ES2645089T3 - Procedimiento para la limpieza de colágeno marino, así como su transformación en esponjas porosas - Google Patents

Procedimiento para la limpieza de colágeno marino, así como su transformación en esponjas porosas Download PDF

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Abstract

Procedimiento para la limpieza de colágeno marino, que comprende los pasos: - ajustar el contenido de humedad de un precipitado de colágeno precipitado en un medio ácido a del 95 al 70 % en peso, - suspender el colágeno en una solución de H2O2 acuosa - solubilizar el colágeno mediante el ajuste del pH de la suspensión de colágeno a un valor de entre 11 y 13; - precipitar el colágeno con un disolvente orgánico que puede mezclarse con agua, - separar el colágeno mediante filtración, - ajustar el contenido de humedad del colágeno precipitado a del 95 al 70 % en peso, - resuspender el colágeno en una solución de H2O2 acuosa, y - ajustar el pH de la solución de colágeno resultante a un valor de entre 5 y 7.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento para la limpieza de colageno marino, as! como su transformacion en esponjas porosas
La presente invencion se refiere a un procedimiento para la limpieza de colageno marino, en particular para la mejora del olor y de la apariencia de colageno marino.
La invencion se refiere ademas de ello a un procedimiento para la produccion de esponjas porosas de colageno marino, las cuales son adecuadas en particular para fines medicos.
El colageno es una protelna biodegradable, como tambien biocompatible, la cual se usa como material de partida para multiples usos en la industria de la alimentacion, en la industria farmaceutica y cosmetica, as! como en la medicina.
Con “colageno marino” se entiende colageno que ha sido aislado de organismos marinos, es decir, que habitan en el mar, en particular de representantes de la cepa de las Porifera, preferentemente de Chondrosia reniformis.
Se conocen y se usan en la medicina muchos productos de colageno. Forman parte de estos productos por ejemplo, esponjas, fibras o membranas.
Estos productos se producen predominantemente a partir de colageno, el cual se obtiene del tejido conectivo, de la piel, de los huesos o de los tendones de mamlferos, por ejemplo, de vacuno, de caballos o de cerdos. Las desventajas esenciales de estos productos se ven en que
- habitualmente ha de servir como fuente para el colageno una crla para obtener una suficiente cantidad de colageno;
- el colageno obtenido es habitualmente soluble tanto en medios acidos, como tambien basicos, lo cual requiere una reaccion de reticulacion adicional (flsicamente mediante tratamiento termico o qulmicamente mediante el uso de substancias bifuncionales), para mejorar las propiedades mecanicas del colageno y su estabilidad en medios llquidos;
- existe el riesgo de una contamination con la encefalopatla espongiforme bovina (BSE).
Como alternativa a la obtencion de colageno de mamlferos se describe en el documento WO 01/64046 un procedimiento para el aislamiento de colageno de esponjas marinas del genero Chondrosia reniformis (Porifera, Demospongiae).
En este procedimiento se coloca material de esponja de partida fresco en alcohol, a continuation se lava con agua y se mezcla con un medio de extraction, preferentemente con un valor de pH de 7 - 12. El extracto de colageno resultante se prepara mediante el aumento del pH de la suspension a un valor de 8 - 11, agitation, centrifugado, posterior reduction del valor de pH del sobrenadante, as! como centrifugado y aislamiento del precipitado.
El colageno de esponja que se obtiene con este procedimiento presenta sin embargo desventajas, las cuales consisten esencialmente en que
- la solution de colageno tiene una apariencia sucia,
- el colageno no es puro microbiologicamente, y
- los productos de este colageno de esponja presentan un olor desagradable.
La tarea en la cual se basa la presente invencion se baso en dejar de lado las desventajas mencionadas de colageno marino y en poner a disposition colageno de organismos marinos que sea adecuado tambien para la produccion de productos para fines medicos.
La tarea se soluciona mediante un procedimiento en el cual se limpia un precipitado de colageno mediante pasos de tratamiento qulmicos y se mejora debido a ello su olor y su apariencia. El colageno purificado puede transformarse a continuacion mediante liofilizacion en esponjas porosas.
Segun la presente invencion el procedimiento para la limpieza de colageno marino comprende el tratamiento de un precipitado de colageno, como puede ser obtenido por ejemplo segun el procedimiento descrito en el documento WO 01/64046, con peroxido de hidrogeno en soluciones acuosas con diferentes valores de pH.
Para este fin deberla ajustarse en primer lugar la humedad del precipitado de colageno a un contenido del 70 al 95 % en peso, preferentemente a un contenido del 80 al 90 % en peso. Esto puede producirse mediante escurrido del precipitado de colageno mediante presion o una centrifugation para reducir el contenido de humedad del precipitado de colageno en caso necesario al contenido deseado.
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El precipitado de colageno se suspende entonces en una solucion de R2O2 acuosa, la cual presenta un contenido de H2O2 de 0,1 a 1 % (v/v), de forma preferente de 0,5 % (v/v). Se ajusta entonces el pH de la suspension de colageno a un valor de entre 11 a 13. De esta manera el colageno pasa a solucion.
Tras la incubacion del colageno con H2O2 en condiciones alcalinas se filtra la solucion de colageno para eliminar componentes no solubles. Tras ello se precipita el colageno de la solucion, en cuanto que se anade a la solucion un disolvente adecuado organico que puede ser mezclado con agua.
El precipitado de colageno se filtra y vuelve a ajustarse su contenido de humedad a 70 - 95 % en peso, preferentemente 80 a 90 % en peso. A continuacion se disuelve el colageno nuevamente en una solucion de H2O2 acuosa, la cual presenta un contenido de H2O2 de 0,1 a 1 % (v/v), de forma preferente de 0,5 % (v/v), y se ajusta el pH de esta solucion de colageno a un valor de entre 5 a 7, de manera que el colageno puede usarse entonces para la produccion de esponjas, membranas o fibras para fines medicos.
El ajuste del pH a un valor de entre 11 a 13 se produce preferentemente con NaOH, puede producirse no obstante tambien con otros hidroxidos alcalinos o alcalinoterreos, como por ejemplo, KOH, Ca(OH)2 o Mg(OH)2.
Como disolvente organico que puede ser mezclado con agua se prefieren etanol e isopropanol. La precipitacion del colageno se produce de forma preferente con una proportion de agua con respecto a etanol que se encuentra entre 1:2 y 1:3.
La neutralization de la solucion de colageno a pH de 5 a 7 puede producirse mediante reduction del valor de pH mediante adicion de acidos organicos, por ejemplo, acido formico, acido acetico, acido cltrico, acido ascorbico, acido propionico, acido lactico o acidos inorganicos como acido clorhldrico, acido fosforico o acido sulfurico. Preferentemente el valor de pH se ajusta mediante adicion de 5 N de acido clorhldrico.
Las ventajas del procedimiento segun la invention son
- un alto rendimiento en la extraction de protelna;
- un colageno esteril, el cual esta libre de bacterias;
- un colageno libre de BSE, dado que las Porifera no tienen estructuras de nervios,
- un colageno con una apariencia atractiva, que no parece estar sucio,
- un colageno sin olor desagradable;
- un colageno no soluble en medios acidos, en cuyo caso no es necesaria una reaction de reticulation adicional para mejorar sus propiedades mecanicas y estabilidad en llquidos;
- un colageno el cual puede usarse para la produccion de vendajes para la sanation de heridas o como soporte para la regeneration de tejido.
Debido a estas ventajas el colageno limpiado con el procedimiento segun la invencion se adecua particularmente bien para la produccion de productos para fines medicos.
Son por tanto tambien objetivo de la invencion el colageno limpiado con el procedimiento segun la invencion, as! como su uso para la produccion de esponjas porosas, material fibroso o membranas.
La invencion se refiere por lo tanto tambien a un procedimiento para la produccion de esponjas porosas a partir del colageno marino limpiado.
Las esponjas de colageno porosas pueden producirse mediante un procedimiento en el cual se congela y se liofiliza una solucion del colageno marino obtenida por el procedimiento segun la invencion, despues de que la solucion de colageno o bien se haya espumado mediante fuerte sacudida o agitation o se haya eliminado mediante vacio el aire contenido en la solucion de colageno, para obtener esponjas con poros mas pequenos. La solucion de colageno contiene colageno preferentemente en una concentration de 0,5 a 5 % en peso.
Mediante el uso de correspondientes formas, en las cuales se congela la solucion de colageno o la espuma de colageno, pueden producirse esponjas de colageno porosas con forma cualquiera.
Las esponjas de colageno con propiedades mejoradas, en particular en lo que se refiere a su uso medico, pueden lograrse mediante un tratamiento acido de las esponjas de colageno, despues de que se hayan liofilizado. El tratamiento acido se produce mediante acidos inorganicos, preferentemente mediante inmersion de la esponja en una solucion de 0,1 N de HCI. Despues de ello la esponja tratada con acido puede deshidratarse mediante congelation y liofilizacion, o mediante inmersion en etanol y secado al aire.
Con el procedimiento segun la invencion para la produccion de esponjas de colageno pueden producirse tambien esponjas de colageno porosas con propiedades antimicrobianas. Para ello puede anadirse a la suspension de colageno antes de la refrigeration una substancia de eficacia antimicrobiana. Una substancia de eficacia antimicrobiana es sulfadiazina de plata, que se anade en una cantidad de 1 % en peso, referido a la cantidad de
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colageno en la suspension.
De manera alternativa al modo de proceder anterior, las esponjas de colageno porosas pueden sumergirse tras el tratamiento acido en una solucion con una substancia de eficacia antimicrobiana. A continuation, la esponja de colageno puede deshidratarse mediante liofilizacion o, siempre y cuando la substancia de eficacia antimicrobiana no sea soluble en etanol, mediante inmersion en etanol y posterior secado al aire.
Son por lo tanto tambien objetivo de la invention las esponjas de colageno porosas producidas con el procedimiento que se ha mencionado anteriormente y su uso para la production de productos para fines medicos como por ejemplo, apositos.
Ejemplo 1
Procedimiento para la limpieza de colageno de esponja
Un precipitado de colageno precipitado en un medio acido (pH 3), el cual se obtuvo segun el procedimiento descrito en el documento WO 01/64046, se separo del medio mediante filtration y se escurrio mediante presion hasta que se alcanzo un contenido de humedad restante de aproximadamente 84 % en peso. Las fibras de colageno obtenidas de este modo se congelaron para el almacenamiento a una temperatura de aproximadamente -20 °C.
Se suspendieron 121 gramos de las fibras de colageno congeladas mediante agitation durante dos horas en 1300 ml de una solucion de H2O2 acuosa del 0,5 % (v/v). Entonces se ajusto el pH de la solucion mediante una solucion de 5 N de NaOH a un valor de 12,4 para lograr una solucion de las fibras de colageno. La solucion de colageno resultante se filtro para eliminar componentes no solubles y a continuacion se rego con 2600 ml de etanol (concentration 98 %) bajo fuerte agitacion. El colageno precipitado de esta manera presento un color blanco o ligeramente amarillo, as! como una apariencia fibrosa.
Las fibras de colageno se liberaron mediante filtracion del medio, se escurrieron mediante aplicacion de presion o mediante centrifugation y a continuacion se suspendieron de forma homogenea bajo agitacion en 300 ml de una solucion de H2O2 acuosa del 0,5 % (v/v). El pH de la suspension se ajusto con una solucion de 5 N de HCI a un valor de 6,5. El ajuste del valor de pH se produjo mediante una fuerte agitacion para evitar la formation de precipitados de fibras. De esta manera se obtuvo una solucion de colageno esteril con una concentracion de colageno de 2,8 % en peso.
Todos los pasos de procedimiento se llevaron a cabo a temperatura ambiente y todos los objetos, los cuales entraron en contacto con el colageno, se limpiaron antes de su uso con una solucion de H2O2 del 0,5 %.
Ejemplo 2
Produccion de esponjas porosas con colageno de esponja limpiado
Una solucion de colageno de esponja con una concentracion de colageno de 2 % en peso y un valor de pH de 6,5 que se obtuvo segun un procedimiento segun el ejemplo 1, se espumo mediante agitacion fuerte con ayuda de un Ultra Turrax. La espuma de colageno se vertio en un molde rectangular de polipropileno o poliestireno. Las alturas de las capas de espuma variaron entre 2 y 8 mm. La espuma de colageno se congelo en el molde a - 40 °C y a continuacion se liofilizo.
Ejemplo 3
Produccion de esponjas a base de colageno de espuma precipitado
Se produjeron esponjas porosas a partir de colageno de esponja tal como se describe en el ejemplo 2. A continuacion se suministraron las esponjas liofilizadas a un tratamiento acido de 30 minutos mediante inmersion en una solucion de 0,1 N de HCI. Tras este tratamiento se lavaron las esponjas repetidamente con agua destilada hasta que se eliminaron los ultimos restos de acido.
Estas esponjas se congelaron en estado aun humedo y se secaron mediante liofilizacion.

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    REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento para la limpieza de colageno marino, que comprende los pasos:
    - ajustar el contenido de humedad de un precipitado de colageno precipitado en un medio acido a del 95 al 70 % en peso,
    - suspender el colageno en una solucion de H2O2 acuosa
    - solubilizar el colageno mediante el ajuste del pH de la suspension de colageno a un valor de entre 11 y 13;
    - precipitar el colageno con un disolvente organico que puede mezclarse con agua,
    - separar el colageno mediante filtracion,
    - ajustar el contenido de humedad del colageno precipitado a del 95 al 70 % en peso,
    - resuspender el colageno en una solucion de H2O2 acuosa, y
    - ajustar el pH de la solucion de colageno resultante a un valor de entre 5 y 7.
  2. 2. Procedimiento para la fabricacion de esponjas porosas de colageno marino, comprendiendo los pasos:
    - ajustar el contenido de humedad de un precipitado de colageno precipitado en un medio acido a del 95 al 70 % en peso,
    - suspender el colageno en una solucion de H2O2 acuosa
    - solubilizar el colageno mediante el ajuste del pH de la suspension de colageno a un valor de entre 11 y 13;
    - precipitar el colageno con un disolvente organico que puede mezclarse con agua,
    - separar el colageno mediante filtracion,
    - ajustar el contenido de humedad del colageno precipitado a del 95 al 70 % en peso,
    - resuspender el colageno en una solucion de H2O2 acuosa, y
    - ajustar el pH de la solucion de colageno resultante a un valor de entre 5 y 7,
    - espumar la solucion de colageno resultante o eliminar mediante vaclo el aire contenido en la solucion del colageno resultante,
    - congelar la solucion de colageno espumada o desgasificada; y
    - liofilizar la solucion de colageno congelada.
  3. 3. Procedimiento segun las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que el contenido de humedad se ajusta a del 90 al 80 % en peso.
  4. 4. Procedimiento segun una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la solucion de H2O2 acuosa presenta un contenido de H2O2 del 0,1 al 1,0 % (v/v), preferentemente del 0,5 % (v/v).
  5. 5. Procedimiento segun una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el disolvente organico que puede mezclarse con agua se elige del grupo que comprende etanol e isopropanol.
  6. 6. Procedimiento segun la reivindicacion 2, caracterizado por que la solucion de colageno presenta un contenido de colageno del 0,5 al 5 % en peso
  7. 7. Procedimiento segun las reivindicaciones 2 o 6, caracterizado por que a la solucion de colageno se le anade antes del espumado o de la desgasificacion una substancia activa antimicrobiana.
  8. 8. Procedimiento segun la reivindicacion 7, caracterizado por que la solucion de colageno comprende la substancia activa antimicrobiana en una cantidad de un 1 % en peso, referido al contenido de colageno de la solucion.
  9. 9. Procedimiento segun las reivindicaciones 2 o 6, caracterizado por que la esponja de colageno se trata tras su liofilizacion con un acido inorganico, preferentemente con una solucion de HCI al 0,1 N y tras ello se lava con agua hasta que ya no pueda detectarse acido.
  10. 10. Procedimiento segun la reivindicacion 9, caracterizado por que la esponja tratada con acido se sumerge en la solucion de una substancia de accion antimicrobiana.
  11. 11. Procedimiento segun la reivindicacion 10, caracterizado por que la esponja tras la inmersion se deshidrata mediante congelation y liofilizacion, o mediante inmersion en etanol y secado al aire.
  12. 12. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 7, 8, 10 u 11, caracterizado por que en el caso de la substancia activa antimicrobiana se trata de sulfadiazina de plata.
  13. 13. Esponja porosa de colageno marino, caracterizada por que se fabrico segun un procedimiento segun una de las reivindicaciones 2 a 12.
  14. 14. Uso de una esponja porosa de colageno marino, la cual se fabrico segun un procedimiento segun una de las reivindicaciones 2 a 12, para la fabricacion de productos medicos.
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