CN106350556A - 一种医用高纯度鱼皮胶原的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种医用级高纯度鱼皮胶原蛋白的制备方法，包括原料处理、胶原提取和提取物纯化等步骤。采用本发明的医用级生物材料用鱼皮胶原制备方法，可充分有效的去除鱼皮中含量较高的Ⅲ型胶原蛋白、Ⅴ型胶原蛋白及其他非胶原成分，获得胶原含量≥99%，Ⅰ型胶原含量≥95%高纯度的和具有完整三螺旋结构高活性的Ⅰ型胶原。本方法改用有机溶剂沉淀，减少现有方法中盐析后复溶和透析环节，生产时间缩短，便于操作，产品回收率、活性和纯度均有提高，更适合工业化生产。本方法较现有方法，酶解结束后乙醇沉淀和脱水的过程中，无花果蛋白酶同时被灭活，酶被及时灭活，更好的保护了胶原蛋白分子的完整性。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料制备领域，尤其涉及一种从鱼皮中提取可作为生物医用材料的天然高分子胶原的方法。
背景技术
胶原蛋白是动物组织中的一类结构蛋白，约占总蛋白量的1/3，广泛分布于动物的皮肤、骨骼、软骨、结缔组织、腱、角膜、内脏细胞间质、肌腔、韧带、巩膜等部位。胶原蛋白在动物体内起支持、保护、连接等多种作用，是一种白色、透明、无分支的原纤维，分子量为 30万道尔顿。发挥人体生理功能的胶原必须是由三条缠绕的直链所组成的好像麻花一般的螺旋结构。其中Ⅰ型胶原在动物体内含量最大，是主要的胶原蛋白类型，约占胶原总量的80%以上。单个的Ⅰ型胶原分子分子量约为285kD，宽1.5nm，长约300nm，由三条多肽链组成。
随着我国工业发展，我国每年有数量庞大的废弃鱼体组织被丢弃，其中含有丰富的胶原蛋白。随着近段时间，疯牛病和口蹄疫在全球范围内爆发，带来了哺乳动物来源胶原蛋白的安全问题。因此，鱼体组织成为理想的胶原蛋白源。
现有技术中主要是利用深海鱼类的鱼皮，加工得到医用级生物材料用鱼皮胶原，鱼皮酶解之后用盐析法将胶原沉淀析出，后经复溶和除盐工艺将盐析加入氯化钠除去，该方法操作步骤繁琐，加工时间较长，蛋白酶不能及时灭活，因此回收率低且部分胶原丧失三螺旋结构。盐析法对Ⅲ型胶原、Ⅴ型胶原和其它杂质没有很好的选择性，得到的鱼皮Ⅰ型胶原蛋白含量较低且灰分较高，没有很好的生物相容性，应用范围较窄。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种医用级高纯度鱼皮胶原的制备方法， 按照以下步骤进行 ：
1） 原料处理：将清洗干净并脱水后的罗非鱼皮绞碎成 0.5-5cm 2 的小块后，加入料液比1:25（w/w）的 2-15%正丁醇脱脂，0-4℃搅拌 8-12 小时后排除废液，并重复 3-4 次，用去离子水清洗。将清洗后的鱼皮以料液比 1:25（w/w）放入0.05- 0.2M的NaOH 溶液中搅拌32-48 小时，每间隔 8-12小时更换所述NaOH溶液一次，再用去离子水充分清洗经碱溶液处理后的鱼皮直至中性；
2） 胶原提取：将清洗后的鱼皮以料液比1:5-20（w/w）的比例放入 0.05-0.5M 的酸性溶液中，加入0.01%-0.1% 的蛋白酶搅拌 24-60 小时，酶解处理得酶解胶原液；
3） 提取物纯化：加入无水乙醇溶液，直至所述胶原液中的乙醇含量达到30-80%，静置，过滤，得胶原蛋白，无水乙醇脱水，低温真空干燥得胶原蛋白粉末。获得水分≤12% 的医用级生物材料用天然高分子鱼皮胶原。
本发明的有益效果是:
1）本方法使用有机溶剂沉淀胶原蛋白比盐析法有很大优势：盐析法需要加入大量氯化钠，随后复溶并透析除去氯化钠，本方法使用有机溶剂沉淀，有机溶剂在低温真空干燥时除去，不带入氯化钠，因此不需要复溶和透析，操作步骤简化，操作时间缩短，有利于提高产品回收率并保持胶原活性。
2）不同物质在有机溶剂中沉淀的溶剂浓度不同，即利用有机溶剂沉淀具有一定选择作用。本方法有机溶剂加入适宜量时，只有Ⅰ型胶原沉淀析出，得到胶原含量≥99%，Ⅰ型胶原含量≥95%高纯度胶原，有效去除了Ⅲ型胶原、Ⅴ型胶原和其它杂质。
3）传统盐析法在盐析过程中需要将氯化钠缓慢加入到料液中，以免因氯化钠局部浓度过高使胶原产生不可逆变性，因此操作时间长并伴随有部分胶原变性。本方法是用有机溶剂进行沉淀，原理是将胶原表面水分子夺走，短时间内可实现沉淀析出，可以有效缩短操作时间，并可有效避免因氯化钠部分浓度过高导致胶原发生不可逆变性，有利于胶原三螺旋结构保持。
4）蛋白酶在酶解时可以有效去除端肽，降低胶原免疫原性，蛋白酶不灭活时，酶解时间过长或酶活过高，会使胶原产生部分降解，本方法使用有机溶剂脱水时，同时对蛋白酶灭活，有助于胶原三螺旋结构的保持。
5）本方法比传统方法减少复溶和除盐工艺，使得回收率提高。
具体实施方式
实施例1
1.原料处理：取出一定量的保存于-20℃的罗非鱼皮，用大量自来水浸泡并冲洗，去除鱼皮表面残留的鱼肉、鱼鳞等其他组织，用超纯水浸泡清洗3次。准确称取40g鱼皮，将鱼皮剪成1×1cm大小，于4℃冰柜中，在悬臂搅拌器不断搅拌的条件下，用500mL的10％正丁醇水溶液脱脂8h，重复上述脱脂过程3次，然后用自来水冲洗20min，再用超纯水清洗3次。在4℃冰柜中，将上述脱脂后的鱼皮浸泡于500mL的0.1mol/L氢氧化钠溶液中脱杂蛋白8h，期间用悬臂搅拌器搅拌，重复上述脱脂过程3次，然后用自来水冲洗至中性，再用超纯水清洗3次；
2.胶原提取：500mL 的 0.5mol/L 醋酸溶液，再加入0.05g( 原料鱼皮质量 0.05％ )无花果蛋白酶，于4℃冰柜中，用磁力搅拌器搅拌提取48h，然后于4℃，10000r/min 条件下离心30min，收集上清液；
3.提取物纯化：加入无水乙醇溶液，直至所述胶原液中的乙醇含量达到60%，静置10h，用正压过滤器5微米膜过滤，得胶原蛋白，加入无水乙醇200ml脱水5h，6℃低温真空干燥得胶原蛋白粉末。获得水分≤12% 的医用级生物材料用天然高分子鱼皮胶原。
实施例2
1.原料处理：取出一定量的保存于-20℃的鳕鱼鱼皮，用大量自来水浸泡并冲洗，去除鱼皮表面残留的鱼肉、鱼鳞等其他组织，用超纯水浸泡清洗3次。准确称取200g鱼皮，将鱼皮剪成0.5×2cm大小，于4℃冰柜中，在悬臂搅拌器不断搅拌的条件下，用2500mL的10％正丁醇水溶液脱脂8h，重复上述脱脂过程3次，然后用自来水冲洗20min，再用超纯水清洗 3 次。在4℃冰柜中，将上述脱脂后的鱼皮浸泡于2500mL的0.1mol/L氢氧化钠溶液中脱杂蛋白8h，期间用悬臂搅拌器搅拌，重复上述脱脂过程3次，然后用自来水冲洗至中性，再用超纯水清洗3次；
2.胶原提取：1500mL的 0.3mol/L 醋酸溶液，再加入0.5g( 原料鱼皮质量 0.05％ )无花果蛋白酶，于4℃冰柜中，用磁力搅拌器搅拌提取48h，然后于4℃，10000r/min 条件下离心30min，收集上清液；
3.提取物纯化：加入无水乙醇溶液，直至所述胶原液中的乙醇含量达到75%，静置10h，用正压过滤器5微米膜过滤，得胶原蛋白，加入无水乙醇800ml脱水5h，4℃低温真空干燥得胶原蛋白粉末。获得医用级生物材料用天然高分子鱼皮胶原。
实施例1和实施例2的部分检测数据见下表，对照是采取常规盐析方法制备的胶原蛋白。
| 项目 | 实施例1 | 实施例2 | 对照 |
| 水分 | 11.3% | 11.6% | 12.5% |
| 色氨酸 | 0.036% | 0.042% | 0.253% |
| 灰分 | 0.41% | 0.56% | 1.12% |
因为胶原蛋白不含有色氨酸，因此色氨酸含量通常也是代表了胶原蛋白的纯度，从数据可以看出，本发明方法制备的胶原蛋白色氨酸含量明显低于常规盐析法，纯度更高。灰分含量也更低。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以列举。而因此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (8)
1.一种医用级高纯度鱼皮胶原的制备方法，其特征在于，所述鱼皮胶原按照以下步骤进行：
1） 原料处理：将清洗干净并脱水后的罗非鱼皮绞碎成 0.5-5cm 2 的小块后，加入料液比1:10-25（w/w）的 2-15%正丁醇脱脂，0-4℃搅拌 8-12 小时后排除废液，并重复 3-4 次，用去离子水清洗，将清洗后的鱼皮以料液比1:10-25（w/w）放入0.05- 0.2M的NaOH溶液中搅拌32-48 小时，每间隔 8-12小时更换所述NaOH溶液一次，再用去离子水充分清洗经碱溶液处理后的鱼皮直至中性；
2） 胶原提取：将清洗后的鱼皮以料液比1:5-20（w/w）的比例放入 0.05-0.5M 的酸性溶液中，加入0.01%-0.1% 的蛋白酶搅拌 24-60 小时，酶解处理得酶解胶原液；
3） 提取物纯化：加入无水乙醇溶液，直至所述胶原液中的乙醇含量达到30-80%，静置，过滤，得胶原蛋白，无水乙醇脱水，低温真空干燥得胶原蛋白粉末，获得水分≤12%的医用级生物材料用天然高分子鱼皮胶原。
2.如权利要求 1 所述的鱼皮胶原制备方法，其特征在于，所述步骤 2）中采用的蛋白酶为无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶等。
3.如权利要求1所述的鱼皮胶原制备方法，其特征在于，所述步骤 3）中使用的沉淀溶液为无水乙醇或丙酮等有机溶剂，沉淀浓度30-80%。
4.如权利要求1所述的鱼皮胶原制备方法，其特征在于，所述步骤 3）中静置时间为2-24h。
5.如权利要求1所述的鱼皮胶原制备方法，其特征在于，所述步骤 3）中过滤是指用抽滤、正压过滤器、板框过滤等膜过滤设备。
6.如权利要求1所述的鱼皮胶原制备方法，其特征在于，所述步骤 3）中使用的脱水剂为无水乙醇或丙酮等有机溶剂，料液比为1：5-20（w/w）。
7.如权利要求1所述的鱼皮胶原制备方法，其特征在于，所述步骤 3）中脱水时间为1-24h。
8.如权利要求1所述的鱼皮胶原制备方法，其特征在于，所述步骤 3）中低温真空干燥温度为0-12℃。
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