KR20140122231A

KR20140122231A - 고밀도 키토산 막 재료의 조성, 제조, 그리고 용도

Info

Publication number: KR20140122231A
Application number: KR20147020524A
Authority: KR
Inventors: 아서 에이. 데카를로; 에이프릴 엘리스; 토마스 피. 둘리; 마리아 벨로우소바
Original assignee: 아젠타 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드
Priority date: 2011-12-22
Filing date: 2012-12-19
Publication date: 2014-10-17
Also published as: IL233290A0; EP2793908A4; EP2793908A1; BR112014015444A2; CN104144692A; JP2015511214A; WO2013096448A1

Abstract

비정상적으로 고밀도 키토산 조성물 및 상기 고밀도 키토산 구조를 만드는 새로운 방법이 설명되었다. 상기 신규한 생산 방법은 중화된 키토산 중합체에 압착과 진공을 동시에 이용하여 비정상적으로 고밀도 키토산 필름 또는 막 재료가 만들어진다. 상기 고밀도 키토산 필름 또는 막 조성물은 동물, 포유류, 또는 인간에서 또는 동물, 포유류 또는 인간 안에서 다양한 의학 용도에 다수의 물리적 그리고 임상적으로 끌리는 품질을 보유한다.

Description

고밀도 키토산 막 재료의 조성, 제조, 그리고 용도{COMPOSITION, PREPARATION, AND USE OF DENSE CHITOSAN MEMBRANE MATERIALS}

본 발명은 고밀도 키토산 필름 또는 막 재료 및 이들의 제조 방법에 관계한다. 이들 재료는 의료, 과학, 그리고 기타 산업에서 유용성을 갖는다.

기능성 생물재료 연구는 상처 치유와 조직 공학을 위한 개선된 스카폴드의 개발을 향해 지향되고 있다. 다수의 생물분해성 중합체가 상처 치유와 조직 공학 적용을 위한 스카폴드로서 탐구되었고, 그리고 합성 중합체, 예를 들면, 폴리-카프로락톤, 폴리(락트산-코-글리콜산), 폴리(에틸렌 글리콜), 그리고 자연 중합체, 예를 들면, 알기네이트, 젤라틴, 콜라겐, 전분, 그리고 키토산을 포함한다. 이들 중에서 특히, 자연적으로 유래된 중합체가 생명 구조의 자연 성분으로서, 자연 조직에 대한 생물학적 및 화학적 유사성으로 인하여 특히 관심된다. 이러한 배경에서, 키토산은 항균, 항진균, 그리고 지혈 성질 이외에, 생체적합성, 무해한 당류 산물로 생물분해성, 비독성, 생리학적 비활성, 단백질에 대한 현저한 친화성을 비롯한 독특한 생물학적 성질과 함께, 넓은 스펙트럼의 적용에서 매력적인 후보로서 밝혀졌다.

키토산의 기록된 사용은 19세기로 거슬러 올라가는데, 이때 Rouget는 1859년에 키토산의 탈아세틸화된 형태를 논의하였다. 키토산에 대한 공급원 재료인 키틴 (chitin)은 생합성에 의해 연간 생산되는 양에서 셀룰로오스를 제외하고, 가장 풍부한 유기 재료 중의 한 가지이다. 이것은 동물, 특히 갑각류, 연체동물 및 곤충에서 외골격의 중요한 구성요소이다. 이것은 또한, 일정한 진균의 세포 벽에서 주요한 섬유성 중합체이고, 그리고 미세조류에 의해 생산될 수 있다. 탈아세틸화된 키틴 유도체는 "키토산"으로 지칭되었다. 이들 두 용어가 1800년대에 처음 이용되었을 때, 키틴과 키토산은 자연 상태에서 항상 분명하고, 충분히 정의되고, 독특하고, 그리고 불변하는 화학종으로서 발생하는 것으로 생각되었는데, 키틴은 완전하게 아세틸화되고, 그리고 키토산은 완전하게 탈아세틸화된 조성물이었다. 하지만, 용어 "키틴"과 "키토산"이 실제로, 분명히 규정되지 않은 것으로 밝혀진 것은 대략 한 세기 이후이었다. 이들 용어는 충분히 규정된 화합물을 지칭하기 보다는 실제로는, 폭넓게 상이한 물리적 화학적 성질을 보이는 화합물의 패밀리를 지칭한다. 이들 차이는 산물의 다양한 분자량 및 다양한 정도의 아세틸화에 기인한다.

키토산은 β(1-4) 글리코시드 결합에 의해 연결된 글루코사민과 N-아세틸 글루코사민 단위 - 본질적으로, 당 단위의 스트링으로 구성되는 선형 다당류이다. 공급원 및 제조 절차에 따라, 이의 분자량은 일반적으로, 10 kDa 내지 1000 kDa 이상의 범위에서 변한다. 키토산 중합체의 분자량은 점도에 의해 일과적으로 결정되고, 센티푸아즈(Centipoise. CPS) 또는 밀리파스칼(Millipascal, mPas) 단위로 표시되고, 그리고 약 5 mPas 내지 3000 mPas 범위에서 변할 수 있다. 글루코사민의 함량은 탈아세틸화(DD)의 정도로서 명명되고, 그리고 30% 내지 95% 범위에서 변할 수 있다. 결정질 형태에서, 키토산은 pH 7 초과의 수성 용액에서 정상적으로 불용성이지만, 희산(pH < 6.0)에서 글루코사민 상에서 양성화된 유리 아미노 기는 분자의 용해성을 용이하게 한다 (Kim, Seo et al. 2008). 일반적으로, 키토산은 C(2), C(3), 그리고 C(6) 위치 각각에서, 3가지 유형의 반응성 기능 기, 아미노 기뿐만 아니라 일차와 이차 하이드록실 기 둘 모두를 갖는다. 이들 기는 특정 적용을 위한 키토산의 변형을 허용하고, 이것은 조직 공학 적용을 위한 다양한 유용한 스카폴드를 생산할 수 있다. 키토산의 화학적 성질은 차례로, 기계적 성질과 생물학적 성질의 광범위한 조정을 허용하는 공유와 이온 변형을 위한 많은 가능성을 제공한다.

키틴 처리

전술한 바와 같이, 키틴은 다수의 분류학적 그룹 내에 존재한다. 하지만, 상업적인 키틴은 통상적으로, 해양 갑각류, 예를 들면, 새우로부터 분리된다. 갑각류 껍질은 30-40% 단백질, 30-50% 탄산칼슘, 그리고 20-30% 키틴으로 구성되고, 또한 지질 성질의 색소, 예를 들면, 카로티노이드(아스타크산틴, 아스타틴, 칸타크산틴, 루테인 및 β-카로틴)를 내포한다. 이들 비율은 종마다, 그리고 계절마다 변한다.

키틴이 탄산칼슘을 용해시키는 산 처리, 그 이후에 단백질을 변성하고 용해시키는 알칼리성 추출 및 탈색소 단계에 의해 추출될 때, 아스타크산틴을 제거함으로써 무색 내지 회백색 산물이 주로 획득된다. 제조 방법은 시료 특징에 영향을 주는 인자이다. 초기 연구는 이들 산물의 특정한 특징(Mw, DD)이 공정 조건에 의존한다는 것을 분명하게 증명하였다. 전형적으로, 하지만, 상업적인 키틴은 단백제거의 첫 번째 단계, 그 이후에 탈염의 두 번째 단계에 의해 제조된다. 이들 조건에서, 키틴의 고유 구조가 상실되는 "붕괴된 키틴"이 추출된다. 다른 한편, 고유 사슬과 섬유성 구조가 본래이고 안정화되는 "조밀한 키틴"은 탈염이 첫 번째 단계에서 발생했을 때 추출된다. 키토산 추출의 어느 한쪽 방법에 의해 제조된 키토산이 본 발명에 적용된다. 게다가, 본 발명은 자연, 반-합성, 또는 합성 공급원으로부터 키토산의 공급원을 한정하지 않는다.

키토산으로 키틴 탈아세틸화

키토산은 키틴의 아세트아미드 기의 가수분해에 의해 제조된다. 이것은 통상적으로, 당 고리 내에 C2-C3 치환기의 트랜스 정렬(trans arrangement)에 의해 강제된 이런 기의 저항으로 인하여, 혹독한 알카리성 가수분해 처리에 의해 수행된다 (Horton and Lineback 1965). 강한 수성 알카리성 하에 키틴의 열 처리는 통상적으로, 키토산으로서 간주되는 부분적으로 탈아세틸화된 키틴(70%보다 높은 DD)을 제공하기 위해 필요하다. 통상적으로, 나트륨 또는 수산화 칼륨이 높은 온도(100 ℃)에서 30-50% w/v의 농도에서 이용된다. 이러한 가혹한 수산화물/가열 방법은 잠재적인 세균 내독소를 감소시키거나 제거하는 동시 효과(coincident effect)를 갖고, 이것은 결과의 키토산 재료의 생물의학적 적용에 유익하다.

키토산 DD는 키틴 공급원 및 키토산 제조의 방법에 따라 56%-99% 범위에서 변할 수 있다 (Abou-Shoer 2010). 탈아세틸화의 정도에 영향을 주는 인자에는 알칼리의 농도, 전처리, 입자 크기 및 키틴의 밀도가 포함된다. 실제로, 단일 알칼리성 처리에서 달성될 수 있는 최대 DD는 약 75-85% (Roberts 1998)이다. 일반적으로, 탈아세틸화 동안, 조건은 합리적인 시간 내에 키틴을 탈아세틸화시켜 희석된 아세트산에서 (차후) 용해할 수 있는 키토산을 산출하는데 적절한 조건이어야 한다. 키토산의 미세한 구조에 대한 다른 무엇보다 중요한 인자는 DD 값의 화학적 다중분산(chemical polydispersion)이라는 것이 명백해졌다 (Roberts 1998). 키토산 탈아세틸화 동안, 중합성 사슬의 분해가 일어난다. 낮은 DD(75-85%)를 갖는 키토산 스카폴드는 더욱 규칙적인 구조를 보였고, 그리고 구멍이 상당히 균일하고 다각형 횡단면과 평행하였다 (Tigli and Gumusderelioglu 2008). 측면 구멍 연결성(lateral pore connectivity)은 높은 탈아세틸화 정도(>85%)를 갖는 스카폴드의 경우에 훨씬 낮다. 팽창 연구 역시 수행되었지만 DD와 팽창 비율 사이에 어떤 상관관계도 발견되지 않았다. 키토산 스카폴드의 기계적 검사는 기계적 강도가 더욱 높은 DD에서 더욱 높다는 것을 증명하였다. 스카폴드의 생물분해성 역시 DD에 의존한다.

키토산 탈중합화

일정한 적용에서 키토산의 이용에서 주요한 제한은 이의 높은 점도 및 중성 pH에서 낮은 용해성이다. 낮은 Mw 키토산과 올리고머는 중합체 사슬의 가수분해에 의해 제조될 수 있다. 일부 특정한 적용의 경우에, 이들 더욱 작은 분자는 훨씬 유용한 것으로 밝혀졌다. 키토산 탈중합화는 화학적으로, 효소적으로, 또는 물리적으로 수행될 수 있다. 화학적 탈중합화는 HCl을 이용한 산 가수분해에 의해 또는 HNO₂와 H₂O₂를 이용한 산화 반응에 의해 주로 수행된다. 이것은 HNO₂가 탈아세틸화된 글루코사민 단위의 아미노 기를 공격하고, 인접한 글리코시드 연쇄가 차후 개열된다는 의미에서, 특이적인 것으로 밝혀졌다 (Prashanth and Tharanathan 2007). 효소적 탈중합화의 경우에, 높은 물 용해성을 갖는 낮은 분자량 키토산은 여러 효소, 예를 들면, 키틴분해효소, 키토산분해효소, 글루코나아제 및 일부 프로테아제에 의해 생산되었다. 키토산을 탈중합시킬 수 있는 리소자임, 셀룰라아제, 리파아제, 아말리아제와 펙티나아제를 비롯한 비특이적 효소는 알려져 있다. 이러한 방식으로, 온화한 조건 하에 위치선택성 탈중합화가 허용된다 (Aranaz, Mengibar et al. 2009).

키토산의 Mw와 이의 팽창 거동 사이에는 상관관계가 없다 (Roldo, Hornof et al. 2004; El-Kamel, Ashri et al. 2007). 인장 강도(TS), 신장 백분율(% EB) 및 탄성 계수(EM)는 필름의 강도와 탄력성을 지시하는 중요한 파라미터이다. 얇은 필름 또는 막에 대한 물리적 파라미터의 평가를 위한 ASTM 국제 표준 검사 방법이 확립되었다 (ASTM 2002; ASTM 2006). 중간 Mw 키토산 필름은 TS와 EM에 대한 최대값을 갖고, 높은 Mw와 낮은 Mw 키토산 필름이 그 뒤를 이었다 (El-Kamel, Ashri et al. 2007). 다른 한편, 최대 % EB는 낮은 Mw 키토산 필름에서 획득되고 높은 Mw와 중간 Mw 키토산 필름이 그 뒤를 이었다.

구멍 변동의 효과

키토산-기초된 스카폴드의 기계적 성질은 구멍 크기와 구멍 방향에 의존한다. 키토산은 키토산 용액을 냉동하고 동결 건조시킴으로써, 또는 CaCO₃가 적절한 틀을 이용함으로써 키토산-CaCO₃ 겔을 특정한 형상으로 산출하기 위해 키토산 용액에 첨가되는 "내부 발포 공정(internal bubbling process, IBP)" 과 같은 공정에 의해 상호 연결된-다공성 구조로서 형성될 수 있다 (Chow and Khor 2000). 수화된 시료의 인장 검사는 다공성 키토산 막이 비-다공성 키토산 막(5-7 MPa)과 비교하여 훨씬 감소된 탄성 계수 (0.1 - 0.5 MPa, 여기서 메가파스칼 단위 = N/mm²)를 갖는다는 것을 증명한다. 다공성 막의 확장성(최대 변형)은 비-다공성 키토산과 유사한 값(대략 30%)에서 구멍 크기와 방향 둘 모두의 함수로서 100% 이상으로 변하였다. 다공성 막은 2가지 상이한 영역: 낮은 변형에서 저-계수 영역 및 높은 변형에서 2-3배 높은 계수로 이전을 갖는 복합 재료의 전형적인 응력-변형 곡선을 보였다. 이들 다공성 구조의 인장 강도는 보고된 바로는, 30-60 kPa의 범위 내에 있다 (Madihally and Matthew 1999).

Chen과 Hwa는 키토산 막의 기계적 성질에 대한 이용된 키토산의 분자량과 이들의 결정도의 효과를 보고하였다 (Chen and Hwa 1996). 다시 말하면, 이용된 키토산의 분자량이 낮을수록, 양자 얽힘(entanglement difference)의 가능성으로 인하여 제조된 키토산 막의 인장 강도가 더욱 낮아진다. 다시 말하면, 더욱 낮은 분자량 키토산의 이용은 더욱 적은 얽힘을 발생시킨다. 키토산의 결정도 차이는 다른 인자에 기인될 수 있다. 이용된 키토산의 분자량이 낮을수록, 결과의 막의 엔탈피가 더욱 낮아진다. 이들은 막의 더욱 낮은 인장 강도가 키토산의 낮은 분자량으로부터 제조된 키토산 막에서 더욱 적은 결정도의 결과라는 것을 암시하였다.

생물분해성

키토산은 포유류로부터 부재하지만 여러 효소, 그 중에서도 특히 리소자임, 키틴분해효소, 그리고 NAGase에 의해 생체내에서 분해될 수 있다 (Dallan, da Luz Moreira et al. 2007; Kim, Seo et al. 2008) (Aranaz, Mengibar et al. 2009) (Niekraszewicz 2005). 생물분해는 가변 길이의 비-독성 올리고당류의 방출을 유발하고, 이들은 차후에, 글리코사미노글리칸과 당단백질로 통합되거나, 대사 경로로 통합되거나, 또는 배설될 수 있다. 포유동물 조직 내에 존재하고 선천성 면역(innate immunity)에 관여하는 비특이적 글리코시드 가수분해효소인 리소자임은 키틴과 키토산에서 중요한 분해 역할을 수행하는 것으로 보인다. 분해 동역학(degradation kinetics)은 DD에 의해 주로 제어되는 결정도의 크기에 역으로 관련되는 것으로 보인다. 게다가, 아세틸 기의 분포 역시 생물분해성에 영향을 주는데, 그 이유는 아세틸 기의 흡수 또는 이들의 균질한 분포(블록이기 보다는 무작위)가 효소 분해의 매우 낮은 속도를 유발하기 때문이다.

최종적으로, 여러 연구에서 사슬의 길이(Mw) 역시 분해 속도에 영향을 주는 것으로 보고되었다. 키토산-기초된 재료와 의료 장치의 분해 속도의 이해와 제어는 많은 관심을 받고 있는데, 그 이유는 분해가 많은 작고 큰 분자 방출 적용에서 및 기능성 조직 재생 적용에서 필수적이기 때문이다. 일정한 용도에서, 스카폴드 분해의 속도는 새로운 조직 형성의 속도를 반영하거나 또는 생물활성 분자(가령, 자연 화합물, 약제, 생물물질, 핵산, 백신, 그리고 면역 효과물질)의 제어된 방출에 적합해야 한다. 따라서 각 재료가 분해되는 기전과 속도 둘 모두를 이해하고 제어하는 것이 중요하다.

분해 속도는 또한, 생체적합성에 영향을 주는데, 그 이유는 매우 빠른 분해 속도가 경미한 염증 반응을 발생시킬 수 있는 아미노 당을 해방(그리고, 잠재적으로 축적)할 것이기 때문이다. 낮은 DD를 갖는 키토산 시료는 더욱 급성 염증 반응을 유도하는 반면, 높은 DD를 갖는 키토산 시료는 낮은 분해 속도로 인하여, 최소 반응을 유도한다. 분해는 DD가 감소함에 따라서 증가하는 것으로 밝혀졌다. 다시 말하면, 일반적으로, 분해는 증가된 아세틸화에 의해 증강된다 (Lim, Song et al. 2008). Kofuji 등은 리소자임의 존재에서 키토산 용액의 점도에서 변화를 관찰함으로써 다양한 키토산의 효소 거동(enzymatic behavior)을 조사하였다 (Kofuji, Qian et al. 2005). 이들은 낮은 DD를 갖는 키토산이 더욱 빠르게 분해하는 경향이 있다는 것을 발견하였다. 하지만, 다른 저자들은 분해에서 차이가 키토산 분자 내에 아세트아미드 기의 분포에서 변동에 기인한다고 보고하였다. 이것은 분자간 또는 분자내 척력(repulsion force)을 변화시킴으로써 키토산 용액의 점도에 영향을 주는 탈아세틸화 조건에서 차이로 인하여 발생한다. 이런 이유로, DD 단독으로부터 생물분해 속도를 산정하는 것은 불가능한 것으로 결론될 수 있다.

생체적합성

키토산은 매우 우수한 생체적합성을 보이지만, 이러한 성질은 시료의 특징(가령, 자연 공급원, 제조 방법, Mw 및 DD)에 의존한다. 비록 소화(구강/위장) 효소가 키토산을 부분적으로 분해할 수 있긴 하지만, 이것은 경구 투여될 때 흡수되지는 않는다. 이런 이유로, 키토산은 경구 루트에 의한 생물학적이용효율이 없는 것으로 간주된다. 키토산은 생쥐에서, 매우 높은 용량인 약 16g/kg의 LD50을 갖고 미미한 급성 독성을 일관한다. 키토산의 독성은 DD에 좌우되는 것으로 보고된다. Schipper 등은 35% 이상의 DD를 갖는 키토산이 낮은 독성을 보이는 반면, 35% 미만의 DD(즉, 키틴)는 용량-의존성 독성을 유발한다고 보고하였다 (Schipper, Varum et al. 1996). 다른 한편, 키토산의 Mw는 독성에 영향을 주지 않았다 (Schipper, Varum et al. 1996).

키토산의 세포적합성(cytocompatibility)은 심근, 내피와 상피 세포, 섬유아세포, 간세포, 연골세포, 그리고 케라틴생성세포로 시험관내에서 증명되었다 (Aranaz, Mengibar et al. 2009). 이러한 성질은 시료의 DD에 관련되는 것으로 보인다. 중합체의 양성 전하가 증가할 때, 키토산과 이들 세포 간에 상호작용 역시 유리 아미노 기의 존재로 인하여 증가한다. 상이한 DD를 갖는 여러 키토산 필름에서 케라틴생성세포와 섬유아세포의 부착과 증식은 DD 및 세포 유형 둘 모두에 의존한다. 양쪽 세포에서, 세포 부착의 백분율은 DD에 강하게 의존하고, 상기 파라미터에 비례하여 증가하였다. 세포의 유형은 부착에도 영향을 주고, 케라틴생성세포보다 더욱 많은 음성 전하 표면을 나타내는 섬유아세포에 더욱 유리한 인자이다. 다른 한편, 증식은 DD를 증가시킴으로써 상당히 감소하였다. 이런 이유로, 상처 치유와 생물학적 적용에서 세포 부착과 세포 증식의 균형은 적절한 DD를 필요로 한다.

상이한 Mw 키토산을 내포하는 키토산 필름은 상이한 부착력을 갖지만, 통계학적 분석은 필름 간에 생물부착력에서 유의미한 차이가 없다는 것을 드러냈다. 대조적으로, Roldo 등은 중간 Mw 키토산의 최대 탈립력(detachment force)이 낮은 Mw 키토산과 높은 Mw 키토산 둘 모두의 것보다 높다는 것을 증명하였다 (Roldo, Hornof et al. 2004).

잔여 단백질을 갖는 불순한 키틴과 키토산은 일부 개체에서 알레르기 반응, 예를 들면, 과민증을 유발할 수 있다. 시료 내에 단백질 함량은 시료의 공급원, 그리고 특히, 제조 방법에 좌우된다. 전술한 바와 같이 제조될 때(가령, 산, 그 이후에 강한 염기 + 가열), 정제된 키토산은 비-알레르기성이다. 인간 개체군의 0.2-0.3 퍼센트가 해양 갑각류에 대한 알레르기를 나타내긴 하지만 (Osterballe, Hansen et al. 2005; Osterballe, Mortz et al. 2009), 키토산에 대한 권위자, Dr. Riccardo Muzzarelli로부터 하기 결론이 도출되었다:

현재, 키틴을 알레르기원 물질로서 해석하는 것은 현명하지 못하며, 더욱 많은 임상 연구와 유전자 연구가 필요하다. 게, 작은 새우, 참새우와 랍스터 키틴뿐만 아니라 일단 정제되면, 모든 등급의 키토산은 "갑각류 유도체"로서 간주되지 않아야 하는데, 그 이유는 분리 절차가 기원과 상관없이 단백질, 지방 및 기타 오염물질을 화학물질로서 분류할 수 있도록 허용할 정도까지 이들을 제거했기 때문이다. [(Muzzarelli 2010) p. 305]

주요한 작은 새우 알레르겐은 근육 단백질 트리포미오신으로서 확인되었다 ... 작은 세포-유래된 글루코사민은 심지어, 트리포미오신에 과민한 개체에게도 안전하다. Villacis 등은 다양한 제조업체로부터 글루코사민 보충제가 임상적으로 유관한 수준의 알레르겐을 내포하지 않는다고 진술한다 [76]. Gray 등은 "갑각류 알레르기는 껍질이 아닌 갑각류의 살 내에 항원에 대한 IgE 항체에 의해 유발된다; 이런 이유로, 글루코사민 보충제를 복용하는 갑각류 알레르기를 앓는 환자에 대해 안전해야 한다"라고 분명하게 진술한다 [77]. [(Muzzarelli 2010) p. 300]

게다가, "상처 드레싱" 산물 내에 재료로서 정제된 키토산에 대하여, Dr. Muzzarelli는 하기를 진술한다:

"실험적 및 전-임상적 외과 시험에서, 키틴/키토산 및 이들의 유도체의 이용은 알레르기 또는 기타 질환을 결코 유발하지 않았다." [(Muzzarelli 2010) p.304]

지혈 고려사항

키토산 Mw는 또한, 적혈구 세포의 결합 또는 응집에 영향을 준다 (Mi, Shyu et al. 2001; Lshihara, Obara et al. 2006; Pang, Chen et al. 2007; Aranaz, Mengibar et al. 2009; Zhang, Xia et al. 2010). 최근의 보고서에서, 고체-상태 키토산 및 키토산 아세트산 생리학적 염수 용액 사이에서 비교 연구가 수행되었다 (Jian, Feng et al. 2008). 2000 내지 400 kDa의 Mw 및 90 내지 70%의 DD를 갖는 여러 키토산 시료가 조사되었다. 고체-상태 키토산 및 "키토산 아세트산 생리학적 식염수 용액"은 상이한 지혈 기전을 추종하는 것으로 밝혀졌다. 혈액이 키토산 아세트산 생리학적 식염수 용액과 혼합될 때, 적혈구는 응집하고 기형이 되었다. 키토산 아세트산 생리학적 식염수 용액에서 DD, 특히 높은 DD는 100-1,000 kDa 범위 내에 Mw의 효과와 비교하여, 적혈구의 특이한 집합과 기형에 대한 유의미한 효과를 가졌다. 하지만, 이러한 현상은 고체-상태 키토산에서는 관찰될 수 없었다. 높은 DD를 갖는 고체-상태 키토산은 더욱 많은 혈소판에 결합하고 더욱 지혈성이었다.

키토산 및 이의 염 형태를 내포하는 다수의 상업적인 의료 장치 산물(가령, 산성 동결건조된 키토산 스펀지)가 출혈을 제어하는데 가용하다. 이들 장치는 전형적으로, 상처 드레싱 또는 "붕대"로서 상처의 외부 표면에 적용된다 (하기 참조: FDA 승인된 장치).

점막부착

여러 인자, 예를 들면, 키토산의 생리학적 변수와 물리화학적 성질이 키토산 점막부착에 영향을 준다. 점액은 점액소(mucin)로 불리는 당단백질로 구성되고, 이것은 음성 전하가 풍부한데, 그 이유는 이것이 시알산 잔기를 갖기 때문이다. 위에서, 키토산은 산성 환경으로 인하여 양으로 하전되고, 따라서 정전력(electrostatic force)에 의해 점액소와 상호작용할 수 있다. 이러한 결합의 정도는 점액소 내에 존재하는 시알산의 양 및 키토산의 Mw와 DD에 좌우된다. 키토산의 Mw가 증가할 때, 점액소 층에서 침투 역시 증가하고, 따라서 점막부착이 더욱 강한 것으로 밝혀졌다 (Lehr, Bouwstra et al. 1992). 다른 한편, 더욱 높은 DD는 분자의 전하 밀도(charge density)에서 증가를 유발하고, 그리고 점착성 성질은 더욱 유관해진다 (He, Davis et al. 1998).

항균 활성

키토산의 내재적 성질 중의 한 가지는 폭넓은 스펙트럼의 세균에 대항하는 상당한 항균 활성을 제공한다는 것이다 (No, Park et al. 2002; Jou, Yuan et al. 2007). Aimin 등 (Aimin, Chunlin et al. 1999)은 키토산이 토끼에서 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 의한 실험적으로 유도된 골수염의 감염률을 감소시킬 수 있다는 것을 증명하였다. 이것은 아미노 기에 의한 키토산의 양이온성 성질에, 그리고 세균 세포 벽 상에서 음이온에 관련된다. 양으로 하전된 키토산 및 음으로 하전된 미생물 세포 벽 사이에 상호작용은 세포내 구성요소의 누출을 유발하였다. 키토산과 DNA의 결합 및 mRNA 합성의 저해는 미생물의 시토졸 내로 키토산의 침투, 그리고 mRNA와 단백질의 합성 간섭을 통해 일어난다 (Liu, Guan et al. 2001).

다른 기전 역시 제안되었다. 키토산은 킬레이트화제 제공 금속, 미량 원소 또는 생물체가 정상 속도에서 성장하는데 이용할 수 없는 필수 영양소로서 기능함으로써, 미생물 성장을 저해할 지도 모른다. 키토산은 또한, 응집 단백질과 상호작용할 수 있지만, 이러한 작용은 고도로 pH-의존성이다.

이에 더하여, 키토산은 항진균 성질을 갖는다. 여러 저자가 사상균에 대항하는 키토산의 항균 작용이 막 기능의 더욱 직접적인 교란에 의해 설명될 수 있다고 제안하였다. 하지만, 키토산의 항균 활성이 성장 저해(정진균성) 또는 세포 사멸(살균성)에 의해 유발되는 지는 분명하지 않다.

항산화 활성

키토산은 상이한 라디칼 종류에 대한 유의미한 제거 능력(scavenging capacity)을 보이고, 그 결과는 상업적인 항산화제로 획득된 결과에 필적한다. 90, 75, 그리고 50%의 DD를 갖는 게 껍질 키틴으로부터 제조된 시료는 1,1-디페닐-2-피크릴히드라질(DPPH), 하이드록실, 초산화물, 그리고 알킬 라디칼을 제거하는 능력에 기초하여 평가되었다. 그 결과는 더욱 높은 DD를 갖는 키토산이 최대 제거 활성을 나타낸다는 것을 드러냈다 (Park, Je et al. 2004). 다른 한편, 상이한 크기의 키토산뿐만 아니라 이들의 황산염 유도체가 초산화물 및 하이드록실 라디칼에 대해 검정되었다. 키토산 Mw와 활성 사이에 부정적인 상관관계가 밝혀졌다. 키토산 황산염 유도체는 과산화물 라디칼에 대한 더욱 강한 제거 효과를 제공했지만, 가장 낮은 Mw의 키토산은 다른 것들보다 훨씬 현저한 제1철 이온-킬레이트화 효능을 보였다. 금속 이온의 킬레이트화는 키토산이 잠재적인 자연 항산화제로서 간주될 수 있는 이유 중의 하나이다. 키토산은 시스템 내에 존재하는 제1철 이온을 킬레이팅하고, 따라서 이들의 산화 촉진 활성 또는 제2철 이온으로 이들의 전환을 제거함으로써 지질 산화를 지연시킬지도 모른다 (Peng 1998).

키토산의 현재 용도

자연 양이온성 다당류인 키토산 및 이의 염 형태(가령, -아세테이트, -락테이트, -클로라이드, -포스페이트 등)는 특히 식품, 의료 장치, 화장품과 모발 관리 제품, 그리고 약제에서 다양한 적용을 위한 비독성 생물분해성 생물중합체로서 많은 주목을 받았다 (Johnson and Nichols 2000).

식품과 관련하여, 근년에 키토산은 지방에 결합하는 능력으로 인하여, 복합 영양 보충 제품에서 식이 보충제 또는 콜레스테롤-강하제로서 처방전 없이 구입가능해졌다. 키토산은 식품 부패 미생물에 대한 항균 작용, 그리고 항산화 성질로 인하여 식품 보존을 위한 자연 기원의 다능한 생물중합체로서 확인되었다. pH-의존성 용해성은 이들이 수성 처리를 이용하여 다양한 형상(가령, 구슬, 필름 및 막)으로 형성될 수 있도록 한다. 구슬과 입자는 수지, 충전제, 흡수제, 흡착제, 그리고 절연체에서 이용에 대해 보고되었다 (Smith 1994)(Unger and Rohrbach 1996). 많은 과일과 야채의 저장가능성(storability)을 연장하기 위한 보호 방벽(barrier)으로서 키토산 코팅의 이용은 광범위하게 문서로 기록되었다.

키토산 구조의 현재 의학적 용도

생물학적 성질로 인하여, 키토산은 상처 치유 관리에서 연구 및/또는 상업적인 산물(가령, 상처 드레싱 및 "붕대"), 이식가능 장치 시스템, 예를 들면, 정형외과와 치주 복합물, 조직 재생을 위한 스카폴드, 그리고 약물-과 DNA-전달 시스템으로서 이용되고 있다.

생물분해성 자연 생물중합체로서 키토산은 여러 해 동안 생물적합성 상처 드레싱으로서 역할하였다. 키토산-기초된 재료는 독성 없이, 그리고 단지 초기, 경미한 대식세포-지배된 염증 반응으로 고도로 생물적합성이다. 일반적으로, 키토산은 독특한 화학적 및 생물학적 성질, 생물분해 특징, 그리고 생체적합성으로 인하여, 생물의학 적용에서 매력적이다. 키토산-내포 산물은 현재, 의료 시장에서 전형적으로 상처 치유를 촉진하기 위한 US FDA 클래스 I 의료 장치 상처 드레싱 또는 "붕대"로서 구입가능하다. 키토산-기초된 산물은 아마도, 미국에서보다 국제적으로 더욱 광범위하게 이용되고 있다.

인간에서 정제된 키토산 안전성

인간에서 정제된 키토산의 안전성은 폭넓게 보고되었다 (Ilium 1998; Baldrick 2010). 인간에서 안전성은 다양한 배경에서 증명되었다:

1. FDA 승인된 장치: 정제된 키토산은 복합 US FDA-승인된 클래스 I 의료와 치과 장치에서 성분이고, 그리고 대부분의 경우에, 주요 성분이다. 이것은 다양한 최종 제품 형태, 예를 들면, 과립, 붕대와 거즈의 필름 성분, 그리고 동결건조된 "스펀지"에서 이용되고 있다. FDA 510(k) Premarket Notification 통과된 클래스 I 제품의 실례에는 HemCon Bandage, HemCon Dental Dressing, HemoHalt Hemostasis Pad Wound Dressing, Aquanova Super-Absorbent Dressing, CELOX Topical Hemostatic Granules in Soluble Bag, 그리고 ChitoGauze가 포함된다.

2. GRAS 식품 첨가물: 키토산은 키토산의 다양한 제조업체(가령, Primex)에 의해 "자기 확인됨"의 수준에서 식품 첨가물로서 안전한 것으로 일반적으로 인정됨(Generally Accepted as Safe, GRAS)으로서 간주된다. 우리가 아는 바로는, 전면 FDA 검토 이후에 더욱 높은 수준에서 "노코멘트"의 GRAS 지정은 아직 발생하지 않았다. 키토산은 과학계에 의해, 한 가지 경고 ― 섭취된 키토산은 식이성 지질에 대한 친화성을 갖고 위장관으로부터 지질 섭취를 감소시킬 수 있다는 것을 제외하고, 식품에서 이용하기 안전한 것으로 간주된다.

3. 화장품 & 소비자 피부관리 제품: 키토산은 국제화장품일반명(International Nomenclature of Cosmetic Ingredients, INCI)의 목록에 올라있다. 키토산과 이의 다양한 염 형태(가령, 락테이트, 글리콜레이트, 아스코르베이트, 포르메이트, & 살리실레이트), 그리고 기타 유기 유도체는 화장품 및 소비자 피부관리 제품에서 이용을 위한 성분으로서, 그리고 복수의 판매업자를 통해 목록에 올라있다. 하지만, 키토산은 Cosmetics Ingredients Review (CIR)에 의한 평가를 아직 받지 않았다. 이러한 산업 전문가 패널은 매우 제한된 숫자의 미용 성분을 안전성에 대해 평가한다. 우리가 아는 바로는, 키토산은 전문가 패널에 의한 고려를 보증하지 못하였고, 그리고 과학계에 의해 소비자 피부관리와 미용 산물에서 이용에 안전한 것으로 간주된다.

조직 공학

조직 공학은 약화하는 조직과 장기에 대한 생물학적 대체물을 개발하기 위한 노력에서 재료 공학 및 분자/세포 생물학으로부터 근본 원리를 비롯한 여러 학문 분야에 걸친 과학이다. 가장 일반적인 의미에서, 조직 공학은 신체에 대한 살아있는 대체 부품을 제조하는 것을 추구한다. Langer와 Vacanti (Langer and Vacanti 1993)는 생물학적 대체물을 가공하기 위한 가장 일반적인 접근법이 생존 세포, 신호 분자, 그리고 중합체 스카폴드에 기초한다고 보고하였다. 이들 세포는 새로운 조직의 매트릭스를 합성할 뿐만 아니라 병든 또는 손상된 조직을 대신하여 기능하고, 반면 스카폴드는 이들 세포가 그들의 임무, 예를 들면, 점착, 증식, 그리고 분화를 효과적으로 달성할 수 있도록 하는데 적합한 환경을 제공한다. 신호 분자의 기능은 세포가 새로운 조직을 재생하도록 조장하고 촉진하는 것이다. 스카폴드는 설계된 조직을 형성하기 위한 공간적인 3-차원 프레임워크뿐만 아니라, 공간 채움(space filling) 및 생물활성 신호 분자의 제어된 방출을 제공한다. 조직 공학에서 이들 다양한 기능을 수행하기 위해, 스카폴드는 하기 요건을 충족해야 한다: (1) 조직, 그리고 세포 부착을 촉진하는 환경과의 생체적합성, (2) 새로운 조직 형성의 속도에 상응하는 최적 속도에서 생물분해성, (3) 비독성과 비-면역원성, (4) 최적 기계적 성질, 그리고 (5) 스카폴드 내에서뿐만 아니라 스카폴드와 주변 환경 사이에서 가스, 대사물질, 영양소 및 신호 분자의 수송을 위한 적절한 다공성과 형태.

키토산은 조직 공학에서 가장 유망한 생물재료 중에서 한 가지인데, 그 이유는 이것이 다양한 종류의 장기, 예를 들면, 피부, 뼈, 연골, 간, 신경 및 혈관에서 조직 재생에 적합하게 하는 유리한 물리-화학적 및 생물학적 성질의 별개의 세트를 제공하기 때문이다. 재생 조직 공학에서 최근의 연구는 손상된 조직을 뒷받침하고 조직하기 위한 스카폴드의 이용을 제안하는데, 그 이유는 3차원 매트릭스가 세포 거동에 더욱 유리한 환경을 제공하기 때문이다. 낮은 면역원성 활성, 제어된 생물분해성 및 다공성 구조로 인하여, 키토산 스카폴드는 조직 공학 시스템의 설계를 위한 유망한 재료이다.

미세구조, 예를 들면, 구멍 크기, 형성과 분포는 조직 공학에서 세포 침입, 증식과 기능에 대한 현저한 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 스카폴드에 관한 세포 부착 연구는 더욱 높은 DD가 세포 부착에 유리하다는 것을 증명하였다 (Seda Tigli, Karakecili et al. 2007). 하지만, 상기 문헌은 56% 내지 99%의 키토산 DD를 예기한다.

스카폴드의 분해성(degradability)은 조직 공학 세포/재료 구조체의 장기간 성과에서 결정적인 역할을 수행하는데, 그 이유는 이것이 세포 성장, 조직 재생, 그리고 숙주 반응을 비롯한 많은 세포 과정에 영향을 주기 때문이다. 만약 스카폴드가 골격계의 조직 공학을 위해 이용되면, 스카폴드 생물재료의 분해는 상대적으로 느려야하는데, 그 이유는 이것이 조직 재생이 거의 또는 완전히 완결될 때까지, 기계적 강도를 유지해야 하기 때문이다. 분해 속도 역시 시간의 흐름에서, 기계적 성질 및 용해성 성질 둘 모두에 선천적으로 영향을 준다.

최근에, 독특한 기술로서 전기방사(electrospinning) 공정에 의해 중합성 나노섬유를 만드는데 관심이 집중되고 있는데, 그 이유는 이것이 중합체 및 처리 조건에 따라, 수 마이크로미터에서부터 수십 나노미터 범위에서 직경을 갖는 키토산 나노섬유를 생산할 수 있기 때문이다. 전기방사는 액체 표면 장력을 극복하기 위해 중합체 용액 또는 용해물의 모세관 비말에 높은 전압을 가하고, 따라서 전통적인 섬유 방적 방법보다 훨씬 미세한 섬유의 형성을 가능하게 한다. 이들 나노섬유는 자연 세포외 기질(natural extracellular matrix, ECM)의 구조와 기능을 모방하고, 그리고 인간 조직의 기능을 수복하거나, 유지하거나 또는 개선하기 위한 스카폴딩 재료로서 조직 공학에서 많은 관심을 받고 있는데, 그 이유는 이들이 여러 유용한 성질, 예를 들면, 높은 비표면적(specific surface area)과 높은 다공성을 갖기 때문이다. 전기방사에 의해 키토산-기초된 나노섬유 구조를 제조하기 위해 이루어진 최근의 시도는 다양한 정도의 성공을 거두었다. Min 등 (Min, Lee et al. 2004)은 110 nm의 평균 직경을 갖는 키틴과 키토산 나노섬유를 생산하였고, 그리고 이들의 직경은 SEM 이미지 분석에 의해 40 내지 640 nm 범위이었다. Bhattarai 등 (Bhattarai, Edmondson et al. 2005)은 더 나아가, 이들 키토산-기초된 나노섬유가 연골세포와 골아세포 세포의 부착을 촉진하고, 그리고 특징적인 세포 형태를 유지한다고 결론내렸다.

상처 치유

키틴과 키토산은 면역세포 및 염증 세포(가령, PMN 및 대식세포), 섬유아세포, 그리고 혈관-내피 세포를 활성화시킨다. 이들 효과는 시료의 DD에 관련되는데, 키틴이 키토산보다 약한 효과를 나타낸다. Okamoto 등은 키토산이 실험적 동물 모델에서 상처 회복(wound repair)의 모든 단계에 영향을 준다고 보고하였다 (Okamoto, Shibazaki et al. 1995). 염증 단계에서, 키토산은 정상적인 응고 캐스케이드(clotting cascade)와 독립적인 독특한 지혈 성질을 갖는다. 생체내에서 이들 중합체는 또한, 섬유아세포의 증식을 자극하고, 그리고 호중구와 대식세포의 이동 거동(migration behavior)을 조정하여 차후 회복 과정, 예를 들면, 섬유증식증(fibroplasias) 및 재상피화(re-epithelialization)를 변경한다 (Okamoto, Shibazaki et al. 1995; Kosaka, Kaneko et al. 1996). Kosaka 등은 키토산의 세포 결합과 세포-활성화 성질이 키토산의 잠재적 작용에서 결정적인 역할을 수행한다고 보고하였다. 이들 연구는 키토산이 상처 치유 재료로서 적합하다는 일련의 증거를 더욱 뒷받침하였는데, 여기서 키토산-기초된 스카폴드 위에 세포-파종은 생물적합성이고 생육할 수 있는 조직 공학 이식물을 제공할 것이다.

키토산 올리고머 역시 상처 치유 성질을 보였다 (Minagawa, Okamura et al. 2007). 이들의 상처 치유 성질은 섬유아세포 성장 인자에 영향을 줌으로써 섬유아세포 생산을 자극하는 능력에 기인하는 것으로 제안된다. 차후 콜라겐 생산은 연결 조직의 형성을 더욱 용이하게 한다 (Howling, Dettmar et al. 2001).

상처 치유에서 키틴 올리고당류의 잠재적인 용도뿐만 아니라 만성 장 질환에 대항하는 능력이 조사되었다 (Deters, Petereit et al. 2008). 키토산 올리고머와 단위체의 상처 치유 효과는 많은 관심을 받고 있는데, 그 이유는 생체내 리소자임이 키토산 중합체를 이들 더욱 작은 분자로 분해하기 때문이다.

키토산-기초된 이식물은 최소 이물 반응(foreign body reaction)을 유발하고, 섬유성 피막형성(fibrous encapsulation)이 거의 또는 전혀 없는 것으로 밝혀졌다. 치유의 전형적인 진행은 종종 가속화된 혈관형성(angiogenesis)과 함께, 정상적인 과립화 조직의 형성이다. 키토산은 간단한 상처 드레싱에서부터 정교한 인공 피부 매트릭스까지의 적용에 적합한, 신속한 피부 재생을 촉진하고 상처 치유를 가속하기 위한 유리한 성질을 보유한다. 대식세포-유사 세포에 의한 키토산 이식물 분해의 진행 동안, 키토산은 항-염증성 사이토킨 캐스케이드(anti-inflammatory cytokine cascade)를 자극하는 것으로 보고되었다 (Chellat, Grandjean-Laquerriere et al. 2005).

이상적인 피부 드레싱은 최적 비율에서, 상처로부터 증발 물 손실(evaporative water loss)을 제어할 것이다. 정상적인 피부에 대한 경피 물 손실 (TEWL) 비율은 하루 204 g/m²인 반면, 약화된 각질층(stratum corneum)과 표피(epidermis)를 갖는 손상된 피부에 대한 경피 물 손실 (TEWL) 비율은 "일도" 화상의 경우에 하루 279 g/m² 내지 표피를 결여하는 과립화 상처(granulating wound)의 경우에 하루 5138 g/m² 범위에서 변할 수 있다. 상처 드레싱의 물 투습성(water vapor permeability)은 과도한 탈수뿐만 아니라 삼출물(exudate)의 축적을 예방해야 한다. 손상된 피부로부터 손실 비율의 중간 범위에 있는 하루 2500 g/m²의 비율이 상처 탈수의 위험 없이 적절한 수준의 수분을 제공할 것으로 권고되었다. 제조된 비대칭 키토산 막에 대한 물 손실 데이터는 막 캐스팅 (membrane casting)에 앞서 증발당 시간(per-evaporation time)에 따라, 하루 2109 내지 2792 g/m² 범위에서 변하였다 (Mi, Shyu et al. 2001). 스펀지-유사 하위층의 높은 다공성은 수증기의 흡착을 증가시키고, 그리고 고밀도 피부 층의 감소된 두께는 물 분자의 확산을 증가시키고, 따라서 증가된 수증기 전송률을 유발한다.

약물 운반 시스템(Drug Delivery Systems)

산업에서 키토산의 중요한 용도는 나노입자, 하이드로겔, 미소구체(microspheres), 필름 그리고 테블릿과 같은 약물 운반 시스템의 개발이다. 키토산의 양이온 특징으로 인하여, 키토산은 다가음이온과 반응하여 다가전해질(polyelectrolyte) 복합체를 만들 수 있다. 약학적 적용은 코, 눈, 입, 질, 장관외, 그리고 경피 약물 전달이 포함된다. 고려되는 키토산의 3가지 주요 특징은 다음과 같다: Mw, DD, 및 순도. 키토산 사슬이 짧을 때(낮은 Mw 키토산), 키토산 사슬은 물에 직접적으로 용해될 수 있고, 이것은 특이적 생물의학적 적용에 특히 유용하며, 피부과 또는 소비자 피부관리 이용을 위하여 pH는 대략 7.0 또는 약간 더 낮게(ca. 5.5-6.5) 유지되어야 한다.

약물 운반에서, 지속적인 약물 운반 시스템을 개발하고, 약물 활성 기간을 연장시키고, 치료 효과를 개선시키고, 그리고 부작용을 감소시키는데 있어서 특정한 특징을 가진 이상적인 키토산 유형의 선별은 유용하다. 약물 운반 운반 수단용 물질로 적절한 키토산을 선별하는데 있어서 키토산의 물리화학적 성질은 중요하다.

키토산 매트릭스의 로딩 및 방출 특징을 조절하는 소수성 상호작용에 있어서 가변성으로 인하여 상기 DD는 키토산의 결정성(crystallinity)과 소수성(hydrophobicity) 정도를 조절한다(Draget 1996). Zhang et al은 높은 키토산 DD와 중합체의 Mw 좁은 분포가 특정 크기 분포를 조절함에 있어서 결정적이라고 또한 보고하였다(Zhang, Oh et al. 2004).

미소구체를 준비하는데 이용된 키토산의 Mw가 증가될 때 비타민 C의 방출률이 훨씬 더 낮았다는 것이 Desai와 Park에 의해 관찰되었다(Desai와 Park 2006). 이들은 방출 동역학을 연구하였고, 이 동역학은 Fick의 확산 법칙을 따른다는 것을 알았다.

시험관(in vitro) 방출 연구에 있어서, 낮은 그리고 중간수준의 Mw 키토산이 포함된 필름의 경우 방출되는 약물의 양은 유사하지만, 그러나, 높은 Mw 키토산으로 만든 필름의 경우는 약물의 양이 더 적었다. 키토산 몰량과 키토산 용액의 점도 사이의 직접적인 상관관계를 고려하면 이러한 거동은 예측가능하다. 상기 중합체의 점도가 증가함에 따라, 형성된 겔 층을 통하여 방출 매체로의 약물 확산은 지체되었다(El-Kamel, Ashri et al. 2007).

유전자 운반(Gene Delivery)

키토산의 양전하로 인하여, 키토산은 DNA와 같은 음전하를 띈 분자와 상호작용하는 능력을 갖는다. 이러한 성질은 유전자 운반 시스템용 비-바이러스 벡터를 만들기 위하여 1995년 처음 이용되었다(MacLaughlm, Mumper et al. 1998). 유전자 운반용 비-바이러스 벡터로 키토산의 사용은 바이러스 벡터와 비교하여 몇 가지 장점을 제공한다. 주로, 키토산은 내생적 재조합, 종양형성 효과를 만들지 않고 그리고 단순히 약한 면역학적 반응도 만들지 않는다. 더욱이, 키토산/플라스미드 DNA 복합체들은 저가로 용이하게 만들어질 수 있다.

형질감염 효과가 키토산 Mw와 상당히 관련있기 때문에 키토산/DNA 복합체의 제조에 있어서 키토산의 Mw는 주요 파라미터가 된다. 고분자량의 키토산은 매우 안정적인 복합체를 제공하지만, 상기 형질감염 효과는 매우 낮다. 형질감염 효과를 개선시키기 위하여, 최근 연구에서 유전자 운반 벡터에 낮은 Mw 키토산과 올리고머의 사용이 시험되었다. 높은 수준의 형질감염을 획득하기 위해서 세포밖의 DNA 보호(Mw이 높을수록 우수) 대(versus) 효과적인 세포내 포장해제(unpackaging) (Mw이 낮을수록 우수) 사이에 정교한 균형이 이루어져야 하는 것으로 보인다. Lavertu et al은 키토산의 몇 가지 Mw와 DD 조합을 연구하였고, 10 kDa 키토산과 DD 92의 두 조합을 이용하면 80%의 높은 형질감염 효과를 가진다는 것을 발견하였다(Lavertu, Methot et al. 2006).

Kiang et al은 키토산-DNA 나노입자의 유전자 형질감염의 효과에 있어서 키토산 탈아세틸화 수준의 영향을 연구하였다 (Kiang, Wen et al. 2004). 상당히 탈아세틸화된(80% 이상) 키토산은 DNA를 매우 느리게 방출한다. 80% 미만의 DD를 가진 키토산은 이의 전하 밀도를 더 낮추기 때문에 상기 키토산이 DNA 방출을 용이할 수 있고, DNA와 복합체를 형성함에 있어서 공간적 방해가 증가될 수 있다고 제안하고, 그리고 분해 속도를 가속화시키는 것으로 알려져 있다. 상기 DD가 90%에서 70%로 감소될 때, 루시퍼라제 리포터 유전자 발현이 증가되었다고 보고하였다. 62% 및 70% 탈아세틸화된 제형은 90% 탈아세틸화된 키토산보다 100배 더 큰 루시퍼라제 유전자전이 발현을 유도하였다.

키토산 막

키토산 막 또는 필름의 잠재적 또는 실질적인 용도는 외과수술 동안 조직 층들을 분리시키기 위한 방벽(barrier) 막으로 사용하는 것이다. 막-형태의 또는 필름-형태의 저밀도 내지 고밀도의 키토산 구조를 만드는데 전형적으로 3가지 방법이 이용된다. 이러한 제조 방법은 용매 주조 (solvent casting), 상 분리(phase separation), 그리고 침잠-침전 상역전(immersion-precipitation phase inversion)(Madihally and Matthew 1999; Hong, Wei et al. 2007)이다. 이들 세 가지 방법의 경우, 다양한 농도의 키토산 용액(이를 테면, 2-4% w/v)은 1% (v/v) 아세트산 용액에 적절한 양의 키토산 분말 (이를 테면, 75-90% DD/400-500 mPas)을 용해시킴으로써 준비된다. 그 다음, 상기 키토산 용액은 맞춤(custom) 실리콘 주형 공동안으로 주조된다. 하기에서 설명되는 3 가지 상이한 방법들은 이 시점에서 서로 달라진다.

상기 상 분리 방법에서, 사익 주조된 산성 키토산 용액은 -20℃에서 하룻밤 동안 냉동되고, 그 다음 48시간 동안 10 x 10^-3 mBar에서 -40℃에서 냉동건조된다. 냉동-건조된 키토산 재료는 그 다음 주형틀에서 빼내고, 그리고 4시간 동안 1N NaOH로 처리되어 키토산 중합체 망상조직이 안정화되고, 증류수로 반복적으로 세척된 후, 건조를 위하여 50℃ 오븐 안에 넣어둔다. 상기 상 분리 방법은 제어가능한 포어 크기를 가진 상대적으로 저밀도의 다공성 스폰지(sponge)를 만든다(Mi, Shyu et al. 2001) (No et al. 2002).

키토산 용액의 냉동으로 두 가지 또는 그 이상의 별개의 상-전형적으로 물은 얼음으로 냉동되고, 키토산 생물재료는 별도의 고형 상으로 이동된다. 상기 냉동된 용매 (전형적으로 얼음)을 제거하기 위한 또다른 단계가 필요하며, 따라서, 상처 드레싱에 흔히 이용되는 형태인, 저-밀도 다공성 스폰지가 만들어진다. 이것은 냉동-건조 (이를테면, 동결건조(lyophilization)) 및/또는 냉동 치환 단계에 의해 섬유성 구조의 방해없이 획득된다.

상기 용매 주조 방법의 경우, 상기 용매를 제거하고, 키토산 막을 남기기 위하여 50℃의 오븐에서 상기 주조된 산성 키토산 용액은 단순히 건조된다. 건조 후, 상기 키토산 막은 4시간 동안 1N NaOH로 처리되고, 임의의 반응 물질 잔류물을 제거하기 위하여 반복적으로 증류수로 세척된 후, 건조를 위하여 50℃ 오븐에 둔다. 상기 용액이 이 공정에서 주조된 후, 상기 용매는 증발되기 시작하고, 상기 중합체 용액의 표면 상의 용매는 내부에 있는 것보다 더 신속하게 증발되고, 콜로이드 입자에 의해 형성된 층을 형성하기 위하여 중합체의 농도가 신속하게 증가된다. 표면 층이 형성된 후, 용매의 증발은 느려진다. 키토산 용해도는 이 시스템이 균질한 용액으로 유지되는데 충분하지 않기 때문에 상 분리가 일어난다. 균질한 용액으로부터 용매 분리로 중합체가 풍부한 상에 의해 둘러싸인 중합체-부족한 상이 형성된다. 산성 용매를 중화 염기로 교환하면 상기 중합체 망상조직이 안정화된다.

세 번째 방법에서, 상기 침잠-침전상 역전(IPPI) 방법, 상기 주조된 산성 키토산 용액은 비대칭 막을 형성하기 위하여 1시간 동안 50℃ 오븐에서 (부분적으로) 탈수되고, 막 안에 키토산 중합체는 24시간 동안 0.2 M NaOH 용액에 침잠시켜 안정화시킨다. 그 다음 생성된 막은 탈이온화된 막으로 반복적으로 세척되고, 그 다음 48시간 동안 냉동-건조된다. 상기 IPPI 방법으로 3개 층을 가진 비대칭 다공성 막이 생성된다: 고밀도 바깥 층, 다소 밀도가 낮은 중간 과도기 층 그리고 다공질의 다공성 층, 이들 모두는 조절가능하다(Hong, Wei et al. 2007).

키토산과 이의 용도에 관한 검토는 공개되어 있다(Kato, Onishi et al. 2003; Niekraszewicz 2005; Boateng, Matthews et al. 2008; Aranaz, Mengibar et al. 2009; Zhang, Xia et al. 2010).

키토산 스폰지를 만들고 이용하는 것은 선행기술에서 설명된다:

(1) 압착되지 않은 동결건조된 중화된 스폰지 (Zhang, Cheng et al. 2006; Seda Tigli, Karakecili et al. 2007; Blan and Birla 2008); 그리고

(2) 압착되지 않은 동결건조된 비-중화된 스폰지 (Tully-Dartez, Cardenas et al. 2010; McAdams, Block et al. 2011).

키토산 재료의 밀도를 증가시키는 다음을 포함한 몇 가지 다른 방법들이 기술되어 있다:

(1) 동결건조된 산성 스폰지를 불특정 밀도로 압착 (McCarthy, Gregory et al. 2008; Gregory and McCarthy 2009);

(2) 동결건조된 산성 스폰지를 0.8 g/㎤ 또는 이보다 적은 특정 밀도로 압착(McCarthy, Gregory et al. 2008; Gregory and McCarthy 2010; McAdams, Block et al. 2011; McCarthy, Gregory et al. 2011);

(3) 비대칭 공기 건조 (Ma, Wang et al. 2001; Thein-Han and Stevens 2004; Kuo 2005; Kuo, Chang et al. 2006; Dalian, da Luz Moreira et al. 2007; Duan, Park et al. 2007; Hong, Wei et al. 2007; Pang, Chen et al. 2007; Kuo 2008) (Ma et al. 2001)(Duan et al. 2007); 그리고

(4) 롤링후 전기방사(Electrospinning) (Yeo, Jeon et al. 2005; Li and Hsieh 2006; Park, Kang et al. 2006). 전기방사는 얇은, 중화된 키토산 섬유를 만들고, 이들은 함께 혼합되어 층을 이룬 거물형(web) 산물이 된다. 전기방사 기술은 본 명세서에서 설명된 본 발명에 적용되지 않는다.

키토산 구조는 광 활성화와 함께 또는 광 활성화 없이 화학적으로 가교(cross-linking)에 의해 강화될 수 있다(Masuoka, Ishihara et al. 2005; Obara, Ishihara et al. 2005). 그러나, 이들 가교 방법중 어느 것도 키토산 밀도를 본 명세서에서 설명된 고밀도 범위로 증가시킬 수 없다.

비대칭 공기-건조는 키토산 용액의 노출된 표면으로부터 산성 용매의 증발에 의해 키토산 용액의 밀도를 증가시킨다. 용매가 제거될 때, 노출된 표면상에 키토산 밀도는 증가된다. 키토산 밀도를 증가시키는 이 방법은 고밀도, 막과 유사한 키토산 고안을 만들 수 있다. 이 방법의 특정 문제점은 주형 안에 용액의 표면 증발의 고르지 못한 성질과, 그리고 압착없이 획득될 수 있는 제한된 밀도이다. 공기 건조만을 이용한 고밀도 키토산 막 구조를 제작하는데 있어서 추가 문제는 고밀도의 그리고 얇은 방벽 막으로 의도된 재료의 경우 젖었을 때 건조된 막의 팽창이 과도하고, 이는 임상적으로 문제가 된다. 따라서, 선행기술과 달리, 본 발명은 현재 문제점들을 회피하는 고밀도 막과 유사한 키토산 재료를 만드는 새로운 방법을 설명한다.

요약

현재까지, 외과술 및 상처 치료 분야에서 정제된 키토산의 방벽 막 또는 필름으로서 용도는 키토산의 물리적 성질에 의해 제한되어 왔었다. 선행기술에서 설명된 것과 같이 준비된 키토산으로는 의료용으로 사용하기에는 불충분한 밀도 또는 다른 물리적 성질을 가진 필름, 막, 또는 스폰지가 만들어졌다. 의료 용도에서 일반적으로 요구되는 것과 같이, 젖었을 때 유연하도록, 0.6 mg/㎤ 미만의 밀도를 가진 키토산은 외과수술용으로 배치되는 동안 강력한 봉합 및 취급을 확실하게 지원하기에는 강도가 불충분하다. 따라서, 추가적인 합치되는 유익한 성질을 가지고, 0.6 mg/㎤ 초과하는 밀도를 가진 키토산 막을 만들기 위한 새로운 공정을 개발하였다. 이러한 고-밀도 키토산 필름 또는 막은 임상에서 확실하게 적용될 수 있는 필수적인 강도와 취급 품질을 제공한다. 특히, 본 발명의 고-밀도 키토산 필름 또는 막은 우수한 인장 강도, 봉합 유지 (이를테면, 봉합의 인발 저항(resistance to suture pull-out)), 탄성, 적합한 두께, 그리고 의료 분야에서 사용하기 위한 형상 기억 (이를테면, 순응성)을 갖고, 재수화때 팽창도 제한적이다.

키토산 밀도를 증가시키는 공지된 몇 가지 방법중, 가장 흔한 방법은 동결건조된 키토산 스폰지의 압착을 포함한다. 상기 동결건조된 키토산 스카폴드는 충분한 압력을 이용하여 고밀도로 압착될 수 있는데, 이러한 공통적인 공정의 한계는 상기 압착된 동결건조된 스카폴드가 다시 젖을 때 형상 기억이 유지되어 막으로써 임상적으로 수용불가능한 두께로 과도하게 되감긴다는 점이다. 동결건조된 스폰지의 압착 방법으로는 젖은 후 되튐(recoil) 두께를 제한하고, 막 구조에서 충분한 밀도를 유지시키는 것이 불가능하고, 따라서 임상 취급 및 봉합용으로 충분한 강도를 가진 고밀도 막을 만드는데 부적합하다. 따라서, 본 발명은 2 mm 두께보다 얇은, 대략 0.6-1.6 g/㎤의 고밀도 키토산 막을 만드는 새로운 방법을 설명하고, 압착에 앞서 스폰지 제작의 공통적인 단계는 배제된다.

본 발명의 본질은 동결건조된 키토산 스폰지보다 더 밀도가 높고, 추가적인 성질, 이를 테면, 적합한 인장 강도, 봉합 유지 (이를테면, 봉합의 인발 저항), 탄성, 그리고 충분한 형상 기억 (이를테면, 순응성)을 가지면서, 여전히 기존에 설명된 키토산 재료와 차별되는 재수화될 때 팽창이 제한적인, 막 모양의 키토산 재료를 만들고 이용하는 것이다. 본 발명은 자연적, 반-합성, 또는 합성 원천의 키틴 또는 키토산 원료를 한정하지 않는다.

본 발명을 만드는 주요 단계들은 다음과 같다:

1) 물질에 있는 모든 산이 중화될 때까지 강산에 산성 키토산 용액을 침잠시키고, 생성된 고형화된 키토산 겔은 염기성 pH를 갖는다. 중화에 앞서 공기 건조는 본 발명에서 배제되지 않는다. 전술한 중화 공정 동안 키토산 용액을 유지하기 위한 주형 또는 틀의 사용은 단위 면적당 키토산의 바람직한 농도, 바람직하게는 cm² 당 대략 0.3 - 0.5g을 유지하는데 바람직하다. 전술한 중화에 앞서 주형내 상기 키토산 용액의 냉동은 중화 공정 동안 단위 면적당 키토산 농도를 안정화시키고, 중화에 앞서 중합체 배제를 촉진시키는데 바람직하다. 화학 분야에서 숙련된 경험자들에게 친숙한 강염기, 바람직하게는 1-2 몰농도의 수산화 나트륨은 키토산이 표면으로부터 상실되고, 균질한 키토산 구조가 변경되기 전에, 냉동된 키토산 현탁액의 밖으로부터 내부방향으로 냉동된 키토산 용액을 중합하는데 바람직하다

2) 상기 고형 키토산 겔로부터 물 또는 액체를 제거하고, 동시에 키토산을 압착시킨다. 고형화된 키토산 겔 안에 강염기를 수성 완충액 또는 물과 교환한 후 탈수를 실행하는 것이 바람직하다. 탈수는 열 존재하에 진공에서 실행되는 것이 바람직하다. 탈수는 열 존재하에 진공하에서 바람직하게는 반투과성 막 (이를 테면, 셀로판(Cellophane) 또는 유사한 셀룰로오즈 물질)을 통하여 용매 상(이를 테면, 물, 수성 완충액)이 상실됨으로써 바람직하게 실행된다. 압착은 키토산 겔에 고르게 분산된 25인치 Hg의 최소 선형 압력으로 실행되는 것이 바람직하다.

본 발명의 중요한 독특한 측면은 압착과 탈수 공정을 복합하여 압착되는 동안 겔의 탈수가 일어난다는 점이다. 본 발명의 또다른 독특한 측면은 탈수 동안 겔의 pH는 중성 또는 알칼리라는 점이다.

본 발명의 이러한 목적들, 그리고 다른 목적들, 그리고 유익한 점들은 공개된 구체예들의 상세한 설명의 검토 및 첨부된 청구항을 참고하면 더욱 명확하게 이해되고, 인지될 수 있을 것이다.

전술한 반견에 근거하여, 0.6g/㎤ 이상의 밀도를 가진 신규한 키토산 구조, 이 조성물을 만드는 방법들, 그리고 본 명세서의 배경에서 설명된 의학 용도로 이 조성물을 이용하는 방법들이 본 명세서에 제공된다. 전술한 키토산 구조를 만드는 방법은 다음의 3가지 연속 단계로 특징화될 수 있다:

a) 물과 키토산의 산성 용액을 제공하고;

b) 중합된 키토산의 겔을 만들기 위하여 전술한 용액을 중화하고;

c) 상기 중합된 키토산 겔은 동시에 탈수 및 압착된다.

바람직한 구체예에 있어서, 생성된 고-밀도 키토산 필름 또는 막 조성물은 0.6g/㎤ 이상, 그리고 더욱 바람직하게는 0.8 g/㎤ 이상의 밀도를 보유한다.

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 산성 용액에 이용된 키토산 출발 물질은 대략 70-95% DD를 갖는다. 그러나, 본 발명은 56%-99% 범위의 DD 또한 허용한다.

바람직한 구체예에 있어서, 상기 키토산은 키토산 염기로 존재한다. 그러나, 상기 키토산은 이를 테면, 키토산 아세테이트, 키토산 숙시네이트, 키토산 아디페이트, 키토산 클로라이드, 키토산 글루타메이트, 키토산 락테이트, 키토산 아스파르테이트, 키토산 피루베이트, 키토산 포스페이트, 키토산 글리콜레이트, 키토산 아스코르베이트, 키토산 살리실레이트, 키토산 포르메이트, 또는 키토산 말레이트과 같은 염으로 존재할 수 있다.

본 발명의 또다른 바람직한 구체예에 있어서, 상기 키토산 출발 물질은 대략 400-500 센티푸아즈(Centipoise) (CPS) 또는 밀리파스칼(mPas)의 평균 점도를 갖는다. 그러나, 본 발명은 약 5 내지 3000 mPas 점도의 키토산 출발 물질을 고려한다.

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 키토산은 1% 아세트산에 용해된다. 그러나, 본 발명은 아세트산 이외의 산성 용매를 고려하고, 용매 비율은 0.1%-10% 범위다. 예를 들면, pH가 5.0 미만의 적절한 유기산, 가령, 포름산, 글리콜산, 시트르산 또는 젖산이 또한 적합할 것이다. 다른 적합한 산은 염화수소산, 글루탐산, 아스파르트산, 아스코르브산, 피루브산, 말산, 말레산, 푸마르산, 글루쿠론산, 소르브산, 그리고 엽산을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 용액내 상기 키토산 농도는 2-4%이다. 그러나, 본 발명은 0.1% 내지 25%의 키토산 농도를 고려한다.

본 발명의 또다른 바람직한 구체예에 있어서, 상기 키토산은 중화된 키토산 겔을 형성하기에 앞서 7일 동안 산성 용매에 용해된다(중화에 앞서 냉동 단계와 함께 또는 냉동 단계없이). 그러나, 본 발명은 즉시 준비된 키토산 용액, 또는 중화된 키토산 겔을 형성하기에 앞서 최대 2년 전에 준비된 키토산 용액을 고려한다 (중화에 앞서 냉동 단계와 함께 또는 냉동 단계없이).

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 키토산 용액은 상기 틀 또는 주형 면적의 제곱 센티당 대략 0.3-0.5 g 키토산 용액의 두께의 양으로 틀 또는 주형에 주입된다. 그러나, 본 발명은 냉동하기에 앞서 주형 또는 틀 안에 0.1 g/㎠와 같이 적은 양 또는 10 g/㎠와 같이 많은 양의 키토산 용액을 고려한다.

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 키토산 용액은 주형 또는 틀을 통하여 용액에 진동(vibration)을 부여함으로써 탈기된다(degas). 진동 시간은 바람직하게는 10 분이다. 그러나, 본 발명은 1초 내지 10일간의 진동 시간을 고려한다. 대안 구체예에 있어서, 본 발명은 제공된 진공을 통하여 상기 키토산 용액의 탈기를 고려한다.

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 키토산 용액은 주형 또는 틀에서 냉동되어 고형화된 키토산 현탁액이 된다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 키토산 용액은 1시간 동안 대략 -80℃에서 냉동된다. 대체 구체예에 있어서, 상기 키토산 용액은 16시간 동안 대략 -20℃에서 냉동된다. 그러나, 본 발명은 상기 키토산 용액이 냉동되는데 충분한, 1분 내지 365일 범위의 시간 동안 0 내지 -276℃ 범위의 온도에서 키토산 용액을 냉동시키는 것을 고려한다. 본 발명은 상기 공정의 이 단계에서 키토산 용액을 냉동시키지 않는 가능성 또한 고려한다.

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 고형화된 (냉동된 경우) 키토산 현탁액은 고체인 상태로 주형으로부터 꺼내고(상기 주형에서 제거되고), 후속적으로 고형인 상태로 고형화된 키토산 현탁액 안에 상기 산성 용매가 완전하게 중화될 때까지 24시간 동안 염기 이를 테면, 1-2M 수산화 나트륨에 침잠시켜, 중합된 겔을 만든다. 그러나, 상기 고형화된 키토산 겔 안에 상기 산성 용매가 완전하게 중화되는데 요구되는 염기의 강도 및 체적, 그리고 침잠 기간은 상기 고형화된 키토산 현탁액의 크기 및 산도에 따라 변화될 수 있다. 본 발명은 화학업계에 숙련된 지식을 가진 자들에게 공지된 몇 가지 염기중 임의의 하나, 이를 테면 0.1M 내지 10M 범위의 강도를 갖는 수산화 나트륨 또는 수산화 칼륨과 함께, 1 분 내지 3 개월의 침잠 기간을 고려한다. 대체 수산화물이 이용될 수 있으며, 이런 수산화물에는 수산화 칼슘과 수산화 마그네슘이 포함된다.

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 염기성 pH를 가진 중화된 키토산 겔은 염기성 용액을 제거하여 pH 중성 또는 실질적으로 중성 (이를 테면 pH 5-11, 5-9 또는 5.5-7.5)이 되도록 하기 위하여 탈이온화된 또는 증류된 H₂O 또는 수성 완충액 용액에서 24시간 동안 세척된다. 그러나, 본 발명은 1분 내지 3개월의 세척 기간을 고려한다. 본 발명은 이러한 헹굼 단계 동안 탈이온화된 또는 증류된 H₂O 또는 수성 완충액 용액의 연속 흐름의 사용을 또한 고려한다. 본 발명은 상기 중화된 키토산 겔을 전혀 세척하지 않는 것을 또한 고려한다.

본 발명의 주요한 측면에 있어서, 상기 액체는 키토산을 동시에 압착시키면서, 상기 중화된 키토산 겔로부터 제거된다. 탈수는 진공과 열을 이용하여 실행되는 것이 바람직하다. 압착은 25 인치의 Hg 최저 선형 압력으로 실행되는 것이 바람직하며, 그리고 바람직하게는 균일한 막을 획득하기 위하여 상기 키토산 겔에 고르게 분산된다. 그러나, 5-500, 10 내지 100, 또는 20 내지 50 인치의 Hg 최저 선형 압력의 이용한 압착도 고려된다. 탈수와 압착은 80℃ 온도에서 실행되는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명은 2℃ 내지 150℃, 40℃ 내지 120℃, 또는 50℃ 내지 100℃ 범위의 온도에서 상기 키토산 겔을 탈수 및 압착시키는 것을 고려한다.

물론, 탈수와 물리적 압착은 탈기(outgassing)로 알려진 공정에서 자체 또는 추가된 열과 함께 진공하에서 일어날 수 있음을 인지할 것이다. 제공되는 진공은 바람직하게는 대기압 미만이며, 그리고 0.6, 0.4 또는 0.2 기압과 같은 낮은 기압이 된다.

탈수와 압착은 4시간 동안 실행되는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명은 1분 내지 3개월 범위의 시간 동안 탈수와 압착의 실시를 고려한다.

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 중화된 키토산 겔은 진공 탈수에 앞서, 반-투과성 막 위에 또는 내부에 위치된다. 탈수와 탈수된 중합체 키토산의 온전성은 보존되면서, 상기 반투과성 막은 그 다음 진공하에 수증기의 상실을 촉진시킨다. 상기 반투과성 막은 상기 반-투과성 막의 가장자리 또는 경계내에 주형된 키토산 겔을 유지시키면서, 물에 대해 선택적 투과성이며, 그리고 셀로판(Cellophane) 또는 다른 셀룰로오즈 막 또는 또다른 물질이 될 수 있다. 탈수된 고-밀도 키토산 필름 또는 막은 탈수 공정 동안 이용된 상기 반-투과성 막으로부터 후속적으로 제거될 수 있다.

본 발명의 또다른 바람직한 구체예에 있어서, 중화된 그리고 중합된 키토산 겔은 1 초 내지 10일 범위의 기간 동안 글리세롤 용액에 침잠되고, 그 다음 진공 탈수를 위하여 반-투과성 막 위 또는 내부에 위치된다. 더욱이, 상기 글리세롤 용액은 물 또는 수성 완충액 안에 대략 5% 내지 20% 또는 10% 글리세롤을 포함하는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명은 이 공정 동안 1% 내지 50% 범위의 글리세롤 농도를 이용할 수 있다.

생성된 키토산 구조는 10 mm 미만, 5 mm 미만, 2 mm 미만, 1 mm 미만, 또는 심지어 0.5 mm의 두께를 갖는 필름 또는 막의 형태를 취하는 것이 바람직하다. 앞에서 명시된 것과 같이, 상기 구조의 밀도는 바람직하게는 0.6 g/㎤를 초과하고, 최대 1.6 g/㎤일 수도 있다. 또다른 바람직한 구체예에 있어서, 상기 구조의 밀도는 0.8 g/㎤를 초과하고, 최대 1.6 g/㎤일 수도 있다. 상기 필름 또는 막은 이의 pH에 의해 특징화될 수 있는데, 5.0 내지 9.5 범위가 바람직하다. 상기 필름 또는 막은 잘게 쪼게지거나, 또는 가루로 되어, 미립자로 이용될 수 있지만, 이의 우수한 물리적 성질(이를 테면, 인장 강도, 탄성, 그리고 봉합의 인발 저항)로 인하여 필름 또는 막으로 이용되는 것이 바람직하다.

바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 키토산 필름 또는 막은 화학적 또는 빛에 의해 유도된 가교 단계를 요구하지 않으며, 그리고 0.6 g/㎤ 초과 그리고 좀더 바람직하게는 0.8 g/㎤ 초과된 탈수된 밀도를 획득한다. 그러나, 일부 용도에서는 화학적 또는 빛에 의해 유도된 가교 단계가 포함되면 생물분해 가능성의 감소와 같은 일부 유익한 점(들)이 제공된다.

또다른 구체예에 있어서, 본 발명의 생성된 고밀도 키토산 구조는 동물, 포유류, 또는 인간에서 생물의학적 과정, 이를 테면 외과적으로 이식된 필름 또는 막에 사용을 위한 유익한 물리적 성질을 갖는다. 인장 강도, 탄성, 및/또는 봉합의 인발 저항에 대해 평가될 때, 상기 고밀도 키토산 재료는 우수한 물리적 특징을 나타낸다. 얇은 필름 또는 막에 대한 이러한 물리적 파라미터 평가를 위하여 ASTM 국제 표준 방법이 확립되었다 (ASTM 2002; ASTM 2006). 이들 표준 방법에 약간의 변형(이를 테면, 장력 테스트의 경우 ASTM 표준 방법 D 1708-06a에 따라 반-타원 주형 컷-아웃 대신에 반-원 스트립(strip), 그리고 ~ 2.5 mm (ASTM 2006)의 최소 폭을 보유하고; 봉합 뜯겨짐의 경우, ~ 5 mm 폭을 가진 스트립)을 이용하여 본 발명의 생성된 고밀도 키토산 구조를 특징화하였다.

본 발명은 0.6 g/㎤ 이상의 밀도, 더욱 바람직하게는 0.8 g/㎤ 이상의 밀도를 갖는 필름 또는 막 안에 키토산이 포함된 조성물을 공개한다. 또다른 바람직한 구체예에 있어서, 상기 키토산 조성물은 5.0 내지 9.5의 pH를 갖는다. 또다른 바람직한 구체예에 있어서, 상기 키토산 조성물은 글리세롤을 포함한다.

끝으로, 본 발명은 본 발명의 구조를 이용한 치료 방법을 제공하며, 다음을 포함하는 치료 방법으로 특정될 수 있다: 0.6 g/㎤ 이상의 밀도를 갖는 키토산 조성물을 제공하고; 그리고 동물에 또는 동물 내부에 전술한 조성물을 배치한다. 바람직한 구체예들에 있어서, 상기 동물은 포유류 또는 인간이며, 또다른 바람직한 구체예에 있어서, 상기 구조는 사용하기에 앞서 약제, 생물학적 물질, 핵산, 백신, 면역 효과물질, 또는 이의 염으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 화합물 존재하에 또는 부재하에 물 또는 완충된 수성 용액에서 수화된다. 또다른 바람직한 구체예에 있어서, 상기 키토산 조성물은 동물 내부에 조직 층들을 분리하기 위한 물리적 방벽 필름 또는 막의 기능을 한다. 또다른 바람직한 구체예에 있어서, 상기 동물, 포유류, 또는 인간에서 또는 이들 내부에서 상기 필름 또는 막은 시간이 경과됨에 따라 재흡수되며, 이의 비율은 상기 물질의 DD와 두께에 일부 의존적이다. 또다른 바람직한 구체예에 있어서, 상기 키토산 조성물은 동물에서 또는 동물 내부에서 항-감염성 물리적 방벽 필름 또는 막으로 기능한다. 본 발명의 또다른 바람직한 구체예에 있어서, 상기 키토산 필름 또는 막은 물 또는 수성 용액 안의 작은 분자에 대해 투과성이다. 본 발명의 또다른 바람직한 구체예에 있어서, 상기 물리적 성질(이를 테면, 인장 강도, 탄성, 그리고 봉합의 인발 저항)은 단독으로 또는 임상적 취급 특징에 추가하여(이를 테면, 젖는-능력, 외과적 이식 부위에 대한 순응성, 그리고 봉합-능력) 동물, 포유류, 또는 인간의 임상 환경에서 생성된 고밀도 키토산 필름 또는 막의 우수한 사용 편의성을 돕는다.

실시예

중화에 앞서 키토산 용액을 냉동시키는 바람직한 방법에 있어서, 주형 안에 대략 0.3-0.5 g/㎤의 키토산 용액을 -80℃에서 초저온-냉동시키면 노출된 상부 표면에 최종적으로 상기 키토산의 중합이 생성되고, 현미경 또는 주사 전자 현미경에 의해 검사하였을 때 상기 표면에 편직(woven), 미소섬유의(fibrillar), 다공성, 구조를 가진다. 생성된 탈수된 필름 또는 막은 전반적으로 0.6 g/㎤ 초과 밀도, 더 바람직하게는 0.8 g/㎤ 초과 밀도를 보유하고, 그리고 교번되는 바닥, 측면은 더 부드럽고, 미소섬유가 덜한 표면을 가지게 되어, 다소 비대칭적이다.

중화에 앞서 상기 키토산 용액을 냉동시키는 바람직한 방법에 있어서, 현저하게 1시간 이상(이를 테면, 2시간) 동안 -80℃에서 초저온 냉동시키면, 냉동된 키토산 겔과 최종 막 구조에 물리적인 크래킹(cracking)을 초래할 수 있다.

바람직한 냉동 방법에 있어서, 중화에 앞서 주형 내에서 상기 -20℃ 에서 냉동시키면, 최종 막 구조의 편직 구조 정도가 감소된다. 냉동 온도와 무관하게, 상기 최종 막은 0.6 g/㎤을 초과하는 밀도를 갖는다.

중화에 앞서 상기 키토산 용액을 냉동하지 않는 경우, 압착 및 탈수된 생성된 막은 편직의 미소섬유 구조를 눈으로 확인할 수 없다. 냉동을 하거나 또는 냉동을 하지 않거나 상관없이 생성된 막은 0.6 g/㎤을 초과하는 밀도를 갖는다.

산의 중화 및 탈수에 앞서, 상기 키토산 용액의 냉동과 함께 탈수의 타당성은 냉동 공정과 함께, 그리고 냉동 공정없이 생성된 재료의 기계적 성질에 의해 더 예증된다. Instron 기계를 이용하여 봉합의 인발 저항을 측정함에 있어서, 냉동 공정없이 준비된 키토산 막은 막 두께 mm 당 2.0 N ± 0.3 N의 하위 인발력(pull-out force)을 갖지만, 중화에 앞서 1시간 동안 -80℃의 온도에서 냉동에 의해 준비된 동일한 조성물의 막은 막 두께 mm 당 4.5 N ± 0.1 N의 우수한 봉합의 인발 저항을 갖는다.

탈수 및 압착에 앞서, 반-고형 겔에 상기 냉동된 키토산 현탁액을 알칼리로의 중화하는 중요성의 예증에서, 압착 산성 키토산 용액을 압착시키면서 증발시키는 시도는 실패하였다. 압착과 함께 탈수는 건조되는 동안 키토산의 밀도를 점진적으로 증가와 함께 상기 용매의 통과는 허용하면서 상기 용질 (키토산 중합체)은 유지되는 반투과성 막(이를 테면, 셀로판(Cellophane))을 필요로 한다. 반-투과성 막을 통하여 산성 키토산 용액을 탈수시키지 못하는 타당성 있는 이유는 상기 점도의 중합안된 키토산이 막의 표면에 최종적으로 축적되어, 용매의 통과를 차단시키기 때문이다. 그 결과 열 존재 하에서도 상기 용액의 탈수에 실패한다. 동일한 이유로, 상기 산성 키토산 용액의 냉동과, 바로 이어서 탈수 및 압착 또한 실패한다. 동일한 이유로, 젖은 산성 키토산 스폰지 (산성 키토산 현탁액의 동결건조에 의해 생성된)의 압착과 함께 탈수 또한 실패하고, 진공 탈수와 함께 건조하는 것도 실패한다. 동일한 이유로, 젖은, 산성의 공기-건조된 키토산 구조의 압착과 함께 탈수 또한 실패한다. 진공 압착에 앞서, 알칼리에서 중화시킴으로써 상기 키토산 현탁액의 중합은 필수적이다.

중화된 키토산 겔의 증발과 압착 중요성의 예증에서, 건조 동결건조된 산성 스폰지의 압착 시도는 크랙이 형성된(cracked) 키토산 막 구조를 초래하였다. 상기 건조 압착된 막을 축축하게 하면 수용불가능한 되튐 팽윤(recoil swelling)이 초래되고, 중합안된 막 구조가 상실된다.

겔에서 강염기 하에 상기 키토산 용액의 중합화 이후 pH를 5.0 이상으로 유지시키는 중요성은 중화된 키토산 겔을 20시간 동안 pH 2.9의 산성 용액에 두면 상기 키토산 겔 구조의 붕해가 초래되어 키토산 겔 구조가 손실된다는 것으로 예증된다.

중화된 키토산 겔의 탈수 이후 pH 5.0 이상으로 pH 환경을 유지시키는 중요성은 pH 4 또는 이 미만의 산성 환경에서 24시간 후 고밀도 키토산 필름 또는 막 구조가 완전하게 손실된다는 것으로 예증된다.

중화된 키토산 겔, 그리고 동결건조안된 스폰지의 탈수와 압착의 중요성의 예증에서, 젖은 중화된 동결건조된 키토산 스폰지의 압착은 0.38 g/㎤의 불충분한 키토산 밀도를 초래한다. 건조 중화된 동결건조된 키토산 스폰지의 압착은 불충분한 키토산 밀도 (0.065 g/㎤)를 초래한다.

탈수와 압착 수반의 중요성의 예증에서, 압착되는 동안 적절한 탈수가 없는 경우의 실험은 균열(fissured)이 간, 만족스럽지 못한 최종 키토산 구조를 초래하였다.

중화에 앞서 상기 산성 키토산 용액에서 진동의 효과는 최종 막 구조에 영향을 주지 않는다.

고 밀도의 키토산 필름 또는 막의 생물학적 타당성의 예증에서, 이들 막은 작은 분자들에 대하여 투과성을 설명한다. 예를 들면, 4% 키토산 용액으로 준비된 고밀도 키토산 필름 또는 막은 Franz 쎌 기술을 이용한 인산염 완충된 염(PBS) 용액내에서 메틸렌 블루와 크리스탈 바이올렛(각각 Mw 285 및 373)에 투과성이었다. 상기 필름 또는 막은 선택된 작은 분자들에 대해 투과성임을 나타낸다. 동물, 포유류, 또는 인간에서 또는 내부의 영양분에 대한 투과성은 생리학적으로 유익함을 가질 수 있다.

고밀도 키토산 필름 또는 막의 생물학적 타당성의 추가 예증에서, 살아있는 포유류 세포를 막에 파종(seeded)하고, 최소한 3일 동안 배양 유지시켰다. 상기 막의 양 측면에서 세포 결합 및 세포 양립성이 관찰되었다. 또한 증식 및 세포 이동에 대한 증거도 나타났다. 현미경 상 분석으로 측정하였을 때, 케라틴형성세포의 이동은 다공성이 더 큰 표면(이를테면, 주형에서 상부 측면)과 비교하여 더 부드러운 표면(이를테면, 주형에서 바닥면)에서 가장 분명하였다. 이러한 결과는 시험관내 생물적합성의 증거를 제공한다.

고밀도 키토산 필름 또는 막의 생물학적 타당성의 추가 예증에서, 랫 입 구개(palate)의 온전한 두께의 외과적으로 유도된 궤양 기부에 상기 막을 외과적으로 배치하였을 때, 포유류 모델에서 상처 치유가 관찰되었다. 치유는 상기 궤양의 상피아래 매트릭스에서 콜라겐의 재-발달과 상기 궤양의 재-상피화(re-epithelialization)와 관련되었다. 막 이식 후 1 내지 12 주 동안 조직학적 분석에서 상기 고-밀도 키토산은 생체적합성이며, 생물분해가능하거나 또는 재흡착가능한 것으로 나타났다. 동물, 포유류, 또는 인간에서 또는 이들 내부에서 시간이 경과함에 따라 재흡수되는 물리적 방벽의 확립은 임상적 유용성을 갖는다. 예를 들면, 유사하지 않은 조직 사이(이를 테면, 뼈와 연조직)에 물리적 방벽은 상기 필름 또는 막의 반대 측면에서 차등적 속도의 치유를 촉진시킬 수 있다. 더욱이, 시험관내 효소 분해 속도를 고려하면, 생체내 재흡수율(하기 참고)은 고밀도 키토산 필름 또는 막의 DD 비율 및/또는 두께에 의존적인 것으로 유사하게 예측된다. 환언하면, 분해율은 DD 비율 및/또는 두께의 변화를 통하여 최소한 부분적으로 "통제가능"하다.

임상적 기능 및 용도에 대한 밀도 관련성의 예증은 건조 키토산 필름 또는 막의 밀도와 다른 물리적 성질 이를 테면, 인장 강도 사이의 강력한 연관성이다. ASTM 표준 방법에 약간의 변형(이를 테면, 장력 테스트의 경우 ASTM 표준 방법 D 1708-06a에 따라 반-타원 주형 컷-아웃 대신에 반-원이고 ~ 2.5 mm (ASTM 2006)의 최소 폭을 보유하는 스트립(strip); 봉합의 인발(suture pull-out)의 경우, ~ 5 mm 폭을 가진 스트립)을 이용하여 본 발명의 생성된 고밀도 키토산 필름 또는 막을 특징화하였다. 본 발명에서 청구된 방법에 의해 생성된 고밀도 키토산 필름 또는 막은 막 밀도와 인장 강도 사이에 직접적인 관련성을 보여준다. 일반적으로, Instron 기계를 이용하여 테스트될 때, 배취(batch) 간 생산에서 실험적 가변성을 가진(이를 테면, 출발 키토산 용액의 양, 1 mm 미만 그리고 전형적으로 0.2 내지 0.6 mm의 건조 막 두께, 70% 내지 95% 범위의 DD 비율, 상이한 판매자로부터 얻은 원재료, 임의로 존재하는 경우 건조 후 공정 변경, 등) 다양한 본 발명의 고밀도 키토산 필름 또는 막은 다음의 전형적인 범위의 물리적 성질을 산출한다: (a) 대략 2 내지 14 N의 최대 장력 하중 (~2.5 mm 최소 폭); (b) 대략 20 내지 140 MPa의 최대 인장 스트레스(~2.5 mm 최소 폭); 그리고 (c) 대략 0.5 내지 4.5 N의 봉합의 인발 최대 하중(~5 mm 폭).

임상 용도에 대한 본 발명의 고밀도 키토산 필름 또는 막의 물리적 특징의 타당성의 추가 예증은 밀도, 인장 강도, 탄성, 그리고 봉합의 인발 저항의 조합이며, 이들중 일부 또는 전부는 봉합가능한, 이식할 수 있는 외과용 막에 바람직한 성질들이다.

본 명세서에서 공개되고, 청구된 방법에 속한 키토산 탈아세틸화 타당성 예증에서, pH 6.5, 및 37℃에서 완충된 농축 라이소자임 용액 안에서 70% DD 막의 경우 분해가 8일 안에 완료되었고, 75% DD 막의 경우 11일 안에 분해가 완료되었고, 80%와 85% DD 막의 경우 18일 안에 분해가 부분적으로 완료되었고, 그리고 90% 및 95% 막의 경우 이들 조건하에서 3주 후에도 분해는 명백하지 않았다. 이러한 결과는 시험관내 효소 분해에 대한 상기 출발 중합체 재료의 고유의 민감성(이를테면 다양한 비율의 DD를 가진 키토산 분말)은 고밀도 키토산 필름 또는 막이 생산되는 동안 본 발명의 공정에 의해 파괴되지 않았음을 나타낸다. 더욱이, 본 발명의 고밀도 키토산 필름 또는 막은 pH 4 아래의 아세트산 용액 또는 완충된 용액에 두었을 때, 효소 분해없이 산 탈중합(및 가용화)에 대하여 여전히 불안정하다.

탈수 단계에 앞서 상기 중화된 그리고 중합된 키토산 겔을 글리세롤 용액 (이를 테면, 물에 10 또는 50% 글리세롤)으로 처리하는 것에 대한 타당성의 예증에서, 생성된 필름 또는 막은 상기 글리세롤 용액 단계 없이 생성된 필름 또는 막과 유사한 고밀도, 그리고 유익한 높은 인장 강도, 봉합의 인발 저항, 그리고 취급 특징 예를 들면, 유연성 및 커팅 용이성을 보유한다. 이러한 속성의 조합(이를테면, 물리적 성질 및 임상적 취급 특징)은 동물, 포유류, 또는 인간에서 상당한 사용 용도를 가진 필름 또는 막 재료를 제공한다.

본 출원을 통하여, 다양한 공개 자료가 언급된다. 이들 공개 자료는 본 발명이 속하는 기술 분야의 상태를 좀더 충분히 설명하기 위하여 본 명세서의 참고자료에 편입된다. 본 발명의 범위 또는 사상을 벗어나지 않고 다양한 변형 및 변화가 있을 수 있음을 당업자에게는 자명할 것이다. 본 발명의 다른 구체예들은 본 명세서에서 공개된 사항 및 실시로부터 당업자에게 자명할 것이다. 명세서 및 실시예는 오로지 예를 들어 설명한 것이며, 본 발명의 참된 범위 및 사상은 다음의 청구범위에서 나타난다.

참고 문헌

Claims

다음의 순서를 포함하는, 0.6g/㎤ 이상의 밀도를 가진 키토산 조성물을 생산하는 방법:
a) 물과 키토산의 산성 용액을 제공하며;
b) 중합된 겔을 형성하기 위하여 전술한 용액을 중화시키고; 그리고
c) 상기 겔은 동시에 탈수와 압착된다.
청구항 1에 있어서 가교 물질(cross-linking agent), 약제, 생물학적 물질, 핵산, 백신, 면역 효과물질(immune effector), 또는 이의 염으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 화합물 존재하에 물 또는 완충된 수성 용액에서 (c) 단계 이후 전술한 겔을 재-수화하는 단계를 더 포함하는, 방법.
청구항 1에 있어서 전술한 조성물은 2 mm 미만의 두께를 가진 필름 또는 막을 포함하는, 방법.
청구항 1에 있어서 전술한 용액은 물, 아세트산 그리고 키토산을 포함하는, 방법.
청구항 1에 있어서 전술한 키토산은 키토산 염기 또는 키토산 아세테이트, 키토산 숙시네이트, 키토산 아디페이트, 키토산 클로라이드, 키토산 글루타메이트, 키토산 락테이트, 키토산 아스파르테이트, 키토산 피루베이트, 키토산 포스페이트, 키토산 글리콜레이트, 키토산 아스코르베이트, 키토산 살리실레이트, 키토산 포르메이트, 그리고 키토산 말레이트로부터 선택된 염으로 존재하는, 방법.
청구항 1에 있어서 전술한 산성 용액은 포름산, 아세트산, 글리콜산, 시트르산, 젖산, 염화수소산, 글루탐산, 아스파르트산, 아스코르브산, 피루브산, 말산, 말레산, 푸마르산, 글루쿠론산, 소르브산, 엽산, 그리고 이의 혼합물들로부터 선택된 산을 포함하는, 방법.
청구항 1에 있어서 전술한 중화 단계 (b)에서 전술한 용액은 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 칼슘, 그리고 수산화 마그네슘으로부터 선택된 수산화물 염에 접촉되는 것을 포함하는, 방법.
청구항 1에 있어서 중화 단계 (b)에 앞서 전술한 산성 용액을 동결시키는 것을 더 포함하는 방법.
청구항 1에 있어서 탈수 단계 (c)에 앞서 물 또는 완충된 수성 용액에 전술한 겔을 세척하는 단계를 더 포함하는, 방법.
청구항 1에 있어서 탈수 단계 (c)에 앞서 물 또는 완충된 수성 용액 안의 전술한 겔의 pH가 5.5에서 7.5가 되도록 세척하는 단계를 더 포함하는, 방법.
청구항 1에 있어서 탈수 단계 (c)에 앞서 1 내지 50% 글리세롤 용액에 전술한 겔을 침잠(immersing)시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
청구항 1에 있어서 전술한 탈수는 압착 동안 전술한 겔에 진공을 제공하는 것을 포함하는, 방법.
청구항 1에 있어서, 전술한 탈수 단계 (c)에 앞서 수성 용액에 대하여 선택적 투과성인 막에 전술한 키토산 겔을 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
청구항 1에 있어서 전술한 키토산 겔은 2℃ 내지 150 ℃ 온도의 열 존재하에 탈수되는, 방법.
청구항 1에 있어서 전술한 압착 단계 (c)는 상기 키토산 겔에 최소 25 인치의 Hg 선형 압력의 제공을 포함하는, 방법.
청구항 1에 있어서, 전술한 키토산 필름 또는 막은 5.5 내지 7.5의 pH를 갖는, 방법.
a) 0.6g/㎤ 이상의 밀도를 가진 키토산 조성물을 제공하고; 그리고
b) 전술한 조성물을 동물에 또는 동물 안에 위치시키는 것을 포함하는 치료 방법.
청구항 17에 있어서 전술한 키토산 조성물은 0.8 g/㎤ 이상의 밀도를 갖는, 방법.
청구항 17에 있어서 전술한 배치(placing) 단계 (b)에 앞서, 전술한 조성물은 물 또는 완충된 수성 용액에서 수화되는, 방법.
청구항 17에 있어서 전술한 동물은 포유류 및 인간으로부터 선택되는, 방법.
청구항 17에 있어서, 전술한 배치(placing) 단계 (b)에 앞서, 전술한 조성물은 약제, 생물학적 물질, 핵산, 백신, 면역 효과물질, 또는 이의 염으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 화합물 존재하에 물 또는 완충된 수성 용액에서 수화되는, 방법.
0.6 g/㎤이상의 밀도를 갖는 필름 또는 막 안에 키토산이 포함된 조성물.
청구항 22에 있어서 0.6 g/㎤ 내지 1.6 g/㎤의 밀도를 갖는 조성물.
청구항 22에 있어서 0.8 g/㎤ 내지 1.6 g/㎤의 밀도를 갖는 조성물.
청구항 22에 있어서 5.0 내지 9.5의 pH를 갖는 조성물.
청구항 22에 있어서 글리세롤이 포함된 조성물.