CN103627768B - 鱼皮胶原蛋白生物活性小肽及其制备方法 - Google Patents

鱼皮胶原蛋白生物活性小肽及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鱼皮胶原蛋白生物活性小肽的制备方法，属于活性肽的应用技术领域。本发明首先取鱼皮胶原蛋白制成鱼皮胶原蛋白溶液，然后加入木瓜蛋白酶进行酶解得到胶原蛋白酶解液；然后利用超滤装置充分过滤胶原蛋白酶解液，去除滤渣得到鱼皮胶原蛋白生物活性小肽营养液。本发明制备方法中的原料来源广泛，工艺简单。

Description

鱼皮胶原蛋白生物活性小肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种鱼皮胶原蛋白生物活性小肽的制备方法，属于活性肽的应用技术领域。
背景技术
我国是水产大国，水产资源丰富。2009年，我国水产品总量就达到了5120万吨，2010年水产品总产量将达5350万吨，同比增长4.6％。但是，目前我国水产品加工仍以粗加工为主，精深加工产品的比例不高。鱼类在加工过程中产生出大量的鱼皮、鱼骨、鱼鳞等下脚料，约占原料鱼的40%~55%。鱼皮中含有丰富的蛋白质和多种微量元素，其蛋白质主要是大分子的胶原蛋白及粘多糖成分，胶原蛋白占粗蛋白的80%左右。可见，鱼皮是胶原蛋白的良好来源。然而，在生产中这些鱼皮废弃物基本用来生产廉价的饲料，或直接作为垃圾处理，造成资源浪费和环境污染。因此，充分利用水产加工下脚料，是水产品下脚料研究的当务之急与发展趋势。研究发现，小肽具有良好的抗氧化、抗肿瘤、降血压等生物活性。本发明利用鱼皮开发胶原蛋白生物活性小肽有利于利用鱼类加工下脚料，避免资源浪费和环境污染，增加水产附加值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鱼皮胶原蛋白生物活性小肽的制备方法，原料来源广泛，工艺简单。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
（1）鱼皮胶原蛋白酶解液的制备：取鱼皮胶原蛋白制成鱼皮胶原蛋白溶液，然后加入木瓜蛋白酶进行酶解得到胶原蛋白酶解液；
（2）鱼皮胶原蛋白生物活性小肽的制备：利用超滤装置充分过滤胶原蛋白酶解液，去除滤渣得到鱼皮胶原蛋白生物活性小肽营养液。
所述鱼皮胶原蛋白的制备：废弃物鱼皮去鳞，剪碎洗净，用20倍原料重的含有体积分数为1%的H2O2的0.01mo/LNaOH溶液在20℃下搅拌浸泡4h，用清水洗至中性；再用20倍原料重的质量分数为10%异丙醇在室温下搅拌浸泡24h，用清水洗净后，用20倍原料重的0.5M乙酸浸提48h，离心分离去除不溶性物质，不溶性物质再用0.5M乙酸浸提48h后，离心，合并两次浸提液，冻干即得鱼皮胶原蛋白。
所述鱼皮胶原蛋白溶液的制备方法：取鱼皮胶原蛋白，加100倍重量的20mmol/LpH7.4的磷酸缓冲液在40～50℃水浴锅内搅拌溶解制成鱼皮胶原蛋白溶液。
所述酶解的条件为：用2MHCl或1MNaOH调整鱼皮胶原蛋白溶液pH至7.4后，按酶：鱼皮胶原蛋白=3:100的质量比例加入木瓜蛋白酶，在37℃中反应4h获得胶原蛋白酶解液。
所述鱼皮胶原蛋白生物活性小肽营养液中小肽分子量小于1000道尔顿。制备的胶原蛋白生物活性小肽具有良好的抗氧化和抗肿瘤活性。
本发明的有益效果：（1）本发明利用鱼皮开发胶原蛋白生物活性小肽有利于利用鱼类加工下脚料，避免资源浪费和环境污染，增加水产附加值。（2）本发明制备方法中的原料来源广泛，工艺简单。
附图说明
图1为小肽溶液的抗肿瘤活性，其中（a）:小肽溶液对平滑肌细胞的抑制；（b）:小肽溶液对A375肿瘤细胞的抑制活性。
具体实施例
废弃物鱼皮去鳞，剪碎洗净，用20倍原料重的含有体积分数为1%的H2O2的0.01mo/LNaOH溶液在20℃下搅拌浸泡4h，用清水洗至中性；再用20倍原料重的质量分数为10%异丙醇在室温下搅拌浸泡24h，用清水洗净后，用20倍原料重的0.5M乙酸浸提48h，离心分离去除不溶性物质，不溶性物质再用0.5M乙酸浸提48h后，离心，合并两次浸提液，冻干即得鱼皮胶原蛋白。所述的废弃物鱼皮为鲢鱼、草鱼、青鱼、鳙鱼、鲨鱼或鳗鱼的加工鱼皮副产物。
利用酸提法制备胶原蛋白，称取1.0g胶原蛋白用100ml20mmol/L磷酸缓冲液(pH7.4)在45℃搅拌水浴锅内搅拌溶解制成胶原蛋白水溶液；用2MHCl或1MNaOH调整溶液pH至7.4后，按酶：胶原蛋白=3:100的质量比例加入木瓜蛋白酶(购自Sigma生物试剂公司（中国·上海）)，在37℃中反应4h获得胶原蛋白酶解液；然后利用超滤装置，使用1000Da的PVDF膜，进行膜过滤，滤出液即为胶原蛋白活性小肽。采用高效液相色谱法测定分子量，主要出峰位置在300-700道尔顿，即2-8个氨基酸组成的小肽。测定小肽溶液的抗氧化活性，从表1可知，小肽溶液DPPH·清除能力达到86.53%，还原能力达到0.273，具有较强的抗氧化活性。小肽溶液的抗肿瘤活性见图1，从图1可知，胶原小肽对平滑肌细胞没有抑制活性，而对A375肿瘤细胞具有抑制活性。小肽的氨基酸组成见表2。
表1：小肽溶液（1mg/mL）的抗氧化活性
表2：胶原蛋白活性肽的氨基酸组成
以上所述仅为发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (1)

1.一种鱼皮胶原蛋白生物活性小肽的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括以下步骤：
（1）鱼皮胶原蛋白酶解液的制备：取鱼皮胶原蛋白制成鱼皮胶原蛋白溶液，然后加入木瓜蛋白酶进行酶解得到胶原蛋白酶解液；
（2）鱼皮胶原蛋白生物活性小肽的制备：利用超滤装置，使用1000Da的PVDF膜，进行膜过滤，去除滤渣得到鱼皮胶原蛋白生物活性小肽营养液,所述鱼皮胶原蛋白生物活性小肽营养液中小肽分子量小于1000道尔顿；
所述鱼皮胶原蛋白的制备：废弃物鱼皮去鳞，剪碎洗净，用20倍原料重的含有体积分数为1%的H2O2的0.01mo/LNaOH溶液在20℃下搅拌浸泡4h，用清水洗至中性；再用20倍原料重的质量分数为10%异丙醇在室温下搅拌浸泡24h，用清水洗净后，用20倍原料重的0.5M乙酸浸提48h，离心分离去除不溶性物质，不溶性物质再用0.5M乙酸浸提48h后，离心，合并两次浸提液，冻干即得鱼皮胶原蛋白；
所述鱼皮胶原蛋白溶液的制备方法：取鱼皮胶原蛋白，加100倍重量的20mmol/LpH7.4的磷酸缓冲液在40～50℃水浴锅内搅拌溶解制成鱼皮胶原蛋白溶液；
所述酶解的条件为：用2MHCl或1MNaOH调整鱼皮胶原蛋白溶液pH至7～8后，按酶：鱼皮胶原蛋白=3:100的质量比例加入木瓜蛋白酶，在37℃中反应4h获得胶原蛋白酶解液。
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