CN103007336A

CN103007336A - 鱼皮胶原基复合海绵及其制备方法

Info

Publication number: CN103007336A
Application number: CN2013100120992A
Authority: CN
Inventors: 张其清; 陈名懋; 郭豪; 王建华; 伍久林
Original assignee: FUJIAN BMT BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: FUJIAN BMT BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-01-14
Filing date: 2013-01-14
Publication date: 2013-04-03

Abstract

本发明提供一种鱼皮胶原基复合海绵及其制备方法。它是以鱼皮胶原与壳聚糖为原料，冷冻干燥后经交联再进行二次冷冻干燥制备。由本发明制备的复合海绵，可改善胶原海绵易降解等缺点，且其制备过程简单、价廉易得，克服了现有胶原海绵的一些不足。本发明制备的鱼皮胶原基复合海绵具有Ⅰ型胶原蛋白特有的三螺旋结构，其微观结构为双面多孔网状片层，具有良好的吸湿性，并改善了胶原海绵的降解性，且其制备过程简单、价廉易得，是一种较好的生物医用材料。

Description

鱼皮胶原基复合海绵及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种鱼皮胶原基复合海绵及其制备方法。

背景技术

胶原蛋白是动物体内含量最丰富、分布最广泛的蛋白质。胶原蛋白具有独特的三螺旋结构、低抗原性、无毒性、良好的生物相容性和生物可降解性等特点，已被广泛应用于组织工程支架材料、止血海绵、药物控缓释系统、基因传递载体、美容外科等生物医用领域。目前，国内使用的胶原蛋白主要来自猪和牛的皮肤和跟腱，但随着疯牛病和口蹄疫等疾病的发生，使人们对它们的安全性产生了质疑；由于宗教和习俗等原因，猪来源的胶原蛋白在某些地区的应用受到了限制。因此，迫切需要寻求质量和安全性更好的胶原蛋白来源。

我国每年鱼鳞鱼皮等水产品废弃物约有40多万吨，这些水产品废弃物均含有丰富的胶原蛋白（如皮、骨、鳞等），其氨基酸组成与陆生哺乳动物胶原无明显差异，且其不存在人畜共患的传染性疾病，具有极大的开发和利用价值，但这些废弃物除小部分被用于生产饲料外，大部分却被丢弃 (Trends in Food Science & Technology, 2008, 19: 644-656)。因此，开发鱼皮等水产品废弃物的利用新途径，不仅可提高水产品加工的附加值，而且能减少环境污染，具有良好的经济和社会效益。

然而，作为生物医用材料，水产胶原与陆生哺乳动物胶原存在共同的缺点，如体内降解快，柔韧性差等，限制了其应用。壳聚糖是天然多糖中唯一的碱性多糖，具有良好的生物相容性、生物可降解性、抗菌性、无毒性、低免疫原性、吸湿性、柔软性、促凝血、防粘连等特点，在一定程度上弥补了胶原蛋白的不足之处 (Curr. Pharm. Biotechnol., 2003, 4: 303)。此外，价格因素也是制约胶原蛋白类产品规模进入市场的条件之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种鱼皮胶原基复合海绵及其制备方法。由本发明制备的复合海绵，可改善胶原海绵易降解等缺点，且其制备过程简单、价廉易得，克服了现有胶原海绵的一些不足。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供的一种鱼皮胶原基复合海绵的制备方法，包括以下步骤：将鱼皮胶原蛋白与壳聚糖溶于体积分数为2%的乙酸溶液中，搅拌均匀，然后倒入透析袋，用体积分数为2%的乙酸溶液作为外液透析20-30h，冷冻干燥后添加交联剂进行交联，交联产物反复用蒸馏水冲洗至中性，二次冷冻干燥即得鱼皮胶原基复合海绵。

所述鱼皮胶原蛋白的制备方法如下：

1）鱼皮去鳞，剪碎洗净，于10-30倍原料重的含体积分数为0.1-1% H₂O₂的NaOH溶液中搅拌浸泡12-48 h，清水洗至中性；继续在异丙醇溶液中搅拌浸泡4 h，清水洗至中性；再在NaCl溶液中搅拌浸泡10 h，离心，去除废液，即得预处理的碎鱼皮；

2）将预处理的碎鱼皮与去离子水以料液比为1:5-1:10混合，匀浆，加入胃蛋白酶，调pH至2.0-4.0，酶解10-30 h，过滤、滤液低温离心，取上清液加入体积分数为2%乙酸溶液，过滤，滤液装入透析袋，用体积分数为2%的乙酸溶液作为外液透析24 h，冷冻干燥即得鱼皮胶原蛋白。

步骤1）所述鱼皮为包括鲢鱼、草鱼、青鱼、鳙鱼、鲨鱼在内的加工鱼皮副产物。

步骤1）所述NaOH溶液的浓度为0.01-0.1 mol/L，所述异丙醇溶液的体积分数为5-20%，NaCl溶液的质量分数为1-5%，搅拌浸泡的温度为0-20℃。

步骤2）所述胃蛋白酶占鱼皮的质量百分数为2-3%，酶解温度为4-10℃。

所述鱼皮胶原蛋白与壳聚糖的质量比为90-70:30-10，壳聚糖的脱乙酰度为70-90%。

所述交联剂为体积分数为0.2-0.3%的戊二醛或浓度为40-60mM的EDC，交联时间为12-24 h。

本发明还提供了由所述的制备方法制得的鱼皮胶原基复合海绵。

以上所采用的透析袋的截留分子量为8000～14000 Da。

所述交联剂还可以采用甲醛、戊二醛、EDC等。

本发明制备的鱼皮胶原基复合海绵具有Ⅰ型胶原蛋白特有的三螺旋结构，其微观结构为双面多孔网状片层，具有良好的吸湿性（膨胀率为2153%），并显著改善了胶原海绵的降解性能。在为期7 d的降解时间内，鱼皮胶原基复合海绵降解率由第1 d 的31.43%变为第7d 的77.15%。本材料制备过程简单、价廉易得，是一种较好的生物医用材料。

附图说明

图1是鱼皮胶原蛋白的原子力显微镜图。

图2是鱼皮胶原基复合海绵的场发射扫描电镜图。

具体实施方式

实施例1：鱼皮胶原基复合海绵的制备

1) 称取50 g剪碎洗净的鲢鱼鱼皮，置于1000 mL 0.01 mol/L NaOH溶液中（含1 mL H₂O₂），4℃搅拌浸泡48 h，清水洗至中性；将洗净的鱼皮置于300 mL蒸馏水和30 mL异丙醇中，4℃搅拌浸泡4 h，清水洗至中性；称取25.6 g NaCl溶于1000 mL水中，再将鱼皮浸泡在NaCl溶液中10 h，离心，去除废液，即得预处理的碎鱼皮。

2) 将上述碎鱼皮与500 mL去离子水混合，匀浆15 min，加入1.5g胃蛋白酶，调pH至2.0，10℃酶解10 h后过滤，滤液以8000 r/min低温离心20 min，取上清液。

3) 在上清液中加入2%的乙酸溶液，过滤，用体积分数为2%的乙酸溶液作为外液透析24 h，冷冻干燥即得鱼皮胶原蛋白。

4）将0.9g胶原和0.1 g壳聚糖溶于50 mL 2%的乙酸溶液，用体积分数为2%的乙酸溶液作为外液透析24 h，冷冻干燥；将一次冻干后胶原膜加入40mL 50 mM EDC溶液交联24 h，反复用蒸馏水冲洗至中性，二次冷冻干燥，即得鱼皮胶原基复合海绵。

实施例2：鱼皮胶原基复合海绵的制备

1) 称取50 g剪碎洗净的鲢鱼鱼皮，置于1000 mL 0.01 mol/L NaOH溶液中（含5 mL H₂O₂），4℃搅拌浸泡24 h，清水洗至中性；将洗净的鱼皮置于300 mL蒸馏水和30 mL异丙醇中，4℃搅拌浸泡4 h，清水洗至中性；称取25.6 g NaCl溶于1000 mL水中，再将鱼皮浸泡在NaCl溶液中10 h，离心，去除废液，即得预处理的碎鱼皮。

2) 将上述碎鱼皮与500 mL去离子水混合，匀浆15 min，加入1.3 g胃蛋白酶，调pH至3.0，6℃酶解20 h后过滤，滤液以8000 r/min低温离心20 min，取上清液。

4）将0.8 g胶原和0.2 g壳聚糖溶于50 mL 2%的乙酸溶液，用体积分数为2%的乙酸溶液作为外液透析24 h，冷冻干燥；将一次冻干后胶原膜加入50 mL 50 mM EDC溶液交联18 h，反复用蒸馏水冲洗至中性，二次冷冻干燥，即得鱼皮胶原基复合海绵。

实施例3：鱼皮胶原基复合海绵的制备

1) 称取50 g剪碎洗净的鲢鱼鱼皮，置于1000 mL 0.01 mol/L NaOH溶液中（含10 mL H₂O₂），4℃搅拌浸泡12 h，清水洗至中性；将洗净的鱼皮置于300 mL蒸馏水和30 mL异丙醇中，4℃搅拌浸泡4 h，清水洗至中性；称取25.6 g NaCl溶于1000 mL水中，再将鱼皮浸泡在NaCl溶液中10 h，离心，去除废液，即得预处理的碎鱼皮。

2) 将上述碎鱼皮与500 mL去离子水混合，匀浆15 min，加入1.0 g胃蛋白酶，调pH至4.0，4℃酶解30 h后过滤，滤液以8000 r/min低温离心20 min，取上清液。

4）将0.7 g胶原和0.3 g壳聚糖溶于50 mL 2%的乙酸溶液，用体积分数为2%的乙酸溶液作为外液透析24 h，冷冻干燥；将一次冻干后胶原膜加入60 mL 50 mM EDC溶液交联12 h，反复用蒸馏水冲洗至中性，二次冷冻干燥，即得鱼皮胶原基复合海绵。

实施例4：鱼皮胶原基复合海绵的吸湿性和降解性实验

1）吸湿性实验：分别称取一定量的胶原和胶原-壳聚糖复合膜（为W₁），放于培养皿中加入一定量的水，于37℃下放置24h，分别称其重量（为W₂），膨胀率（%）=（W₂－W₁）/W₁×100，每个实验平行做3次，取其平均值，结果如下：

Figure 2013100120992100002DEST_PATH_IMAGE001

从上表可知，胶原和胶原-壳聚糖复合膜的膨胀率差不多，而胶原的吸水性比较好，所以鱼皮胶原基复合海绵具有良好的吸湿性。

2）降解率实验：分别称取5mg胶原和胶原-壳聚糖复合膜于5ml离心管中，加入1ml0.1M PBS（pH=7.4）浸泡1h，在37℃下加入0.05MCaCl₂和200U胶原酶，分别放置1d、3d、5d、7d，然后把离心管放入冰浴中加入0.2ml0.25M EDTA使反应停止，在4℃、5000r/min下离心15min，取上清液加入3ml 6M HCl于室温下水解24h，用紫外分光光度计在561nm处测其吸光度，根据羟脯氨酸标准回归曲线求出其上清液中羟脯氨酸的浓度，用下面的公式求其降解率：

降解率（%）=Mq/M_T×100%

Mq:上层液中羟脯氨酸的含量；mg/L

M_T:材料中胶原的质量：mg

每个实验平行做3次，取其平均值，结果如下：

从上表可知，在相应的时间下，胶原-壳聚糖复合膜的降解率要低于胶原的降解率，在一定程度上克服了胶原易降解的特点。

Claims

1.一种鱼皮胶原基复合海绵的制备方法，其特征在于：将鱼皮胶原蛋白与壳聚糖溶于体积分数为2%的乙酸溶液中，搅拌均匀，然后倒入透析袋，用体积分数为2%的乙酸溶液作为外液透析20-30h，冷冻干燥后添加交联剂进行交联，交联产物反复用蒸馏水冲洗至中性，二次冷冻干燥即得鱼皮胶原基复合海绵。

2.根据权利要求1所述的鱼皮胶原基复合海绵的制备方法，其特征在于：所述鱼皮胶原蛋白的制备方法如下：

3.根照权利要求2所述的鱼皮胶原基复合海绵的制备方法，其特征在于：步骤1）所述鱼皮为包括鲢鱼、草鱼、青鱼、鳙鱼、鲨鱼在内的加工鱼皮副产物。

4.根照权利要求2所述的鱼皮胶原基复合海绵的制备方法，其特征在于：步骤1）所述NaOH溶液的浓度为0.01-0.1 mol/L，所述异丙醇溶液的体积分数为5-20%，NaCl溶液的质量分数为1-5%，搅拌浸泡的温度为0-20℃。

5.根照权利要求2所述的鱼皮胶原基复合海绵的制备方法，其特征在于：步骤2）所述胃蛋白酶占鱼皮的质量百分数为2-3%，酶解温度为4-10℃。

6.根据权利要求1所述的鱼皮胶原基复合海绵的制备方法，其特征在于：所述鱼皮胶原蛋白与壳聚糖的质量比为90-70:30-10，壳聚糖的脱乙酰度为70-90%。

7.根据权利要求1所述的鱼皮胶原基复合海绵的制备方法，其特征在于：所述交联剂为体积分数为0.2-0.3%的戊二醛或浓度为40-60mM的EDC，交联时间为12-24 h。

8.如权利要求1-7中任一项所述的制备方法制得的鱼皮胶原基复合海绵。