CN110760553A - 一种具有修复作用的安康鱼肉多肽的制备及应用 - Google Patents

一种具有修复作用的安康鱼肉多肽的制备及应用 Download PDF

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CN110760553A CN201910960027.8A CN201910960027A CN110760553A CN 110760553 A CN110760553 A CN 110760553A CN 201910960027 A CN201910960027 A CN 201910960027A CN 110760553 A CN110760553 A CN 110760553A
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Abstract

本发明涉及生物技术提取领域，针对现有技术的发明物分子活性不足及药物修复成分针对性较弱的问题，公开了一种具有修复作用的安康鱼肉多肽的制备及应用，包括以下步骤：安康鱼肉预处理；酶解；过滤得澄清液；分离纯化；除杂除菌；多肽分级。提供一种对非酒精性脂肪肝具有修复作用的安康鱼肉多肽的提取工艺及应用效果，可明显降低非酒精性脂肪肝模型（NAFLD）血清中ALT和AST活性；安康鱼肉多肽提取率高、提取纯度高，对NAFLD具有优良的修复作用，生物活性稳定，可保持时间较长；能有针对性的对非酒精性脂肪肝进行修复，修复效果较好并且该提取工艺的可控性好，易于实际大规模工业化量产。

Description

一种具有修复作用的安康鱼肉多肽的制备及应用
技术领域
本发明涉及生物技术提取领域，尤其是涉及一种具有修复作用的安康鱼肉多肽的制备及应用。
背景技术
非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是以肝细胞脂肪变性和脂肪堆积为主要特征的病理综合征，目前治疗的方法主要采取减肥治疗、降脂治疗和血管紧张素转换酶抑制剂等保守治疗，但保守治疗目前尚缺乏特效方法，效果欠佳。近年来，我国的研究学者对从海洋动物中提取生物活性物质对肝损伤进行保护作用作了大量的研究。
安康鱼又名蛤蟆鱼、结巴鱼等，为近海底层鱼类，分布于北太平洋西部，在我国沿海海域均有出产，具有高蛋白，低脂肪，矿物质含量丰富和含有多不饱和脂肪酸的特点，对预防肝脏等疾病有着很好的功效。
专利号CN201910189173.5，专利名称为“治疗非酒精性脂肪肝祛湿活血方”，本发明属于药品加工领域，具体涉及治疗非酒精性脂肪肝祛湿活血方，主要采用荷叶、茯苓、白术、决明子、薏苡仁、泽泻、猪苓、绞股蓝、法半夏、虎杖、茵陈、黄芪、甘草、陈皮、柴胡、赤芍、莪术、丹参、酒大黄作为治疗非酒精性脂肪肝祛湿活血方的主要成分，荷叶、茯苓、白术健脾渗湿；决明子、薏苡仁、泽泻疏肝以利于祛湿活血。组方以祛湿活血为主线,佐以疏肝、清热之品，舒畅肝络，清解郁热。该平肝健脾，利湿化痰，导滞活血，具有调整血脂，促进肝细胞修复之功，治疗非酒精性脂肪肝效果好，无毒副作用。
其不足之处在于，上述发明物分子活性不足，药物修复成分针对性较弱，无法准确的对非酒精性脂肪肝进行有针对性的修复。
发明内容
本发明是为了克服现有技术的发明物分子活性不足及药物修复成分针对性较弱的问题，提供一种具有修复作用的安康鱼肉多肽的制备及用，安康鱼肉多肽提取率高、提取纯度高、能有针对性的对非酒精性脂肪肝进行修复，修复效果较好。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种对非酒精性脂肪肝具有修复作用的安康鱼肉多肽的制备，包括以下步骤：(1)、安康鱼肉预处理：将安康鱼进行解冻清洗后绞碎，在料液比为1:4-6(m/v)，温度为48-52℃的条件下，用94-96％的乙醇水浴脱脂2-2.2h；脱脂后将上清液倒掉，用纯水将沉淀洗净，将脱脂鱼肉在2-6℃、11900-12000r/min条件下离心15-20min，收集沉淀，放入-18—-20℃冷冻备用；
(2)、酶解：将鱼肉加到含有中性蛋白酶的酶解液中进行酶解；其中，中性蛋白酶的浓度为0.05-0.25wt％，酶解液质量为鱼肉质量的2-4倍，酶解温度为30-45℃，酶解液pH至控制在6.5-8.5，酶解时间为5-5.4h；
(3)、过滤得澄清液：向酶解液中添加质量为酶解液1-2wt％的改性活性炭，并将酶解液加热到70-80℃，脱色30-50min；将脱色后的酶解液转移至板框过滤池内进行过滤，取澄清液；
(4)、分离纯化：将澄清液鼓气起泡，并收集泡沫液，在鼓气的同时注水；鼓气速率为3-4L/min，注水速率为0.2-0.3L/min，澄清液温度保持在25-35℃；待收集的泡沫液灭泡后，对泡沫液进行重金属分离；向重金属分离后的泡沫液中添加质量为泡沫液1-2％的磁性亲和微球并分散均匀，静置亲和吸附50-70min后利用磁场使磁性亲和微球聚集；分离出磁性亲和微球后，用pH值为7-7.2的Tris-HCl缓冲液对磁性亲和微球进行洗脱，再次利用磁场分离出磁性亲和微球后，得到洗脱液，75-85℃下储存备用；
(5)、除杂除菌：将洗脱液通过二级0.22微米膜过滤除杂除菌；其中膜过滤温度小于45℃，一级过滤压力小于0.25MPa，二级过滤压力小于0.4MPa；
(6)、多肽分级：采用超滤膜或纳滤膜对膜过滤后的浓缩液按分子量进行分离，得到目标分子量的安康鱼肉多肽。
作为优选，所述改性活性炭的制备步骤为：
a、预处理：对果壳活性炭，先用0.5-0.8mol/L稀硝酸于60-65℃浸泡活性炭1.8-2.2h，将样品过滤后再缓慢加入0.8-1mol/L的氢氟酸，于60-70℃浸泡8-10h后用去离子水洗涤至中性，后加入去离子水98-100℃煮沸1.8-2.2h，之后用纯水冲洗2-3次后，置于98-102℃烘箱中烘干，取出后进行密封处理备用；
b、改性：称取预处理后的果壳活性炭，分别用10-15％的碳酸氢钠浸泡并磁力搅拌1.8-2.2h，再用去离子水将上述果壳活性炭冲洗至pH值达到6.8-7为止，然后在98-102℃恒温干燥箱中干燥22-24h，即可得到改性后的果壳活性炭。
碳酸氢钠改性后，活性炭表面形貌及结构发生显著改变。碱性增强后沟槽遭到更严重的腐蚀，结构几乎消失。而孔洞则呈均匀分布，孔径明显减小，内凹加深，重新获得较为完整的沟槽结构，孔洞分布较为均匀，孔洞尺寸则进一步变小，进而提升活性炭的比表面积，即提升果壳活性炭的色素清除能力。
作为优选，所述果壳为杏仁果壳。
木质活性炭极性较强，在吸附色素的同时会吸收大分子量多肽，所以选用杏仁果壳活性炭，杏仁果壳活性炭极性较小，在完全除去色素的同时能够避免大分子链的吸收，是极好的色素清除剂。
作为优选，步骤b所述的果壳活性炭与碳酸氢钠的质量比为1:3-4。
作为优选，所述磁性亲和微球的制备步骤如下：
I、生成磁性微球：将海藻酸钠、聚环氧乙烷、脱乙酰甲壳素、正庚烷、乙酸和纯水按质量比2-3:1-1.2:2-2.5:0.5-0.8:3-5:100混合溶解，搅拌均匀后制得混合液A；向混合液A中添加混合液A质量4-6％的四氧化三铁磁颗粒并分散均匀，得到混合液B；对混合液B进行超声波分散，同时向混合液B中匀速滴加混合液B质量40-60％的乳化液，得到混合液C；先后向混合液C中添加混合液C质量0.1-0.2％的97-98wt％的戊二醛和混合液C质量0.5-0.8倍的2.5-3.5wt％的溴化钾溶液，充分搅拌，静置1-1.2h，生成磁性微球；
II、聚集磁性微球：利用磁场对液体中磁性微球进行聚集，取出磁性微球后进行清洗、干燥。
作为优选，步骤I所述乳化液为体积占比为30-35％的双乙酰酒石酸单甘油酯-80无水乙醇混合液，乳化液在5-10min内滴加完毕。
作为优选，步骤(6)所述的目标分子量为1600-4000Da。
所述一种对非酒精性脂肪肝具有修复作用的安康鱼肉多肽在制备修复非酒精性脂肪肝药物中的应用。
作为优选，一种对非酒精性脂肪肝具有修复作用的安康鱼肉多肽抑制率为85.3％，显示脂肪肝修复活性。
作为优选，所述药物为口服药物。
因此，本发明具有如下有益效果：
(1)提供一种对非酒精性脂肪肝具有修复作用的安康鱼肉多肽的提取工艺及应用效果，可明显降低非酒精性脂肪肝模型(NAFLD)血清中ALT和AST活性；
(2)安康鱼肉多肽提取率高、提取纯度高，对NAFLD具有优良的修复作用，生物活性稳定，可保持时间较长；
(3)能有针对性的对非酒精性脂肪肝进行修复，修复效果较好并且该提取工艺的可控性好，易于实际大规模工业化量产。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的描述。
实施1
一种对非酒精性脂肪肝具有修复作用的安康鱼肉多肽的制备，包括以下步骤：
(1)、安康鱼肉预处理：将安康鱼进行解冻清洗后用绞肉机绞碎，在料液比为1:5(m/v)，温度为50℃的条件下，用95％的乙醇水浴脱脂2.1h；脱脂后将上清液倒掉，用纯水将沉淀洗净，将脱脂鱼肉在4℃、11950r/min条件下离心18min，收集沉淀，放入-19℃冷冻备用；
(2)、酶解：将鱼肉加到含有中性蛋白酶的酶解液中进行酶解；其中，中性蛋白酶的浓度为0.15wt％，酶解液质量为鱼肉质量的3倍，酶解温度为38℃，酶解液pH至控制在7.5，酶解时间为5.2h；
(3)、过滤得澄清液：向酶解液中添加质量为酶解液1.5wt％的改性活性炭，并将酶解液加热到75℃，脱色40min；将脱色后的酶解液转移至板框过滤池内进行过滤，取澄清液；
所述改性活性炭的制备步骤为：
a、预处理：对果壳活性炭，先用0.7mol/L稀硝酸于63℃浸泡活性炭2h，将样品过滤后再缓慢加入0.9mol/L的氢氟酸，于65℃浸泡9h后用去离子水洗涤至中性，后加入去离子水99℃煮沸2h，之后用纯水冲洗3次后，置于100℃烘箱中烘干，取出后进行密封处理备用；b、改性：称取预处理后的果壳活性炭，分别用13％的碳酸氢钠浸泡并磁力搅拌2h，再用去离子水将上述果壳活性炭冲洗至pH值达到6.9为止，然后在100℃恒温干燥箱中干燥23h，即可得到改性后的果壳活性炭，所述果壳为杏仁果壳，步骤b所述的果壳活性炭与碳酸氢钠的质量比为1:3.5。
(4)、分离纯化：将澄清液转移至泡沫分离柱中进行鼓气起泡，并收集泡沫液，，在鼓气的同时向泡沫分离柱中注水；鼓气速率为3.5L/min，注水速率为0.25L/min，泡沫分离柱中液体的装载高度与泡沫分离柱内径比为9:1，澄清液温度保持在30℃；待收集的泡沫液灭泡后，对泡沫液进行重金属分离；向重金属分离后的泡沫液中添加质量为泡沫液1.5％的磁性亲和微球并分散均匀，静置亲和吸附60min后利用磁场使磁性亲和微球聚集；分离出磁性亲和微球后，用pH值为7.1的Tris-HCl缓冲液对磁性亲和微球进行洗脱，再次利用磁场分离出磁性亲和微球后，得到洗脱液，80℃下储存备用；
所述磁性亲和微球的制备步骤如下：
I、生成磁性微球：将海藻酸钠、聚环氧乙烷、脱乙酰甲壳素、正庚烷、乙酸和纯水按质量比2.5:1.1:2.3:0.7:4:100在容器中混合溶解，搅拌均匀后制得混合液A；向混合液A中添加混合液A质量5％的四氧化三铁磁颗粒并分散均匀，得到混合液B；对混合液B进行超声波分散，同时向混合液B中匀速滴加混合液B质量50％的乳化液，得到混合液C；先后向混合液C中添加混合液C质量0.15％的97.5wt％的戊二醛和混合液C质量0.7倍的3wt％的溴化钾溶液，充分搅拌，静置1.1h，生成磁性微球；步骤I所述乳化液为体积占比为33％的双乙酰酒石酸单甘油酯-80无水乙醇混合液，乳化液在8min内滴加完毕。
II、聚集磁性微球：利用磁场对液体中磁性微球进行聚集，取出磁性微球后进行清洗、干燥。
(5)、除杂除菌：将洗脱液通过二级0.22微米膜过滤除杂除菌；其中膜过滤温度为38℃，一级过滤压力为0.2MPa，二级过滤压力为0.3MPa；
(6)、多肽分级：采用超滤膜或纳滤膜对膜过滤后的浓缩液按分子量进行分离，得到目标分子量的为1600-4000Da的安康鱼肉多肽。
上述步骤所提取的安康鱼多肽在口服药物中的应用：
1、将24只成年雄性(ICR)小鼠在饲养环境中适应性饲养72h后随机分为2组，正常组小鼠(6只)喂基础饲料，其余小鼠(18只)喂高脂饲料。采用高脂饲料诱导建立小鼠NAFLD模型，通过在基础饲料中添加猪油，胆酸钠等，其中胆酸钠的能够促进脂质吸收。15日后，从正常组与高脂饲料模型组各取两只小鼠，处死，取肝脏，包埋后HE染色进行病理学诊断，证实造模成功。造模成功后，将模型组小鼠16只再随机分为4组，每组4只，分别为模型组、洛伐他汀阳性药物对照组、低剂量组、高剂量组；将各组小鼠灌胃给药，阳性药物组每只小鼠剂量为8mg/kg，安康鱼肉多肽低、高剂量组分别为200mg/kg、400mg/kg，正常组与模型组都给予等量的纯净水，洛伐他汀溶液配置：4.5mg，加入6mL纯水中，充分混匀，制备悬浮液。每天观察动物样貌、行为活动等，每隔两天测量其体重并记录。给药30日，最后一天灌胃后禁食但不禁水24h，摘眼球取血，4℃条件下4000r/min，离心10min取血清，用于生化测定；观察小鼠体重、行为、精神状态、饮食、饮水等情况。在灌胃给药30天后，正常组小鼠生长良好，精神状态正常。正常组小鼠活动度好，生长正常，精神状态良好。模型组小鼠精神萎靡，易嗜睡，活动减少，反应迟钝。安康鱼肉多肽低剂量组精神状态比较差，反应稍迟钝，但高剂量组活动量增多，精神状态也有所改善。阳性药物组小鼠与模型组小鼠比较，活动量有所增加，对外界环境也有反应。小鼠体重变化如表1，与正常组相比，高脂饲料模型组体重显著增加，增幅为93.61％(P﹤0.05)；阳性药物组体重增加与正常组相差不大，增幅为66.22％；安康鱼肉多肽剂量组体重增幅和模型组相比有所下降，且呈现剂量依赖性，其中低剂量组增幅为68.2％，高剂量组增幅为68.48％(P﹤0.05)，而高剂量组与阳性药物组小鼠体重增加差别不大；
表1各组小鼠体重(n＝4)
Figure BDA0002228610070000051
Figure BDA0002228610070000061
2、将小鼠眼底取血颈椎脱臼处死，解剖，观察内脏形态后取肝脏，用4℃预冷生理盐水冲净表面浮血，滤纸拭干，称重，观察小鼠肝脏的形态。肉眼观察各组小鼠内脏器官变化。正常组小鼠肝脏暗红，内脏器官无异物；模型组小鼠腹腔脂肪堆积，肝脏肥大并且颜色较浅；阳性药物组与安康鱼肉多肽各剂量组与模型组相比腹部脂肪堆积有所减少，肝脏颜色较深，其中阳性药物组与高剂量组与正常组肝脏颜色差别不大；计算小鼠肝脏各指数：肝脏指数(％)＝小鼠肝脏重量(g)/小鼠体重(g)×100％。各组小鼠肝指数如表2，模型组与正常组相比，肝指数显著增加(P﹤0.05)。各组药物组与模型组相比，肝指数都下降，其中阳性药物组下降最多，具有显著性差异(P﹤0.05)；高剂量组肝指数下降的幅度比低剂量组幅度大；
表2各组小鼠肝重指数(`x±s，n＝4)
Figure BDA0002228610070000062
注：a与正常组比较，P﹤0.05；b与模型组比较，P﹤0.05；
3、摘眼球取血，4℃条件下4000r/min，离心10min取血清，进行HLD，TG，DLD，AST，ALT指标的测定。各组小鼠血清ALT、AST活性如表3，同正常组比较，模型组ALT、AST活性显著升高(P﹤0.05)，分别达到35.86U/L和55.01U/L，是正常组2.64倍和1.93倍；阳性药物组ALT、AST活性下降，与模型组相比，呈现显著性差异(P﹤0.05)；安康鱼肉多肽各剂量组ALT、AST活性与模型组相比显著降低(P﹤0.05)，其中高剂量组效果更好，ALT、AST活性降幅分别达到37.03％和22.76％，与阳性药物组差别不大。说明安康鱼肉多肽可降低NAFLD小鼠血清ALT、AST活性，且随着安康鱼肉多肽浓度的增加，呈现明显的剂量相关性；各组小鼠血清HLD、DLD、TG含量如表3，同正常组比较，模型组DLD、TG含量显著升高，分别达到10.23mmol/L和14.35mmol/L，是正常组的4.16倍和3.03倍；阳性药物组DLD、TG含量降低，与模型组相比，呈现显著性差异(P﹤0.05)；安康鱼肉多肽各剂量组DLD、TG含量与模型组相比显著降低(P﹤0.05)，其中高剂量组效果更好，DLD、TG含量降幅分别达到46.69％和50.66％，与阳性药物组差别不大。说明安康鱼肉多肽可降低NAFLD小鼠血清DLD、TG含量且随着安康鱼肉多肽浓度的增加，呈现明显的剂量相关性。同正常组比较，模型组HLD含量显著降低，为0.85mmol/L，是正常组的0.31倍：阳性药物组HLD含量上升，与模型组相比，呈现显著性差异(P﹤0.05)；安康鱼肉多肽各剂量组HLD含量与模型组相比显著上升(P﹤0.05)，其中高剂量组效果更好，HLD含量上升幅度达到109.41％，与阳性药物组差别不大。说明安康鱼肉多肽可升高NAFLD小鼠血清HLD含量，且随着安康鱼肉多肽浓度的增加，呈现明显的剂量相关性。
表3各组小鼠血清ALT、AST、HDL、DLD、TG活性(`x±s，n＝4)
组别 ALT/(U/L) AST/(U/L) HLD/(mmol/L) DLD/(mmol/L) TG/(mmol/L)
正常组 12.60±2.24<sup>b</sup> 27.48±2.42<sup>b</sup> 2.65±0.28<sup>b</sup> 2.35±1.76<sup>b</sup> 4.54±1.0l<sup>b</sup>
模型组 34.86±1.43<sup>a</sup> 54.01±1.96<sup>a</sup> 0.75±0.24<sup>a</sup> 10.43±1.13<sup>a</sup> 14.45±2.84<sup>a</sup>
阳性药物组 14.24±2.26<sup>b</sup> 35.73±0.12<sup>b</sup> 2.02±0.35<sup>b</sup> 3.66±0.84<sup>b</sup> 5.74±0.18<sup>b</sup>
低剂量组 29.51±3.31<sup>a</sup> 48.54±0.31<sup>a</sup> l.39±0.18<sup>a</sup> 8.79±1.5<sup>r</sup> 10.17±1.56<sup>a</sup>
高剂量组 21.58±0.1<sup>rb</sup> 41.49±1.45<sup>ab</sup> 1.68±0.15<sup>ab</sup> 5.56±0.14<sup>b</sup> 7.13±0.73<sup>b</sup>
注：a与正常组相比，P﹤0.05；b与模型组相比，P﹤0.05；
4、准确称取小鼠肝脏组织，按重量(g)：体积(ml)＝1:9的比例加入9倍体积的0.9％的生理盐水，制成10％的匀浆液，4000r/min，离心10min，取上清液进行SOD活性测定。各组小鼠肝组织匀浆SOD活性如表4，与正常组相比，模型组的SOD活性显著降低，；阳性药物组和高剂量组SOD活性分别是模型组的1.42倍和1.34倍，呈现显著性差异(P﹤0.05)；
表4各组小鼠肝组织匀浆SOD活性(`x±s，n＝4)
组别 SOD CU/mg prot)
正常组 75.31±7.81<sup>b</sup>
模型组 51.26±6.24<sup>a</sup>
阳性药物组 71.18±7.03<sup>b</sup>
低剂量 51.26±2.26<sup>a</sup>
高剂量 67.72±6.45<sup>b</sup>
注：a与正常组相比，P﹤0.05；b与模型组相比，P﹤0.05；
结论：由于NAFLD时过多的FFA在线粒体进行β氧化生成大量的活性氧(ROS)，耗竭体内的抗氧化物质，使氧化-抗氧化失衡造成氧化应激和脂质过氧化，可进一步损伤线粒体，一方面使之产生更多的ROS，形成恶性循环；另一方面，引起线粒体膜通透性改变后，进一步启动细胞凋亡，因此通过检测能反映线粒体内有关氧化及抗氧化物质变化的指标可反映肝细胞功能的变化，这些指标为谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)等的含量。ALT与AST是目前最常用的肝功能指标，当肝脏发生损伤时可引起ALT、AST的显著升高。SOD能够特异地清除机体内的氧自由基，减少氧自由基对使机体带来的损害。通过检测可衡量肝功能的状态，常作为肝功能恢复的指标。模型组血清ALT、AST活性与正常组相比显著增加，安康鱼肉多肽剂量组与模型组相比有所降低，且安康鱼肉多肽高剂量组降幅高于低剂量组，说明安康鱼肉多肽对小鼠NAFLD有优良的修复作用。
实施例2
一种对非酒精性脂肪肝具有修复作用的安康鱼肉多肽的制备，包括以下步骤：
(1)、安康鱼肉预处理：将安康鱼进行解冻清洗后用绞肉机绞碎，在料液比为1:4(m/v)，温度为48℃的条件下，用94％的乙醇水浴脱脂2h；脱脂后将上清液倒掉，用纯水将沉淀洗净，将脱脂鱼肉在2℃、11900r/min条件下离心15min，收集沉淀，放入-18℃冷冻备用；
(2)、酶解：将鱼肉加到含有中性蛋白酶的酶解液中进行酶解；其中，中性蛋白酶的浓度为0.05wt％，酶解液质量为鱼肉质量的2倍，酶解温度为30℃，酶解液pH至控制在6.5，酶解时间为5h；
(3)、过滤得澄清液：向酶解液中添加质量为酶解液1wt％的改性活性炭，并将酶解液加热到70℃，脱色30min；将脱色后的酶解液转移至板框过滤池内进行过滤，取澄清液；
所述改性活性炭的制备步骤为：
a、预处理：对果壳活性炭，先用0.5mol/L稀硝酸于60℃浸泡活性炭1.8h，将样品过滤后再缓慢加入0.8mol/L的氢氟酸，于60℃浸泡8h后用去离子水洗涤至中性，后加入去离子水98℃煮沸1.8h，之后用纯水冲洗2次后，置于98℃烘箱中烘干，取出后进行密封处理备用；b、改性：称取预处理后的果壳活性炭，分别用10％的碳酸氢钠浸泡并磁力搅拌1.8h，再用去离子水将上述果壳活性炭冲洗至pH值达到6.8为止，然后在98℃恒温干燥箱中干燥22h，即可得到改性后的果壳活性炭，所述果壳为杏仁果壳，步骤b所述的果壳活性炭与碳酸氢钠的质量比为1:3。
(4)、分离纯化：将澄清液转移至泡沫分离柱中进行鼓气起泡，并收集泡沫液，在鼓气的同时向泡沫分离柱中注水；鼓气速率为3L/min，注水速率为0.2L/min，泡沫分离柱中液体的装载高度与泡沫分离柱内径比为8:1，澄清液温度保持在25℃；待收集的泡沫液灭泡后，对泡沫液进行重金属分离；向重金属分离后的泡沫液中添加质量为泡沫液1％的磁性亲和微球并分散均匀，静置亲和吸附50min后利用磁场使磁性亲和微球聚集；分离出磁性亲和微球后，用pH值为7的Tris-HCl缓冲液对磁性亲和微球进行洗脱，再次利用磁场分离出磁性亲和微球后，得到洗脱液，75℃下储存备用；
所述磁性亲和微球的制备步骤如下：
I、生成磁性微球：将海藻酸钠、聚环氧乙烷、脱乙酰甲壳素、正庚烷、乙酸和纯水按质量比2:1:2:0.5:3:100在容器中混合溶解，搅拌均匀后制得混合液A；向混合液A中添加混合液A质量4％的四氧化三铁磁颗粒并分散均匀，得到混合液B；对混合液B进行超声波分散，同时向混合液B中匀速滴加混合液B质量40％的乳化液，得到混合液C；先后向混合液C中添加混合液C质量0.1％的97wt％的戊二醛和混合液C质量0.5倍的2.5wt％的溴化钾溶液，充分搅拌，静置1h，生成磁性微球；步骤I所述乳化液为体积占比为30％的双乙酰酒石酸单甘油酯-80无水乙醇混合液，乳化液在5min内滴加完毕。
II、聚集磁性微球：利用磁场对液体中磁性微球进行聚集，取出磁性微球后进行清洗、干燥。
(5)、除杂除菌：将洗脱液通过二级0.22微米膜过滤除杂除菌；其中膜过滤温度小于40℃，一级过滤压力为0.15MPa，二级过滤压力为0.2MPa；
(6)、多肽分级：采用超滤膜或纳滤膜对膜过滤后的浓缩液按分子量进行分离，得到目标分子量的为1600-4000Da的安康鱼肉多肽。
实施例3
一种对非酒精性脂肪肝具有修复作用的安康鱼肉多肽的制备，包括以下步骤：
(1)、安康鱼肉预处理：将安康鱼进行解冻清洗后用绞肉机绞碎，在料液比为1:6(m/v)，温度为52℃的条件下，用96％的乙醇水浴脱脂2.2h；脱脂后将上清液倒掉，用纯水将沉淀洗净，将脱脂鱼肉在6℃、12000r/min条件下离心20min，收集沉淀，放入-20℃冷冻备用；
(2)、酶解：将鱼肉加到含有中性蛋白酶的酶解液中进行酶解；其中，中性蛋白酶的浓度为0.25wt％，酶解液质量为鱼肉质量的4倍，酶解温度为45℃，酶解液pH至控制在8.5，酶解时间为5.4h；
(3)、过滤得澄清液：向酶解液中添加质量为酶解液2wt％的改性活性炭，并将酶解液加热到80℃，脱色50min；将脱色后的酶解液转移至板框过滤池内进行过滤，取澄清液；
所述改性活性炭的制备步骤为：
a、预处理：对果壳活性炭，先用0.8mol/L稀硝酸于65℃浸泡活性炭2.2h，将样品过滤后再缓慢加入1mol/L的氢氟酸，于70℃浸泡10h后用去离子水洗涤至中性，后加入去离子水100℃煮沸2.2h，之后用纯水冲洗3次后，置于102℃烘箱中烘干，取出后进行密封处理备用；
b、改性：称取预处理后的果壳活性炭，分别用10-15％的碳酸氢钠浸泡并磁力搅拌2.2h，再用去离子水将上述果壳活性炭冲洗至pH值达到7为止，然后在102℃恒温干燥箱中干燥24h，即可得到改性后的果壳活性炭，所述果壳为杏仁果壳，步骤b所述的果壳活性炭与碳酸氢钠的质量比为1:4。
(4)、分离纯化：将澄清液转移至泡沫分离柱中进行鼓气起泡，并收集泡沫液，在鼓气的同时向泡沫分离柱中注水；鼓气速率为4L/min，注水速率为0.3L/min，泡沫分离柱中液体的装载高度与泡沫分离柱内径比为10:1，澄清液温度保持在35℃；待收集的泡沫液灭泡后，对泡沫液进行重金属分离；向重金属分离后的泡沫液中添加质量为泡沫液1-2％的磁性亲和微球并分散均匀，静置亲和吸附70min后利用磁场使磁性亲和微球聚集；分离出磁性亲和微球后，用pH值为7.2的Tris-HCl缓冲液对磁性亲和微球进行洗脱，再次利用磁场分离出磁性亲和微球后，得到洗脱液，85℃下储存备用；
所述磁性亲和微球的制备步骤如下：
I、生成磁性微球：将海藻酸钠、聚环氧乙烷、脱乙酰甲壳素、正庚烷、乙酸和纯水按质量比3:1.2:2.5:0.8:5:100在容器中混合溶解，搅拌均匀后制得混合液A；向混合液A中添加混合液A质量6％的四氧化三铁磁颗粒并分散均匀，得到混合液B；对混合液B进行超声波分散，同时向混合液B中匀速滴加混合液B质量60％的乳化液，得到混合液C；先后向混合液C中添加混合液C质量0.2％的97-98wt％的戊二醛和混合液C质量0.8倍的3.5wt％的溴化钾溶液，充分搅拌，静置1.2h，生成磁性微球；步骤I所述乳化液为体积占比为35％的双乙酰酒石酸单甘油酯-80无水乙醇混合液，乳化液在10min内滴加完毕。
II、聚集磁性微球：利用磁场对液体中磁性微球进行聚集，取出磁性微球后进行清洗、干燥。
(5)、除杂除菌：将洗脱液通过二级0.22微米膜过滤除杂除菌；其中膜过滤温度为43℃，一级过滤压力为0.25MPa，二级过滤压力为0.4MPa；
(6)、多肽分级：采用超滤膜或纳滤膜对膜过滤后的浓缩液按分子量进行分离，得到目标分子量的为1600-4000Da的安康鱼肉多肽。
由上述实施例1-3相关的数据可知，只有在本发明权利要求范围内的方案，才能够在各方面均能满足上述要求，得到NAFLD具有优良的修复作用的安康鱼肉多肽。而对于配比的改动、原料的替换/加减，或者加料顺序的改变，均会带来相应的负面影响。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种具有修复作用的安康鱼肉多肽的制备，其特征是，包括以下步骤：
（1）、安康鱼肉预处理：将安康鱼进行解冻清洗后绞碎，在料液比为1:4-6 (m/v)，温度为48-52℃的条件下，用94-96%的乙醇水浴脱脂2-2.2h；脱脂后将上清液倒掉，用纯水将沉淀洗净，将脱脂鱼肉在2-6 ℃、11900-12000 r/min 条件下离心15-20 min，收集沉淀，放入-18—-20 ℃冷冻备用；
（2）、酶解：将鱼肉加到含有中性蛋白酶的酶解液中进行酶解；其中，中性蛋白酶的浓度为0.05-0.25wt%，酶解液质量为鱼肉质量的2-4倍，酶解温度为30-45℃，酶解液pH至控制在6.5-8.5，酶解时间为5-5.4h；
（3）、过滤得澄清液：向酶解液中添加质量为酶解液1-2wt%的改性活性炭，并将酶解液加热到70-80℃，脱色30-50min；将脱色后的酶解液转移至板框过滤池内进行过滤，取澄清液；
（4）、分离纯化：将澄清液鼓气起泡，并收集泡沫液，在鼓气的同时注水；鼓气速率为3-4L/min，注水速率为0.2-0.3L/min，澄清液温度保持在25-35℃；待收集的泡沫液灭泡后，对泡沫液进行重金属分离；向重金属分离后的泡沫液中添加质量为泡沫液1-2%的磁性亲和微球并分散均匀，静置亲和吸附50-70min后利用磁场使磁性亲和微球聚集；分离出磁性亲和微球后，用pH值为7-7.2的Tris-HCl缓冲液对磁性亲和微球进行洗脱，再次利用磁场分离出磁性亲和微球后，得到洗脱液，75-85℃下储存备用；
（5）、除杂除菌：将洗脱液通过二级0.22微米膜过滤除杂除菌；其中膜过滤温度小于45℃，一级过滤压力小于0.25MPa，二级过滤压力小于0.4MPa；
（6）、多肽分级：采用超滤膜或纳滤膜对膜过滤后的浓缩液按分子量进行分离，得到目标分子量的安康鱼肉多肽。
2.根据权利要求1所述的一种具有修复作用的安康鱼肉多肽的制备，其特征是，所述改性活性炭的制备步骤为：
a、预处理：对果壳活性炭，先用0.5-0.8mol/L 稀硝酸于60-65 ℃ 浸泡活性炭1.8-2.2h，将样品过滤后再缓慢加入0.8-1mol/L的氢氟酸，于60-70 ℃ 浸泡8-10 h 后用去离子水洗涤至中性，后加入去离子水98-100℃煮沸1.8-2.2 h，之后用纯水冲洗2-3次后，置于98-102℃烘箱中烘干，取出后进行密封处理备用；
b、改性：称取预处理后的果壳活性炭，分别用10-15%的碳酸氢钠浸泡并磁力搅拌1.8-2.2 h，再用去离子水将上述果壳活性炭冲洗至pH值达到6.8-7为止，然后在98-102℃恒温干燥箱中干燥22-24 h，即可得到改性后的果壳活性炭。
3.根据权利要求2所述的一种具有修复作用的安康鱼肉多肽的制备，其特征是，所述果壳为杏仁果壳。
4.根据权利要求2所述的一种具有修复作用的安康鱼肉多肽的制备，其特征是，步骤b所述的果壳活性炭与碳酸氢钠的质量比为1:3-4。
5.根据权利要求1所述的一种具有修复作用的安康鱼肉多肽的制备，其特征是，所述磁性亲和微球的制备步骤如下：
I、生成磁性微球：将海藻酸钠、聚环氧乙烷、脱乙酰甲壳素、正庚烷、乙酸和纯水按质量比2-3:1-1.2:2-2.5:0.5-0.8:3-5:100混合溶解，搅拌均匀后制得混合液A；向混合液A中添加混合液A质量4-6%的四氧化三铁磁颗粒并分散均匀，得到混合液B；对混合液B进行超声波分散，同时向混合液B中匀速滴加混合液B质量40-60%的乳化液，得到混合液C；先后向混合液C中添加混合液C质量0.1-0.2%的97-98wt%的戊二醛和混合液C质量0.5-0.8倍的2.5-3.5wt%的溴化钾溶液，充分搅拌，静置1-1.2h，生成磁性微球；
II、聚集磁性微球：利用磁场对液体中磁性微球进行聚集，取出磁性微球后进行清洗、干燥。
6.根据权利要求5所述的一种具有修复作用的安康鱼肉多肽的制备，其特征是，步骤I所述乳化液为体积占比为30-35%的双乙酰酒石酸单甘油酯-80无水乙醇混合液，乳化液在5-10min内滴加完毕。
7.根据权利要求1所述的一种具有修复作用的安康鱼肉多肽的制备，其特征是，步骤（6）所述的目标分子量为1600-4000Da。
8.如权利要求1-7之一所述一种对非酒精性脂肪肝具有修复作用的安康鱼肉多肽在制备修复非酒精性脂肪肝药物中的应用。
9.如权利要求8所述应用，其特征是，一种对非酒精性脂肪肝具有修复作用的安康鱼肉多肽抑制率为85.3 %，显示脂肪肝修复活性。
10.如权利要求8所述应用，其特征是，所述药物为口服药物。
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