CN101137669A - 纯化海生胶原蛋白的方法及其形成多孔海绵的处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种纯化海生胶原蛋白的方法,所述胶原蛋白形成多孔海绵的处理方法,以及采用该方法制备的产品和所述产品的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种纯化海生胶原蛋白的方法,特别涉及一种改善海生胶原蛋白的气味和外观的方法。
本发明进一步涉及一种制备特别适用于医学用途的海生胶原蛋白的多孔海绵的方法。
背景技术
胶原蛋白为一种生物可降解的和生物相容的蛋白,其被用于食品工业、制药和化妆品工业以及医学上的多种应用的原材料。
“海生胶原蛋白”理解为指从海洋生物,即生活在海洋中的生物,特别是从海绵动物品系中的成员,优选从地中海海绵(Chondrosiareniformis)中分离的胶原蛋白。
大量的胶原蛋白产品被知晓且用于医学中。这种产品包括,例如,海绵、纤维或膜。
这些产品中的大多数是由哺乳动物(如牛、马或猪)的结缔组织、皮肤、骨或腱制备的胶原蛋白制造的。这些产品的本质缺点可以从以下事实看到:
-在大多数情况下,为了获得足够的胶原蛋白产量,不得不使用年幼的动物作为胶原蛋白的来源;
-制得的胶原蛋白在大多数情况下于酸性介质和碱性介质中均可溶,为了提高胶原蛋白的机械性质和其在液体介质中的稳定性,这使额外的交联反应(物理上,通过热处理;或化学上,通过使用双官能物质)成为必要;
-存在污染牛海绵样脑病(BSE)的危险。
作为从哺乳动物制备胶原蛋白的替代,WO01/64046描述了一种从地中海海绵属(海绵动物门,录常海绵纲)的海洋海绵动物中分离胶原蛋白的方法。
在该方法中,用醇浸透新鲜的海绵动物原材料,然后用水洗涤,并向其中加入提取剂,优选在7~12的pH下。通过将悬浮液的pH增加到8~11,搅拌,离心,随后减小上清液的pH值,以及离心和分离出沉淀物来处理得到的胶原蛋白提取物。
然而,通过该方法得到的海绵胶原蛋白本质上存在以下缺点:
-胶原蛋白溶液具有脏的外观,
-胶原蛋白在微生物学上是不纯的,和
-由这种海绵胶原蛋白得到的产品具有令人不快的气味。
因此本发明的任务是消除海生胶原蛋白的上述缺点,并提供也适用于制造用于医学用途的产品的由海洋生物得到的胶原蛋白。
发明内容
该任务是通过使用化学处理步骤纯化胶原蛋白沉淀物,从而改善其气味和外观而解决的。纯化的胶原蛋白随后可以通过冷冻干燥加工成多孔海绵。
根据本发明,纯化海生胶原蛋白的方法包括:用不同pH值的过氧化氢水溶液处理胶原蛋白沉淀物,例如,根据WO01/64046中描述的方法可获得胶原蛋白沉淀物。
为此,一开始应将胶原蛋白沉淀物的水分调至70~95重量%的含量,优选80~90重量%的含量。为了将胶原蛋白沉淀物的含水量减少至所需含量,如果必要,这可以通过在压力下拧出胶原蛋白沉淀物的水分或通过离心完成。
然后将胶原蛋白沉淀物悬浮在含有0.1~1%(v/v)、优选0.5%(v/v)H2O2的H2O2水溶液中。然后将胶原蛋白悬浮液的pH调至11~13的值。这引起该胶原蛋白溶解。
胶原蛋白在碱性条件下用H2O2孵育(incubation)后,将胶原蛋白溶液过滤以除去不溶成分。之后,通过将适当的与水可混溶的有机溶剂加入到该溶液中而使胶原蛋白从溶液中沉淀出。
滤出胶原蛋白沉淀物,且将其含水量再调至70~95重量%,优选80~90重量%。然后再将胶原蛋白溶于具有0.1~1%(v/v)、优选0.5%(v/v)的H2O2含量的H2O2水溶液中,并将该胶原蛋白溶液的pH调至5~7的值,以使胶原蛋白然后可以用于医学用途的海绵、膜或纤维的制备。
将pH调至11~13的值优选用NaOH完成,但是其也可以用其它碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物,如KOH,Ca(OH)2或Mg(OH)2完成。
优选乙醇和异丙醇作为与水可混溶的有机溶剂。优选以1∶2和1∶3之间的水对乙醇的比进行沉淀。
将胶原蛋白溶液中和至5~7的pH可以通过加入如甲酸、乙酸、柠檬酸、维生素C、丙酸、乳酸的有机酸,或如盐酸、磷酸或硫酸的无机酸降低pH值来完成。优选地,通过加入如5N盐酸来调节pH值。
根据本发明的方法的优点是:
-蛋白提取的产率高;
-无细菌的无菌胶原蛋白;
-由于海绵动物不具有神经结构,因此为无BSE的胶原蛋白;
-看起来不脏的具有令人满意的外观的胶原蛋白;
-没有令人不愉快的气味的胶原蛋白;
-在酸性介质中不溶、且不需要额外的交联反应以提高其机械性质和在液体中的稳定性的胶原蛋白;
-可用于制备用于伤口愈合的敷料或作为组织再生的支撑物的胶原蛋白。
由于其优点,通过使用根据本发明的方法纯化的胶原蛋白特别适于制造用于医学用途的产品。
因此,使用根据本发明的方法纯化的胶原蛋白以及其用于制造多孔海绵、纤维材料或膜的用途也是本发明的主题。
因此,本发明还涉及由纯化的海生胶原蛋白制备多孔海绵的方法。
多孔胶原蛋白海绵可以通过以下方法制备:通过剧烈的振动/搅拌使胶原蛋白溶液起泡后,或将胶原蛋白溶液中含有的空气在真空中除去后,将根据本发明的方法制得的溶液速冻并冻干,以制备具有较小孔隙的海绵。所述胶原蛋白溶液优选含有0.5~5重量%浓度的胶原蛋白。
通过使用冷冻胶原蛋白溶液或胶原蛋白泡沫的适当的模具,可以制备任何形状的多孔胶原蛋白泡沫。
具有进一步改善性质的胶原蛋白海绵,特别是考虑到其医学应用,可以通过在使它们冻干后酸处理胶原蛋白海绵而获得。用无机酸进行酸处理,优选将海绵浸渍在0.1N HCl溶液中。之后,可以通过速冻和冻干,或通过浸渍在乙醇中和空气干燥,使酸处理的海绵脱水。
采用根据本发明的制备胶原蛋白海绵的方法,还可以制备具有抗菌性质的多孔胶原蛋白海绵。为此,可以在速冻之前将抗菌活性物质加入到胶原蛋白悬浮液中。优选的抗菌活性物质为磺胺嘧啶银,相对于悬浮液中胶原蛋白的量,其以1重量%的量加入。
作为前述方法的替代,可以在酸处理后将多孔胶原蛋白泡沫浸渍在含有抗菌活性物质的溶液中。随后,可以通过冻干使胶原蛋白海绵脱水,或者如果抗菌活性物质不溶于乙醇中,通过浸渍在乙醇中和随后的空气干燥使胶原蛋白海绵脱水。
因此,本发明的另一主题是通过前述方法制备的多孔胶原蛋白海绵以及该海绵用于制造如伤口敷料的医学用途的产品的用途。
具体实施方式
实施例1
纯化海绵胶原蛋白的方法
将根据WO01/64046中描述的方法制得的在酸性介质(pH3)中沉淀出的胶原蛋白沉淀物,通过过滤与介质分离并在压力下拧出水,直到获得约84重量%的残余含水量。将如此制得的胶原纤维冻干以在约-20℃的温度储存。
将121g冷冻的胶原纤维悬浮在1300ml的0.5%(v/v)H2O2水溶液中,同时搅拌2小时。然后,用5N的NaOH溶液将溶液的pH调至12.4的值,以使胶原纤维溶解。将得到的胶原蛋白溶液过滤以除去不溶成分,然后倒入2600ml乙醇(浓度98%)中,同时剧烈搅拌。由此沉淀的胶原蛋白为白色或稍微淡黄色,并具有纤维状的外观。
通过过滤、在压力下拧出水或通过离心使胶原纤维无介质,随后均匀悬浮在300ml的0.5%(v/v)H2O2水溶液中,同时搅拌。用5N的HCl溶液将该溶液的pH调至6.5的值。在剧烈搅拌的同时进行pH的调节,以避免形成纤维沉淀。如此制得了具有2.8%胶原蛋白浓度的无菌胶原蛋白溶液。
所有的方法步骤在室温下进行,并且所有与胶原蛋白接触的物体在使用前用0.5重量%的H2O2溶液冲洗。
实施例2
使用纯化的海绵胶原蛋白制备多孔海绵
借助于Ultra Turrax高速分散机剧烈搅拌,使采用根据实施例1的方法制得的、具有2重量%的胶原蛋白浓度和6.5的pH值的海绵胶原蛋白溶液起泡沫。将胶原蛋白泡沫浇铸于由聚丙烯或聚苯乙烯制成的矩形模具中。泡沫层的高度在2和8mm之间变化。将胶原蛋白泡沫在-40℃下于模具中冷冻,然后冻干。
实施例3
基于沉淀的海绵胶原蛋白制备海绵
如实施例2中所述制备海绵胶原蛋白的多孔海绵。随后,通过浸渍在0.1N的HCl中将冻干海绵经过30分钟的酸处理。在该处理后,用蒸馏水重复洗涤海绵,直到除去最后的酸残留物。
将这些海绵在静止的湿润状态中冷冻,并通过冻干法干燥。
Claims (16)
1.纯化海生胶原蛋白的方法,包括以下步骤:
-将已在酸性介质中沉淀出的胶原蛋白沉淀物的含水量调至95~70重量%,
-将胶原蛋白悬浮在H2O2水溶液中,
-通过将胶原蛋白悬浮液的pH调至11~13的值使胶原蛋白溶解,
-用与水可混溶的有机溶剂使胶原蛋白沉淀出,
-滤出胶原蛋白,
-将沉淀出的胶原蛋白含水量调至95~70重量%,
-将胶原蛋白再悬浮于H2O2水溶液中,和
-将得到的胶原蛋白溶液的pH调至5~7的值。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,将所述水含量调至90~80重量%。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述H2O2水溶液具有0.1~1.0%(v/v),优选0.5%(v/v)的H2O2含量。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其特征在于,所述与水可混溶的有机溶剂选自包括乙醇和异丙醇的组。
5.一种海生胶原蛋白,其特征在于,其按照根据权利要求1~4中任一项所述的方法已被纯化。
6.根据权利要求1~4中任一项已纯化的海生胶原蛋白用于制备多孔海绵、纤维材料或膜的用途。
7.由按照根据权利要求1~4中任一项所述的方法纯化的海生胶原蛋白制备多孔海绵的方法,其特征在于:
-使海生胶原蛋白溶液起泡或在真空下除去海生胶原蛋白溶液中所含的空气,
-对起泡或脱气的胶原蛋白溶液进行速冻,和
-冷冻干燥速冻的胶原蛋白溶液。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述胶原蛋白溶液具有0.5~5重量%的胶原蛋白含量。
9.根据权利要求7或8所述的方法,其特征在于,在起泡或脱气之前将抗菌活性物质加入到胶原蛋白溶液中。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,相对于溶液的胶原蛋白含量,所述胶原蛋白溶液含有1重量%的量的抗菌活性物质。
11.根据权利要求7或8所述的方法,其特征在于,在其冷冻干燥之后,用无机酸,优选0.1N的HCl溶液处理所述胶原蛋白海绵,然后用水冲洗直到不再有任何可检测到的酸。
12.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,将用酸处理的海绵浸渍在抗菌活性物质的溶液中。
13.根据权利要求12所述的方法,其特征在于,在浸渍之后使海绵通过速冻和冻干而脱水,或通过浸渍在乙醇中和空气干燥而脱水。
14.根据权利要求9、10、12或13中任一项所述的方法,其特征在于,所述抗菌活性物质为磺胺嘧啶银。
15.一种海生胶原蛋白的多孔海绵,其特征在于,其根据权利要求7~14中任一项制得的。
16.根据权利要求7~14中任一项所述的方法制备的海生胶原蛋白的多孔海绵用于生产医用产品的用途。
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