CN107881208A - 一种对非酒精性脂肪肝模型具有修复作用的鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法 - Google Patents
一种对非酒精性脂肪肝模型具有修复作用的鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种对非酒精性脂肪肝模型具有修复作用的鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，将鳕鱼鱼皮碱处理后再用冰乙酸溶胀，再采用碱性蛋白酶酶解，超滤取分子量小于1KDa成分，冷冻干燥得到鳕鱼皮胶原蛋白肽。有益效果为：本发明制备方法操作非常简单，所需的器材少，所需的人工成本、时间成本和原料成本低廉。制备原料为鳕鱼产品加工过程中产生的废弃物，既可减少固体污染的排放又能提高鳕鱼的经济价值；制备得到的鳕鱼皮胶原蛋白肽（CSCP）灰分、盐分含量很低，羟脯氨酸占总氨基酸的比例高，可明显降低非酒精性脂肪肝模型（NAFLD）血清中ALT、AST活性，对NAFLD有优良的修复作用，生物活性稳定，可保持较长时间。
Description
技术领域
本发明涉及生物活性物质提取技术领域，具体是一种对非酒精性脂肪肝模型具有修复作用的鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法。
背景技术
在鳕鱼产品加工过程中，会产生大量废弃物，如鱼骨、鱼头、鱼皮等，约占原料总量的40～55%，如果不对废弃物进行有效加工利用，这样不仅仅会污染环境，还造成资源的浪费。废弃物中鳕鱼皮约占下脚料的7～8%，这些下脚料只有少数充当动物的饲料，大部分都被浪费，随意丢弃，造成经济价值低下。
非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease， NAFLD)是以肝细胞脂肪变性和脂肪堆积为主要特征的病理综合征，脂肪代谢受雌激素、生长激素、皮质醇、胰高血糖素、胰岛素等激素调节的影响，这些激素可以短时间内迅速使许多蛋白质和糖类等其他物质经新陈代谢转变成脂类物质堆积在人体，而肝脏无法完全排除这些多余的脂肪，进而导致脂肪肝的形成。目前治疗的方法主要采取减肥治疗、降脂治疗和血管紧张素转换酶抑制剂等保守治疗，但保守治疗目前尚缺乏特效方法，效果欠佳。资料显示，NAFLD不单纯是肝脏疾病，而是肥胖，高脂血症，胰岛素抵抗等代谢综合征相关组分在肝脏的集中体现，其中胰岛素抵抗和遗传易感性与其发病密切相关，近年来，随着生活水平的提高及饮食结构的改变，NAFLD在我国己成为仅次于病毒性肝炎的第二大慢性肝病，但其发病机制尚未完全阐明，治疗上也缺乏有效措施，因此，建立稳定可靠的便于进行药物干预实验的NAFLD模型成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作步骤简单、鳕鱼皮胶原蛋白肽提取率高、提取的鳕鱼皮胶原蛋白肽纯度高，对非酒精性脂肪肝模型具有明显的修复作用且性质稳定的鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种对非酒精性脂肪肝模型具有修复作用的鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，包括预处理、酶解和超滤。预处理：先将鱼皮清洗干净，在2~8℃蒸馏水中浸泡10~30min，接着用6~12倍体积的0.08~0.12mol/L氢氧化钠溶液浸泡4~8h，然后用清水洗涤至中性。 沥干水分，用0.08~0.12mol/L冰乙酸溶胀9~15h，粉碎得到鳕鱼鱼皮粉末。氢氧化钠溶液中加入0.0002~0.0005mol/LN-乙酰-D-谷氨酰胺和0.0001~0.0002mol/LN-乙酰-L-谷氨酰胺。上述碱处理可去除鱼皮肌原纤维，使鱼皮软化，破坏其中非胶原成分的作用、去除杂蛋白。上述预处理可去除大部分重金属离子，使得制得的胶原蛋白肽的灰分、盐分含量很低，羟脯氨酸占总氨基酸的比例高。碱液中加入微量的N-乙酰-D-谷氨酰胺和N-乙酰-L-谷氨酰胺，可明显增加酶解产物中氨基氮含量，并对制得的鳕鱼皮胶原蛋白的空间结构具有一定的影响，但具体机理尚不明确。
酶解：在鳕鱼鱼皮粉末中加入蒸馏水和碱性蛋白酶酶解，酶解结束后灭酶，离心取上清液。碱性蛋白酶对鳕鱼皮胶原蛋白的微观结构（包括折叠和薄片大小、胶原网络连接性和表面积大小）有一定的改变，并且胶原蛋白肽链间发生交联，形成特定的分子结构。本发明酶解得到的分子量1~2KDa以下鳕鱼皮胶原蛋白肽可明显降低非酒精性脂肪肝模型（NAFLD）血清中ALT、AST活性，对NAFLD有优良的修复作用。
酶解条件为料液比1:1.5~4，温度42~55℃，pH8.5~9.5，时间8~12h，加酶量1500 ~2500U/g。上述酶解条件为最优选，底物浓度过高，会导致溶液黏稠度增大且流动性降低、减少了酶中心与底物的接触。底物浓度过低，会增大超滤及冷冻干燥时的工作量，造成资源的浪费。酶解时间过长会导致胶原蛋白分解，进而影响其提取率。
超滤：依次采用8~10KDa、5~8KDa、3~5KDa、1~3KDa、1KDa以下的超滤膜对酶解液进行超滤，取分子量1KDa以下部分，纳滤去盐后冷冻干燥。为了防止膜孔堵塞或膜损害，先采用大孔超滤膜进行超滤，再采用小孔超滤膜超滤，有效去除分子量大于1kDa的杂质。纳滤可较彻底的去除溶液中的无机盐及分子量小于200Da的杂质，对鳕鱼皮胶原蛋白肽进一步进行纯化。
冷冻干燥时加入15~25wt%聚乙烯吡洛烷酮和0.5~0.9%十四烷酸。鳕鱼皮胶原蛋白肽需要含有合适的剩余水分来保持在储存过程中性质的稳定，过度的干燥将使胶原蛋白肽分子表面的氢键和极性基团暴露而变性。冷冻干燥过程中，加入聚乙烯吡洛烷酮和微量十四烷酸，可保护胶原蛋白肽的蛋白伸展、四级结构，从而对胶原蛋白肽活性进行保护。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1.本发明制备方法操作非常简单，所需的器材少，所需的人工成本、时间成本和原料成本低廉。制备原料为鳕鱼产品加工过程中产生的废弃物，既可减少固体污染的排放又能提高鳕鱼的经济价值；
2.本发明制备的鳕鱼皮胶原蛋白肽（CSCP）灰分、盐分含量很低，羟脯氨酸占总氨基酸的比例高，可明显降低非酒精性脂肪肝模型（NAFLD）血清中ALT、AST活性，对NAFLD有优良的修复作用，生物活性稳定，可保持较长时间。
附图说明
图1为正常组（×400）小鼠肝组织形态HE染色图（光镜下）；
图2为模型组（×400）小鼠肝组织形态HE染色图（光镜下）；
图3为阳性组（×400）小鼠肝组织形态HE染色图（光镜下）；
图4为高剂量组（×400）小鼠肝组织形态HE染色图（光镜下）；
图5为低剂量组（×400）小鼠肝组织形态HE染色图（光镜下）。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种对非酒精性脂肪肝模型具有修复作用的鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，具体操作为：
1）预处理：先将鱼皮清洗干净，在4℃蒸馏水中浸泡20min，接着用8倍体积的0.1mol/L氢氧化钠溶液浸泡6h，然后用清水洗涤至中性。 沥干水分，用0.1mol/L冰乙酸溶胀12h，粉碎得到鳕鱼鱼皮粉末。氢氧化钠溶液中加入0.0004mol/LN-乙酰-D-谷氨酰胺和0.0001mol/LN-乙酰-L-谷氨酰胺；
2）酶解：在鳕鱼鱼皮粉末中加入蒸馏水和碱性蛋白酶酶解，酶解结束后灭酶，离心取上清液。酶解条件为料液比1:2，温度50℃，pH9，时间10h，加酶量2000U/g；
3）超滤：依次采用8~10KDa、5~8KDa、3~5KDa、1~3KDa、1KDa以下的超滤膜对酶解液进行超滤，取分子量1KDa以下部分，纳滤去盐后冷冻干燥。冷冻干燥时加入20wt%聚乙烯吡洛烷酮和0.6%十四烷酸。
4)本发明鳕鱼皮胶原蛋白肽对非酒精性脂肪肝模型修复作用测试：
①将24只成年雄性(ICR)小鼠在饲养环境中适应性饲养72h后随机分为2组，正常组小鼠 (6只)喂基础饲料，其余小鼠(18只)喂高脂饲料。采用高脂饲料诱导建立小鼠NAFLD 模型，通过在基础饲料中添加猪油，胆酸钠等，其中胆酸钠的能够促进脂质吸收。15日后， 从正常组与高脂饲料模型组各取两只小鼠，处死，取肝脏，包埋后HE染色进行病理学诊断， 证实造模成功。造模成功后，将模型组小鼠16只再随机分为4组，每组4只，分别为模型组、 洛伐他汀阳性药物对照组、低剂量组、高剂量组；
②将各组小鼠灌胃给药，阳性药物组每只小鼠剂量为8mg/kg，鳕鱼皮胶原蛋白肽(CSCP) 低、高剂量组分别为200mg/kg、400mg/kg，正常组与模型组都给予等量的纯净水，洛伐他 汀溶液配置：4.5mg，加入6mL纯水中，充分混匀，制备悬浮液。每天观察动物样貌、行为活动等，每隔两天测量其体重并记录。给药30日，最后一天灌胃后禁食但不禁水24h，摘眼球取血，4℃条件下4000r/min，离心10min取血清，用于生化测定；
③观察小鼠体重、行为、精神状态、毛色、饮食、饮水等情况。在灌胃给药30天后，正常组小鼠生长良好，精神状态正常。正常组小鼠活动度好，生长正常，精神状态良好。模型组小鼠精神萎靡，易嗜睡，活动减少，反应迟钝。鳕鱼皮胶原蛋白肽低剂量组精神状态比较差，反应稍迟钝，但高剂量组活动量增多，精神状态也有所改善。阳性药物组小鼠与模型组小鼠比较，活动量有所增加，对外界环境也有反应。小鼠体重变化如表1，与正常组相比，高脂 饲料模型组体重显著增加，增幅为93.16％(P﹤0.05)；阳性药物组体重增加与正常组相差不大，增幅为66.22％；鳕鱼皮胶原蛋白肽剂量组体重增幅和模型组相比有所下降，且呈现剂量 依赖性，其中低剂量组增幅为73.30％，高剂量组增幅为61.20％(P﹤0.05),而高剂量组与阳 性药物组小鼠体重增加差别不大；
表1各组小鼠体重(`x±s，n＝4)
| 指标 | 剂量/(mg/kg) | 初始体重/g | 终末体重/g | 体重增加/g |
| 正常组 | - | 19.13±0.63 | 31.98±0.46b | 9.55±2.02b |
| 模型组 | - | 18.93±1.03 | 36.65±1.25a | 15.27±3.11a |
| 阳性药物组 | 8 | 19.48±2.48 | 32.38±1.58b | 10.03±2.29b |
| 低剂量组 | 200 | 19.50±0.70 | 33.80±2.50b | 12.41±2.31b |
| 高剂量组 | 400 | 19.60±1.40 | 32.60±1.80b | 10.85±1.83b |
注：a与正常组比较，P﹤0.05；b与模型组比较，P﹤0.05；
④将小鼠眼底取血颈椎脱臼处死，解剖，观察内脏形态后取肝脏，用4℃预冷生理盐水冲净 表面浮血，滤纸拭干，称重，观察小鼠肝脏的形态。肉眼观察各组小鼠内脏器官变化。正常 组小鼠肝脏暗红，内脏器官无异物；模型组小鼠腹腔脂肪堆积，肝脏肥大并且颜色较浅；阳 性药物组与鳕鱼皮胶原蛋白肽各剂量组与模型组相比腹部脂肪堆积有所减少，肝脏颜色较深， 其中阳性药物组与高剂量组与正常组肝脏颜色差别不大；
⑤计算小鼠肝脏各指数：肝脏指数(％)＝小鼠肝脏重量(g)/小鼠体重(g)×100％。各组小鼠肝 指数如表2，模型组与正常组相比，肝指数显著增加(P﹤0.05)。各组药物组与模型组相比， 肝指数都下降，其中阳性药物组下降最多，具有显著性差异(P﹤0.05)；高剂量组肝指数下 降的幅度比低剂量组幅度大；
表2各组小鼠肝重指数(`x±s，n＝4)
注：a与正常组比较，P﹤0.05；b与模型组比较，P﹤0.05；
⑥摘眼球取血，4℃条件下4000r/min，离心10min取血清，按试剂盒说明书步骤进行HLD， TG，DLD，AST，ALT指标的测定。各组小鼠血清ALT、AST活性如表3，同正常组比较， 模型组ALT、AST活性显著升高(P﹤0.05)，分别达到35.86U/L和55.01U/L，是正常组2.64 倍和1.93倍；阳性药物组ALT、AST活性下降，与模型组相比，呈现显著性差异(P﹤0.05)； CSCP各剂量组ALT、AST活性与模型组相比显著降低(P﹤0.05)，其中高剂量组效果更好， ALT、AST活性降幅分别达到37.03％和22.76％，与阳性药物组差别不大。说明CSCP可降 低NAFLD小鼠血清ALT、AST活性，且随着CSCP浓度的增加，呈现明显的剂量相关性； 各组小鼠血清HLD、DLD、TG含量如表3，同正常组比较，模型组DLD、TG含量显著升高， 分别达到10.23mmol/L和14.35mmol/L，是正常组的4.16倍和3.03倍；阳性药物组DLD、TG 含量降低，与模型组相比，呈现显著性差异(P﹤0.05)；CSCP各剂量组DLD、TG含量与模 型组相比显著降低(P﹤0.05)，其中高剂量组效果更好，DLD、TG含量降幅分别达到41.97％ 和49.62％，与阳性药物组差别不大。说明CSCP可降低NAFLD小鼠血清DLD、TG含量且 随着CSCP浓度的增加，呈现明显的剂量相关性。同正常组比较，模型组HLD含量显著降低， 为0.85mmol/L，是正常组的0.31倍：阳性药物组HLD含量上升，与模型组相比，呈现显著 性差异(P﹤0.05)；CSCP各剂量组HLD含量与模型组相比显著上升(P﹤0.05)，其中高剂 量组效果更好，HLD含量上升幅度达到109.41％，与阳性药物组差别不大。说明CSCP可升 高NAFLD小鼠血清HLD含量，且随着CSCP浓度的增加，呈现明显的剂量相关性。
表3 各组小鼠血清ALT、AST、HDL、DLD、TG活性（`x±s，n=4）
| 组别 | ALT/(U/L) | AST/(U/L) | HLD/(mmol/L) | DLD/(mmol/L) | TG/(mmol/L) |
| 正常组 | 13.60±2.24b | 28.48±2.42b | 2.75±0.28b | 2.45±1.78b | 4.74±1.01b |
| 模型组 | 35.86±1.43a | 55.01±1.96a | 0.85±0.24a | 10.23±1.13a | 14.35±2.94a |
| 阳性药物组 | 15.24±2.26b | 36.73±0.12b | 2.12±0.35b | 3.36±0.84b | 5.84±0.22b |
| 低剂量组 | 30.51±3.31a | 49.54±0.31a | 1.49±0.18a | 8.69±1.57a | 10.07±1.66a |
| 高剂量组 | 22.58±0.17ab | 42.49±1.46ab | 1.78±0.15ab | 5.96±0.14b | 7.23±0.83b |
注：a与正常组相比，P﹤0.05；b与模型组相比，P﹤0.05；
⑦准确称取小鼠肝脏组织，按重量（g）：体积（ml）=1:9的比例加入9倍体积的0.9%的生理盐水，制成10%的匀浆液，4000r/min，离心10min，取上清液进行SOD活性测定。各组小鼠肝组织匀浆SOD活性如表4，与正常组相比，模型组的SOD活性显著降低，；阳性药物组和高剂量组SOD活性分别是模型组的1.42倍和1.34倍，呈现显著性差异（P﹤0.05）；
表4各组小鼠肝组织匀浆SOD活性（`x±s，n=4）
| 组别 | SOD（U/mg prot） |
| 正常组 | 75.41±7.82b |
| 模型组 | 50.66±6.34a |
| 阳性药物组 | 72.09±8.03b |
| 低剂量 | 53.36±2.29a |
| 高剂量 | 67.72±6.65b |
注：a与正常组相比，P﹤0.05；b与模型组相比，P﹤0.05；
⑧HE染色观察小鼠肝组织病理变化：取材与固定：将小鼠肝脏切成1cm×1cm左右的大小，生理盐水清洗，置于4%多聚甲醛固定液中固定24h，固定后自来水流水冲洗过夜。脱水与透明：用刀片将组织边缘修剪整齐，依次放入70%，80%，90%乙醇中各30min，95%，95%，100%，100%乙醇中各20min，脱去组织中的水分。然后将组织放入无水乙醇与二甲苯等比混合液中15min，再放入二甲苯中至透明为止。透蜡与包埋：将已透明组织置于二甲苯石蜡等比混合液中25min，石蜡中2h，然后组织包埋。切片与摊片：用切片机制备5µm切片，用于HE染色。HE染色：脱蜡复水：二甲苯2×10min，100%，100%，90%，80%，70%乙醇各5min，蒸馏水3min。染色：苏木素5min，流水冲洗；伊红2min，流水冲洗。脱水，透明：70%，80%，90%，100%，100%各3min，二甲苯2×10min。中性树胶封片。每组小鼠肝组织切片HE染色后光镜下观察，如图1~5所示。正常组小鼠肝小叶结构清晰完成，肝索呈放射状整齐排列在中央静脉周围，肝窦结构清晰，肝细胞呈多边形，大小均一，细胞核大而圆，结构比较清晰。模型组可见重度弥漫性肝细胞脂肪变，肝小叶结构不完整，肝索排列紊乱，肝窦结构不清晰，肝细胞肿胀体积增大且胞浆内可见脂肪空泡，细胞界限不清晰，大量细胞坏死，损伤严重，汇管区有炎症细胞浸润。阳性药物组小鼠与模型组小鼠相比，肝小叶结构较完整，肝索在中央静脉周围排列较为整齐，肝窦间隙较清晰，肝细胞脂肪变程度有所减轻，胞浆内脂肪空泡有所减少，偶见细胞坏死及炎症细胞浸润。CSCP低剂量与高剂量组与模型组相比，肝细胞脂肪变程度有所减轻，炎症细胞浸润减少，与阳性药物组差别不大。
由于NAFLD时过多的FFA在线粒体进行β氧化生成大量的活性氧（ROS)，耗竭体内的抗氧化物质，使氧化-抗氧化失衡造成氧化应激和脂质过氧化，可进一步损伤线粒体，一方面使之产生更多的ROS，形成恶性循环；另一方面，引起线粒体膜通透性改变后，进一步启动细胞凋亡，因此通过检测能反映线粒体内有关氧化及抗氧化物质变化的指标可反映肝细胞功能的变化，这些指标为谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶 (SOD)等的含量。ALT与AST是目前最常用的肝功能指标，当肝脏发生损伤时可引起ALT、AST 的显著升高。SOD能够特异地清除机体内的氧自由基，减少氧自由基对使机体带来的损害。通过检测可衡量肝功能的状态，常作为肝功能恢复的指标。模型组血清ALT、AST活性与正常组相比显著增加，CSCP剂量组与模型组相比有所降低，且CSCP高剂量组降幅高于低剂量组，说明CSCP对小鼠NAFLD有优良的修复作用。
实施例2：
1）预处理：先将鱼皮清洗干净，在3℃蒸馏水中浸泡25min，接着用7倍体积的0.1mol/L氢氧化钠溶液浸泡6h，然后用清水洗涤至中性。 沥干水分，用0.1mol/L冰乙酸溶胀11h，粉碎得到鳕鱼鱼皮粉末。氢氧化钠溶液中加入0.0003mol/LN-乙酰-D-谷氨酰胺和0.0002mol/LN-乙酰-L-谷氨酰胺；
2）酶解：在鳕鱼鱼皮粉末中加入蒸馏水和碱性蛋白酶酶解，酶解结束后灭酶，离心取上清液。酶解条件为料液比1:2，温度50℃，pH9，时间10h，加酶量2000U/g；
3）超滤：依次采用8~10KDa、5~8KDa、3~5KDa、1~3KDa、1KDa以下的超滤膜对酶解液进行超滤，取分子量1KDa以下部分，纳滤去盐后冷冻干燥。冷冻干燥时加入18wt%聚乙烯吡洛烷酮和0.5%十四烷酸。
实施例3：
1）预处理：先将鱼皮清洗干净，在3℃蒸馏水中浸泡30min，接着用7倍体积的0.1mol/L氢氧化钠溶液浸泡6h，然后用清水洗涤至中性。 沥干水分，用0.1mol/L冰乙酸溶胀11h，粉碎得到鳕鱼鱼皮粉末。氢氧化钠溶液中加入0.0003mol/LN-乙酰-D-谷氨酰胺和0.0002mol/LN-乙酰-L-谷氨酰胺；
2）酶解：在鳕鱼鱼皮粉末中加入蒸馏水和碱性蛋白酶酶解，酶解结束后灭酶，离心取上清液。酶解条件为料液比1:2，温度50℃，pH9，时间10h，加酶量2000U/g；
3）超滤：依次采用8~10KDa、5~8KDa、3~5KDa、1~3KDa、1KDa以下的超滤膜对酶解液进行超滤，取分子量1KDa以下部分，纳滤去盐后冷冻干燥。冷冻干燥时加入20wt%聚乙烯吡洛烷酮和0.6%十四烷酸。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种对非酒精性脂肪肝模型具有修复作用的鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，包括预处理、酶解和超滤，其特征在于：所述的预处理：采用碱处理对鳕鱼鱼皮进行预处理，碱液为0.08~0.12mol/L氢氧化钠溶液。
2. 根据权利要求1所述的一种对非酒精性脂肪肝模型具有修复作用的鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述的碱处理的具体步骤为：先将鱼皮清洗干净， 在2~8℃蒸馏水中浸泡10~30min，接着用6~12倍体积的0.08~0.12mol/L氢氧化钠溶液浸泡4~8h，然后用清水洗涤至中性。
3.根据权利要求1所述的一种对非酒精性脂肪肝模型具有修复作用的鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述的碱处理后，沥干水分，用0.08~0.12mol/L冰乙酸溶胀9~15h，粉碎得到鳕鱼鱼皮粉末。
4.根据权利要求1所述的一种对非酒精性脂肪肝模型具有修复作用的鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：在所述氢氧化钠溶液中加入0.0002~0.0005mol/LN-乙酰-D-谷氨酰胺和0.0001~0.0002mol/LN-乙酰-L-谷氨酰胺。
5.根据权利要求1所述的一种对非酒精性脂肪肝模型具有修复作用的鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述的酶解：在鳕鱼鱼皮粉末中加入蒸馏水和碱性蛋白酶酶解，酶解结束后灭酶，离心取上清液。
6. 根据权利要求5所述的一种对非酒精性脂肪肝模型具有修复作用的鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述的酶解条件为料液比1:1.5~4，温度42~55℃，pH8.5~9.5，时间8~12h，加酶量1500 ~2500U/g。
7.根据权利要求1所述的一种对非酒精性脂肪肝模型具有修复作用的鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述的超滤：依次采用8~10KDa、5~8KDa、3~5KDa、1~3KDa、1KDa以下的超滤膜对酶解液进行超滤，取分子量1KDa以下部分，纳滤去盐后冷冻干燥。
8.根据权利要求7所述的一种对非酒精性脂肪肝模型具有修复作用的鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述的冷冻干燥时加入15~25wt%聚乙烯吡洛烷酮和0.5~0.9%十四烷酸。
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