭酶，灭酶时间为10～15min。

进一步地，所述步骤(4)中酶解液在4000～10000r/min离心15～20min得上清液。

进一步地，所述步骤(5)中的具体操作为：依次采用0.22μm膜中进行过滤，再选用分子量10000Da的超滤膜截留离心后的上清液，分离得到小于10000Da的胶原蛋白肽组分。

运用两次膜分离浓缩胶原蛋白肽，以提高胶原蛋白肽产品的肽含量和纯度，去除糖类、大分子蛋白等杂质，产品的肽含量可达24.28％。

进一步地，所述步骤(7)中分离得到的胶原蛋白肽组分于50℃旋转蒸发20～30min，并于-80至-20℃冷冻干燥40～48h即得中华鳖胶原蛋白肽产品。

本发明还提供一种中华鳖胶原蛋白肽的制备方法在具有免疫增强功能的药品、保健品、护肤美容用品的制备中的应用。

为此本发明通过以下实验进一步说明中华鳖胶原蛋白肽的体外抗氧化性及免疫增强功能。

1.体外抗氧化性研究

通过铁离子还原体系和具有代表性的O2-·、DPPH·、·OH三种自由基体系的实验，研究胶原蛋白肽体外对自由基的清除效果。以胶原蛋白肽的活性氧和自由基清除能力作为抗氧化性的指标进行测定。以清除活性氧(O2-·、·OH、H₂O₂)及有机自由基·DPPH能力作为评价指标。

2.体内免疫活性研究

通过小鼠的养殖实验研究中华鳖胶原蛋白肽的免疫活性，主要从免疫器官指数的测定、肝脏抗氧化指标的测定和Cyp1a1、HSP70的mRNA表达的测定三个方面进行研究。

与现有技术相比，本发明的优点在于采用一次性酶法结合膜分离技术提取中华鳖裙边胶原蛋白肽，用时仅为2～4h，相对一般研究的5-6h，有效降低了酶解时间，另外，胶原蛋白多肽的分子量决定了其生物活性，分子量较大的多肽片段生物活性较低，运用两次膜分离浓缩胶原蛋白肽，以分离得到小于10000Da的胶原蛋白肽，能显著地提高胶原蛋白肽产品的肽含量和纯度，同时还解决胶原蛋白肽的低生物活性问题；最后将分离出来的胶原蛋白肽对小鼠去毒相关基因的mRNA表达研究及体外抗氧化性的研究表明，与正常组相比，胶原肽对小鼠脾脏Cyp1a1、HSP70基因的表达具有促进作用，且在经膜分离前和经膜分离后胶原蛋白肽的清除率比较中，经两次膜分离后的胶原蛋白肽，其清除羟基自由基的能力最强，并且具有一定的剂量效应，因此推测胶原蛋白肽具有较强的体外抗氧化性，同时也能有效地调节小鼠的细胞免疫和体液免疫功能，说明鳖源胶原蛋白肽可用于开发具有免疫增强功能的药品、保健品、护肤美容用品等。

附图说明

图1为本发明实施例2中的中华鳖胶原蛋白肽清除羟基自由基的能力的示意图(其中，为VC，为超滤后样品，为超滤前样品)；

图2为本发明实施例3中的中华鳖胶原蛋白肽与Vc抗氧化的能力比较示意图(其中，为VC，为超滤后样品，为超滤前样品)；

图3为本发明实施例3中的中华鳖胶原蛋白肽过滤前和过滤后抗氧化的能力比较示意图(其中，为超滤后样品，为超滤前样品)；

图4为本发明实施例4中的中华鳖胶原蛋白肽清除有机自由基·DPPH的能力的示意图(其中，为VC，为超滤后样品，为超滤前样品)；

图5为本发明实施例7中的体内去毒相关基因的mRNA表达的电泳图。

具体实施方式

以下通过结合附图及实施例对本发明作进一步说明。

实施例1中华鳖胶原蛋白肽的制备

一种中华鳖胶原蛋白肽的制备方法，包括如下步骤：

(1)预处理：将中华鳖的裙边洗净剪碎，经浓度为1.25％的磷酸缓冲液处理除去杂蛋白及杂质，便于酶解，其中磷酸缓冲液的添加量为中华鳖的裙边质量的10倍；

(2)酶解：将步骤(1)所得的胶原蛋白溶液，向其中加入4000U/g的木瓜蛋白酶，在温度55℃和pH值7.0的条件下酶解4h，胶原蛋白肽的提取率为48％；

(3)灭酶：在55℃的沸水浴中加热10min灭酶；

(4)离心：在4000r/min离心15～20min得上清液。取上清液；

(5)膜分离：依次采用0.22um膜中进行过滤，再选用分子量10000Da的超滤膜截留离心后的上清液，分离得到小于10000Da的胶原蛋白肽组分；

(6)浓缩：将膜分离所得的胶原蛋白肽组分于50℃旋转蒸发20min浓缩；

(7)冻干：将浓缩后上清液于-20℃冷冻干燥40h即得鳖源胶原蛋白肽产品。

实施例2中华鳖胶原蛋白肽清除羟基自由基的能力

羟基自由基清除能力测定方法为：在反应体系中加入2.5mL，9mmol/LFeSO₄溶液和2.5mL，9mmol/L水杨酸—乙醇溶液，再加入2、4、6、8、10mg/mL不同浓度的超滤前的胶原蛋白肽和超滤后的胶原蛋白肽2.5mL，超滤前的胶原蛋白肽和超滤后的胶原蛋白肽均溶于pH7.4磷酸盐缓冲液，然后加入2.5mL，8.8mmol/LH₂O₂。用维生素Vc做阳性对照，对照液以2.5mL蒸馏水替代同体积的磷酸盐缓冲液，37℃下保温20min，以蒸馏水为参比液，计算：清除率(％)＝[A₀-A_x]×100％/A₀，A₀为空白对照液的吸光值，A_x为加入水解液后的吸光值。

结果如图1所示，Vc清除羟基自由基的能力最强为85％以上，在超滤前和超滤后胶原蛋白肽的清除率比较中，超滤后的胶原蛋白肽清除率介于70％～80％之间，超滤前的胶原蛋白肽清除率介于60％～75％之间，说明中华鳖胶原蛋白具有清除羟基自由基的能力，且超滤后的胶原蛋白肽清除率相对较高，随着样品浓度升高，清除率均有所上升。

实施例3中华鳖胶原蛋白肽抗氧化的能力

取2、4、6、8、10mg/mL不同浓度的超滤前的胶原蛋白肽和超滤后的胶原蛋白肽1mL，超滤前的胶原蛋白肽和超滤后的胶原蛋白肽采用加入1.25mL，0.2mol/L，pH7.4磷酸盐缓冲液的方式溶解；再加入1mL，1％的铁氰化钾溶液，混匀，置于50℃水浴中反应20min，再加入1.25mL，10％三氯乙酸，混匀，以3000r/min离心10min。取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL，0.1％的FeCl3溶液。混匀静置10min，体系将由黄变绿，以同等浓度Vc为对照试验，以等离子水代替样品调零，在700nm波长处比色。

由于抗氧化剂(还原剂)是通过自身的还原作用，给出电子而清除自由基的，还原能力越强，抗氧化性越强。实验中，样品的抗氧化剂能使铁氰化钾的三价铁还原成二价铁(亚铁氰化钾)，二价铁(亚铁氰化钾)进一步在和三氯化铁的反应下生成在700nm处有最大吸光度的普鲁士蓝(Fe₄[Fe(CN)₆]₃，因此测定700nm处的高低可以间接反映抗氧化剂的还能能力大小，吸光度越大，还原能力越强。

结果如图2和3所示，Vc的吸光度值最大，在超滤前和超滤后胶原蛋白肽的吸光度值的比较中，超滤后的胶原蛋白肽的吸光度值介于0.04～0.14之间，超滤前的胶原蛋白肽的吸光度值介于0.04～0.10之间，说明中华鳖胶原蛋白具有一定的还原能力，且超滤后的胶原蛋白肽还原能力相对较高，随着样品浓度升高，还原能力均有所上升。

实施例4中华鳖胶原蛋白肽清除有机自由基·DPPH的能力

方法如同实施例1，结果如图4所示，Vc清除有机自由基·DPPH最强为80％以上，在超滤前和超滤后胶原蛋白肽的清除率比较中，超滤后的胶原蛋白肽清除率介于20％～40％之间，超滤前的胶原蛋白肽清除率介于0％～20％之间，说明中华鳖胶原蛋白具有清除有机自由基·DPPH的能力，且超滤后的胶原蛋白肽清除率相对较高，随着样品浓度升高，清除率均有所上升。

实施例5中华鳖胶原蛋白肽的体内免疫器官指数的测定

方法：试验采用雄性纯种ICR品系小鼠60只，8周大小，体重20g左右，随即分为5组，分别为A低剂量组(25mg/kg/d)、B中剂组(50mg/kg/d)、C高剂量组(100mg/kg/d)、D阳性对照组(100mg/kg/d)、E正常对照组(生理盐水组)，每组12只，各置于2只笼子里饲养。中华鳖胶原蛋白肽溶于pH7.4磷酸盐缓冲液溶解，灌胃给予小鼠，给药体积为0.2mL。自由采食和饮水，小鼠饲养笼中给予充足的饲料和水，每笼饲养6只，试验前每只小鼠称重并标记编号。各试验组每日灌胃1次，连续15天，正常对照组和阳性对照组分别灌胃给予同样量的生理盐水和维生素E，最后一次给药24h后，所有小鼠称重后宰杀解剖取样。由于脾脏和胸腺是动物体内重要的免疫器官，脾脏和胸腺的质量在一定程度上能反映其免疫能力的强弱。因此，将处死的小鼠摘取胸腺、脾脏，称重，记录数据并用公式计算胸腺指数和脾脏指数：脏器指数＝脏器重(mg)/体重(g)。

结果由表1可知，与正常对照组进行比较，胶原蛋白肽可有效的提升脾脏和胸腺指数。综上可知胶原蛋白肽对小鼠的细胞免疫和体液免疫可起到有效的调节作用。

表1胶原蛋白肽对小鼠免疫脏器指数的影响()

实施例6中华鳖胶原蛋白肽的体内肝脏抗氧化指标的测定

细胞内的抗氧化酶能够通过自身作用形成抵御体内自由过量的反应，SOD存在是为了抵抗氧化应激，催化超氧转变为H₂O₂，而MDA的形成常用于表示脂质过氧化作用的指数。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及丙二醛(MDA)等的含量按照试剂盒说明书进行，探讨胶原蛋白肽在体内的抗氧化作用，其组别的设置如同实施例5。

结果如表2所示，

表2胶原蛋白肽对小鼠肝组织的抗氧化指标影响()

由表2可知，中华鳖裙边胶原蛋白肽大大提高肝组织中SOD活性，中华鳖裙边胶原蛋白肽剂量为50mg/kg/d时，肝组织的抗氧化酶SOD的含量最高，较正常对照组增加18.1％。

由表2可知，阳性对照组和试验组相比正常对照组的小鼠脂质过氧化产物减少。中华鳖裙边胶原蛋白肽剂量为100mg/kg/d时相比正常对照组，肝组织的MDA含量降低，显著抑制MDA的形成，可以看出高剂量组能减小细胞的损伤，增强小鼠的免疫功能，而低剂量组和中剂量组都不能有效的增强小鼠的免疫功能。另外，中华鳖裙边胶原蛋白肽大大提高肝组织中GSH活性，当多肽剂量为25mg/kg/d时，肝组织中的GSH含量最高，较阳性对照组增加67.9％。因此，不同剂量的胶原多肽均显著增加GSH水平和SOD水平，降低MDA水平。说明中华鳖裙边胶原蛋白肽能有效地增强小鼠的免疫功能。

实施例7中华鳖胶原蛋白肽的体内去毒相关基因的mRNA表达的测定

去毒相关基因在生物有机体内毒物代谢过程十分重要。I相去毒酶与II相去毒酶等一系列去毒酶的研究比较广泛，其对清除机体内的毒害物质发挥着十分重要的作用。I相去毒酶主要是细胞色素P450(cytochromeP450，CYP)对许多内源性和外源性的化学物质，特别是对环境有毒化学物质存在氧化代谢作用，能够将脂溶性有机污染物转化为水溶性代谢物，并排除体外，从而达到代谢解毒的作用。热休克蛋白70(HeatShockProtein70，HSP70)也由于能提高机体防御高温、化学毒物等不良因素损伤作用的能力而受到人们的广泛关注。水产动物中鱼虾贝研究较为广泛，目前尚无特种经济动物如中华鳖的研究。中华鳖是我国传统的营养滋补佳品，具有很高的营养价值和保健功效。这些去毒基因在中华鳖上尚未报道。获得基因，并研究去毒相关基因的结构、功能、表达调控，可以为今后定向筛选高食用安全保障的甲鱼产品奠定基础。

具体的方法如下：

一、采用DNA的酚抽提和乙醇沉淀法提取中华鳖裙边的cDNA

(1)取0.025g中华鳖裙边样品，放入1.5mL离心管中。加入100mLSTE裂解缓冲液，在冰上用眼科小剪刀剪碎，再补加400mLSTE裂解缓冲液，50μLSDS(10％)，5μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后放入56℃消化4h，期间1h混匀一次。直至裂解液澄清；

(2)加入酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)500mL，抽提10min，在12000rpm条件下离心10min；

(3)取离心后的上清液，重复上述步骤一次，直至水相与有机相间无蛋白质层；

(4)取离心后的上清液加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)500μL，抽提10min，12000rpm离心10min；

(5)取上清液加入50μLNaAc(3M)，1000μL冷无水乙醇缓慢摇匀，可见丝状DNA析出。放入-20℃冰箱10min，使DNA充分析出。13000rpm离心10min；

(6)小心的弃去上清液，用100070％乙醇洗涤沉淀，10000rpm下离心5min，重复一遍；

(7)吸出乙醇，通风干燥3-5min；

(8)加入50μL灭菌双蒸水，轻弹至DNA全部溶解，放在-20℃冰箱中保存备用；

(9)提取好的DNA需要用1％琼脂糖电泳检测其纯度；

(10)采用微量核酸测定仪检测样本DNA的浓度和纯度，并稀释到100ng/μL，-20℃保存。

二、对中华鳖裙边的Cyp1a1、HSP70进行PCR扩增

(1)具体的引物由PrimerPremier软件设计。根据GenBank中已知小鼠Hsp70、Cyp1a1及β-actin基因序列，设计上下游引物。

Hsp70上游：5′GGTGCTGACGAAGATAAAGGAG3′；

Hsp70下游：5′CTCTTGAACTCCTCCACGAAGT3′；

Cyp1a1上游：5′CAGCATCCTCTTGCTACTTGG3′；

Cyp1a1下游：5′AAGGCATCCAGGGAAGAGTTA3′；

β-actin上游：5′CCCATCTACGAGGGCTAT3′；

β-actin下游：5′AAGAAGGAAGGCTGGAAA3′；

其中，PCR反应体系为：a.根据以下配制PCR反应体系，总体积为25μl：Mixer(包括Tap酶、dNTP溶液、氯化镁、UNG酶)12.5μl；上游引物1μl；下游引物1μl；模板(样品的cDNA)0.5μl；无菌水补足反应体系，使总体积为25μl，可参见表3；b.小鼠的Cyp1a1、HSP70基因分管扩增指数期循环数的确定：PCR管中分别加入Cyp1a1、和HSP70引物，使Cyp1a1、HSP70基因分管扩增。PCR反应程序为：94℃预变性2min，30个循环：94℃变性30s→55℃退火30s→72℃延伸30s。最后72℃再延伸10min，运行结束后，保存PCR产物，可参见表4；

表3PCR扩增体系

表4PCR扩增条件

c.将产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，电泳于凝胶成像系统分析条带的净灰度。

结果如图5所示：其中，M为DNA分子量标准DL250和DL500，而泳道1、4、7、10、13为内参β-actin，泳道2、5、8、11、14对应低剂量组A(25mg/kg/d)、中剂组B(50mg/kg/d)、高剂量组C(100mg/kg/d)、阳性对照组D(100mg/kg/d)、正常对照组E(生理盐水组)对Cyp1a1的检测结果，而泳道2、5、8、11、14对应低剂量组A(25mg/kg/d)、中剂组B(50mg/kg/d)、高剂量组C(100mg/kg/d)、阳性对照组D(100mg/kg/d)、正常对照组E(生理盐水组)对Hsp70的检测结果，从电泳图像可见在250bp和500bp处有产物条带，无杂带，说明反应体系良好，目的片段被正确扩增。

实施例8中华鳖胶原蛋白肽的小鼠脾脏组织mRNA的表达水平

脾脏和胸腺是动物体内重要的免疫器官，脾脏和胸腺的质量在一定程度上能反映其免疫能力的强弱。本实验得出给小鼠饲喂高剂量的鳖源胶原蛋白肽可有效的提升脾脏和胸腺指数。结果如表5所示，以对应图5的扩增结果：

表5灌胃胶原蛋白肽小鼠脾脏组织mRNA的表达水平

由表5得，Cyp1a1mRNA的表达水平，顺序大小C＞A＞B＞E＞D，可见小鼠高剂量组与对照组相比，高剂量组的胶原蛋白肽小鼠脾脏中Cyp1a1很高，是对照组的将近2倍，说明胶原蛋白肽对小鼠脾脏CYP1A1基因的表达具有促进作用，能有效的提高小鼠脾脏的去毒能力，增强小鼠对毒素免疫能力。HSP70mRNA的表达水平，顺序大小C＞A＞D＞B＞E，可见小鼠高剂量组与对照组相比，高剂量组的胶原蛋白肽小鼠脾脏中HSP70很高，是对照组的近2.5倍，说明胶原蛋白肽可以促进小鼠脾脏HSP70基因的mRNA表达。

Claims (8)

1.一种中华鳖胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)预处理：将中华鳖的裙边洗净剪碎，经磷酸缓冲液处理除去杂蛋白及杂质，便于酶解；

(2)酶解：将步骤(1)所得的胶原蛋白溶液，向其中加入木瓜蛋白酶进行酶解，将胶原蛋白转化成胶原蛋白肽；

(3)灭酶：对步骤(2)所得到的酶解液进行灭酶，冷却；

(4)离心：将步骤(3)的酶解液离心，取上清液；

(5)膜分离：通过膜分离截留上清液中分子量小于10000Da的胶原蛋白肽组分；

(6)浓缩：将膜分离所得的胶原蛋白肽组分旋转蒸发浓缩，便于冻干；

(7)冻干：将浓缩后上清液冷冻干燥成粉末，即为成品，于干燥条件下贮存起来。

2.根据权利要求1所示的中华鳖胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中磷酸缓冲液的浓度为1.25％，该磷酸缓冲液的添加量为中华鳖的裙边质量的10～15倍。

3.根据权利要求1所示的中华鳖胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中所述木瓜蛋白酶的加酶量为3000～4000U/g、酶解温度为45～55℃、酶解时间为2～4h、pH值为7.0～8.5，所得胶原蛋白肽提取率为40～48.6％。

4.根据权利要求1所示的中华鳖胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的灭酶步骤为：对步骤(2)所得到的酶解液放入50～55℃的沸水浴中加热灭酶，灭酶时间为10～15min。

5.根据权利要求1所示的中华鳖胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中酶解液在4000～10000r/min离心15～20min得上清液。

6.根据权利要求1所示的中华鳖胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中的具体操作为：依次采用0.22μm膜中进行过滤，再选用分子量10000Da的超滤膜截留离心后的上清液，分离得到小于10000Da的胶原蛋白肽组分。

7.根据权利要求1所示的中华鳖胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(7)中分离得到的胶原蛋白肽组分于50℃旋转蒸发20-30min，并于-80至-20℃冷冻干燥40～48h即得鳖源胶原蛋白肽产品。

8.根据权利要求1～7任意一项权利要求所述的中华鳖胶原蛋白肽在具有免疫增强功能的药品、保健品、护肤美容用品的制备中的应用。