CN103289968B - 从甘薯的水溶性提取液中分离和制备多酚氧化酶、β-淀粉酶和储藏蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种从甘薯的水溶性提取液中分离和制备多酚氧化酶、β-淀粉酶和储藏蛋白的方法，采用等电点沉淀和丙酮分级沉淀技术，依次分离出甘薯的多酚氧化酶、β-淀粉酶和储藏蛋白，还有水溶性糖类等小分子有机物。本发明步骤简单、分离和回收率高、生产成本低和节能环保。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白质分离和制备技术，尤其涉及一种从甘薯的水溶性提取液中分离和制备多酚氧化酶、β-淀粉酶和储藏蛋白的方法。
背景技术
我国是世界上最大的甘薯生产国，年产甘薯1亿吨以上，占世界总产量的80%以上。据统计，我国甘薯约50%用于生产淀粉及其加工产品。甘薯用于淀粉的生产，不仅产品附加值低、经济效益差，淀粉生产过程中会排放大量含可溶性蛋白和糖类的废水，浪费资源和造成严重的环境污染。甘薯可溶性蛋白中含多酚氧化酶、β-淀粉酶、储藏蛋白等多种功能活性蛋白质。多酚氧化酶可用于红茶发酵和催化合成茶黄素与茶红素等药用成分，也可用于有机废水处理和生物传感器等领域。β-淀粉酶广泛应用于啤酒、面包、酱油、麦芽糖的生产，在医药领域作为消化剂使用。甘薯储藏蛋白具有胰蛋白酶抑制剂的活性，有广泛的研究与应用价值。此外，甘薯中还含有占干物质15%的水溶性糖类，是丰富的营养源。目前甘薯产业缺乏综合开发和利用的技术和方法。
目前甘薯产业存在的问题是：
1）甘薯资源利用率低、产品经济经济值低。
2）甘薯生产淀粉过程中排放大量的废水，不仅浪费资源，而且造成环境污染。
3）甘薯高附加值产品开发落后，特别是缺少系统的综合利用技术。
发明内容
本发明的目的是，提供一种简单、高效、低成本和节能环保的从甘薯和甘薯生产淀粉的废水中同时提取、分离和生产多酚氧化酶、β-淀粉酶和储藏蛋白等的方法。
为达到以上技术目的，本发明采用的技术方案如下：
一种从甘薯的水溶性提取液中分离和制备多酚氧化酶、β-淀粉酶和储藏蛋白的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
（1）获取甘薯的水溶性提取液；
（2）将（1）中的所述提取液调节pH值至包括多酚氧化酶的等电点的范围，静置，分离沉淀和上清；
（3）所述（2）的沉淀用不超过获得该沉淀的甘薯鲜重的水或缓冲液溶解后，加入丙酮至丙酮终浓度为30%～60%，静置，分离沉淀和上清，其沉淀为甘薯的多酚氧化酶；
（4）所述（2）的上清加入丙酮至丙酮终浓度为30%～60%，静置，分离沉淀和上清，其沉淀为甘薯的β-淀粉酶；
（5）合并所述（3）和（4）的上清，加入丙酮至丙酮终浓度为70%～90%，静置，分离沉淀和上清，其沉淀为甘薯的储藏蛋白；
（6）将所述（3）至（5）得到的组分分别浓缩和干燥保存。
进一步地，所述步骤（1）至（5）在4℃至室温下进行。
进一步地，所述（1）的提取液为甘薯生产淀粉过程中产生的废水或浓缩液。
可选择地，所述（1）的提取液通过以下制备方法获得：
（a）将洗净的新鲜甘薯打碎至糜状；
（b）用所述（a）中甘薯鲜重一倍至数倍体积的自来水、饮用水、蒸馏水或缓冲液将所述（a）的糜状甘薯浸泡0.5小时；
（c）分离所述（b）中的沉淀和上清，其上清为甘薯的水溶性提取液。
更进一步地，所述（2）中的pH值调节至3.0～5.0；静置时间为0.5～1.0小时。所述步骤（3）、（4）和（5）中的静置时间为1小时。
所述步骤（6）的干燥方法为真空冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥。
进一步地，还包括步骤（7），回收所述（5）中的上清的丙酮，得甘薯的小分子有机物，干燥后保存。具体地，所述步骤（7）采用减压蒸馏回收丙酮。
与现有技术相比较，本发明具有如下优势：
1）采用等电点沉淀和丙酮的分级沉淀技术，分离出多酚氧化酶、β-淀粉酶和储藏蛋白，步骤简单、设备投资少、生产成本低，适合批量处理，可用于生产实践中；
2）分离得到的多酚氧化酶和β-淀粉酶能保持高的酶活性，有利于该分离产物的高效利用；
3）系统地从新鲜甘薯中提取分离或从甘薯的生产废水中回收全部水溶性成分，使甘薯资源得到高效和综合利用，既减少了污染，又增加了甘薯附加值；
4）提取用的丙酮可完全回收重复利用，实现了生产过程中的无污染和零排放。
附图说明
图1为本发明从甘薯的水溶性提取液中分离和制备多酚氧化酶、β-淀粉酶和储藏蛋白的方法的流程图。
图2为本发明从甘薯的水溶性提取液中分离和制备多酚氧化酶、β-淀粉酶和储藏蛋白的方法中在不同pH值条件下多酚氧化酶和β-淀粉酶的沉淀情况。
图3为本发明从甘薯的水溶性提取液中分离和制备多酚氧化酶、β-淀粉酶和储藏蛋白的方法中在不同浓度的丙酮下多酚氧化酶和β-淀粉酶的沉淀情况。
图4为本发明从甘薯的水溶性提取液中分离和制备多酚氧化酶、β-淀粉酶和储藏蛋白的方法中在不同浓度的丙酮下储藏蛋白的沉淀情况。
图5为本发明从甘薯的水溶性提取液中分离和制备多酚氧化酶、β-淀粉酶和储藏蛋白的方法所获得的各组分的纯度测定情况。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细描述。
实施例1
如图1的流程图所示，直接利用甘薯生产淀粉的废水或浓缩液为甘薯的水溶性提取液，甘薯的多酚氧化酶、β-淀粉酶、储藏蛋白和水溶性糖类等小分子有机物的提取步骤如下：
（1）获取甘薯生产淀粉的废水或浓缩液；
（2）将（1）调节pH值至3.0～5.0，在室温或低温（4℃）静置0.5～1.0小时，离心或过滤后得沉淀和上清；
（3）所述（2）中的沉淀用不超过获得该沉淀的甘薯鲜重等量的水或缓冲液溶解，加入丙酮至丙酮的终浓度为30%～60%，在室温或低温（4℃）静置约1小时后离心或过滤，得沉淀和上清，该沉淀为甘薯的多酚氧化酶；
（4）所述（2）中的上清加丙酮至丙酮的终浓度为30%～60%，在室温或低温（4℃）静置约1小时后离心或过滤，得沉淀和上清，该沉淀为甘薯的β-淀粉酶；
（5）合并所述（3）和（4）的上清，加入丙酮至丙酮终浓度为70%～90%，在室温或低温（4℃）静置约1小时后离心或过滤，得沉淀和上清，其沉淀为甘薯的储藏蛋白；
（6）所述（5）中的上清通过减压蒸馏回收丙酮后，得甘薯的水溶性糖类等小分子有机物；
（7）将所述（3）至（6）得到的组分分别干燥，得到四种产品。
实施例2
如图1的流程图所示，利用新鲜甘薯制备甘薯的水溶性提取液，甘薯的多酚氧化酶、β-淀粉酶、储藏蛋白和水溶性糖类等小分子有机物的提取步骤如下：
（1）甘薯总的水溶性提取液的制备：将洗净的新鲜甘薯粉碎至糜状,用材料鲜重1倍至数倍体积的自来水、饮用水、蒸馏水或缓冲液将粉碎的材料浸泡约0.5小时，离心或过滤沉淀获得水溶性物质的提取液；
（2）将（1）调节pH值至3.0～5.0，在室温或低温（4℃）静置0.5～1.0小时，离心或过滤后得沉淀和上清；
（3）所述（2）中的沉淀用不超过获得该沉淀的甘薯鲜重等量的水或缓冲液溶解，加入丙酮至丙酮的终浓度为30%～60%，在室温或低温（4℃）静置约1小时后离心或过滤，得沉淀和上清，该沉淀为甘薯的多酚氧化酶；
（4）所述（2）中的上清加丙酮至丙酮的终浓度为30%～60%，在室温或低温（4℃）静置约1小时后离心或过滤，得沉淀和上清，该沉淀为甘薯的β-淀粉酶；
（5）合并所述（3）和（4）的上清，加入丙酮至丙酮终浓度为70%～90%，在室温或低温（4℃）静置约1小时后离心或过滤，得沉淀和上清，其沉淀为甘薯的储藏蛋白；
（6）所述（5）中的上清通过减压蒸馏回收丙酮后，得甘薯的水溶性糖类等小分子有机物；
（7）将所述（3）至（6）得到的组分分别干燥，得到四种产品。
实施例3
请参考图2，多酚氧化酶和β-淀粉酶的等电点不同，在等电点沉淀的过程中，在设计的pH值范围（3.0～5.0）下，多酚氧化酶的蛋白分子主要分布在沉淀组分中，而β-淀粉酶的蛋白分子主要存在于上清组分中。通过多酚氧化酶和β-淀粉酶的活性染色表明，经过等电点沉淀得到的酶蛋白仍然保持催化活性。
请参考图3，在丙酮沉淀过程中，多酚氧化酶和β-淀粉酶可在较低浓度的丙酮（30%～60%）中沉淀，并且得到的沉淀杂质少，通过活性染色表明，丙酮沉淀得到的酶蛋白仍然保持催化活性。
请参考图4，甘薯的水溶性提取液去除多酚氧化酶和β-淀粉酶的蛋白成分后，溶液中的甘薯储藏蛋白需要在较高浓度的丙酮（70%～90%）下沉淀得到。
请参考图5，将经过干燥的多酚氧化酶、β-淀粉酶和储藏蛋白重新溶解并进行电泳分离，分别得到条带简单的蛋白组分，表明经过所述实施例1或实施例2的步骤分离制备的多酚氧化酶、β-淀粉酶和储藏蛋白纯度高；另外，通过对多酚氧化酶和β-淀粉酶的活性染色表明，经过上述步骤分离制备的多酚氧化酶和β-淀粉酶仍然保持催化活性。
综上所述，本发明从甘薯的水溶性提取液中分离和制备多酚氧化酶、β-淀粉酶和储藏蛋白的方法步骤简单、分离和回收率高、生产成本低成本和节能环保。
因此，上述实施例为本发明较佳的实施方式，但并不仅仅受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，均包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种从甘薯的水溶性提取液中分离和制备多酚氧化酶、β-淀粉酶和储藏蛋白的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)获取甘薯的水溶性提取液；
(2)将(1)中的所述提取液调节pH值至3.0～5.0，该pH值的范围包括多酚氧化酶的等电点值，静置0.5～1.0小时，分离沉淀和上清；
(3)所述(2)的沉淀用不超过获得该沉淀的甘薯鲜重的水或缓冲液溶解后，加入丙酮至丙酮终浓度为30％～60％，静置1小时，分离沉淀和上清，其沉淀为甘薯的多酚氧化酶；
(4)所述(2)的上清加入丙酮至丙酮终浓度为30％～60％，静置1小时，分离沉淀和上清，其沉淀为甘薯的β-淀粉酶；
(5)合并所述(3)和(4)的上清，加入丙酮至丙酮终浓度为70％～90％，静置1小时，分离沉淀和上清，其沉淀为甘薯的储藏蛋白；
(6)将所述(3)至(5)得到的组分分别浓缩和干燥保存。
2.如权利要求1所述的从甘薯的水溶性提取液中分离和制备多酚氧化酶、β-淀粉酶和储藏蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(1)至(5)在4℃～室温下进行。
3.如权利要求1所述的从甘薯的水溶性提取液中分离和制备多酚氧化酶、β-淀粉酶和储藏蛋白的方法，其特征在于：所述(1)的提取液为甘薯生产淀粉过程中产生的废水或浓缩液。
4.如权利要求1所述的从甘薯的水溶性提取液中分离和制备多酚氧化酶、β-淀粉酶和储藏蛋白的方法，其特征在于，所述(1)的提取液的制备方法包括以下步骤：
(a)将洗净的新鲜甘薯打碎至糜状；
(b)用所述(a)中甘薯鲜重一倍至数倍体积的自来水、饮用水、蒸馏水或缓冲液将所述(a)的糜状甘薯浸泡0.5小时；
(c)分离所述(b)中的沉淀和上清，其上清为甘薯的水溶性提取液。
5.如权利要求1所述的从甘薯的水溶性提取液中分离和制备多酚氧化酶、β-淀粉酶和储藏蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(6)的干燥方法为真空冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥。
6.如权利要求1所述的从甘薯的水溶性提取液中分离和制备多酚氧化酶、β-淀粉酶和储藏蛋白的方法，其特征在于：还包括步骤(7)，回收所述(5)中的上清的丙酮，得甘薯的小分子有机物，干燥后保存。
7.如权利要求6所述的从甘薯的水溶性提取液中分离和制备多酚氧化酶、β-淀粉酶和储藏蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(7)采用减压蒸馏回收丙酮。
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