CN102060934B

CN102060934B - 一种黑木耳多糖的酶法提取方法

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Publication number: CN102060934B
Application number: CN2010105834340A
Authority: CN
Inventors: 张拥军; 鲜乔; 何杰民; 李佳; 朱丽云
Original assignee: China Jiliang University
Current assignee: China Jiliang University
Priority date: 2010-12-11
Filing date: 2010-12-11
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2030-12-11
Also published as: CN102060934A

Abstract

本发明公开了一种黑木耳多糖的酶法提取方法，包括如下步骤：取干燥黑木耳机械粗粉碎，过筛，然后按照1∶50～200的料水比混合，在几丁质酶作用下于35～50℃、pH 5.0～9.0及几丁质酶添加量为100～600U/g的条件下提取60～180min；再将提取温度提高到80～95℃提取60～180min，所得提取液离心后得到上清液与沉淀物；取上清液加入乙醇沉淀多糖，离心分离得到沉淀物，沉淀物用水溶解，浓缩除去残留的乙醇，然后在浓缩液中加入硅藻土与活性炭的混合物，混合充分搅拌后，过滤，取滤液用30～100kD的聚砜膜进行膜过滤，收集未滤过膜的大分子浓缩液，将大分子浓缩液进行干燥得到黑木耳多糖。本发明制得产品纯度高，其中多糖含量可高达40％以上，生物活性高。

Description

一种黑木耳多糖的酶法提取方法

(一)技术领域

本发明涉及一种酶法制备黑木耳多糖的方法。

(二)背景技术

黑木耳Auricularia auricula(L.exHook.)Underwood，又称光木耳、细木耳、云耳，是一种大型真菌，属于担子菌纲，木耳目、木耳科、木耳属。大量的医学和药理学研究表明，黑木耳多糖具有抗血小板聚集、抗肿瘤、抗衰老、抑菌、降血糖、调节免疫功能、抗溃疡、抗肝炎和抗突变、降血脂和促进血清蛋白生物合成等功效，并提出黑木耳具有润肺、清涤胃肠、减肥、利于体内有毒物质的及时清除和排出等功能均与其含有的丰富的非淀粉多糖有关。如李文宁(2003)在专利“黑木耳多糖保健品的制备方法”中，提出一种快速的黑木耳多糖保健品的制备方法，将黑木耳放入3-10％的草酸或3-10％的氢氧化钠溶液中浸泡后，在70℃下干燥10-30分钟，利用粉碎设备将干燥后的黑木耳粉碎制成口服剂；Muraki Shigeru等(1988)在日本专利“黑木耳多糖的制备”中，采用热水抽提、超滤膜过滤、酒精沉淀等方法制备的分子量在10万～20万之间的黑木耳多糖，对机体免疫有调节作用；Chan等(2002)在美国专利“黑木耳多糖的制备及其在动物中应用”中，提出黑木耳多糖有降动物血清总胆固醇的作用；Byun Yu Ryang等(2004)在欧洲专利“黑木耳多糖提取物对作用于胃壁细胞的helicobacter pylori有抑制作用，可作为功能性添加剂”，提出了黑木耳多糖的制备方法，并提出黑木耳多糖对由helicobacter pylori引起的胃病有良好的治疗效果，且没有任何毒副作用。因此，黑木耳多糖制成的药品和保健品深受人们喜爱，开发前景广阔。

尽管黑木耳多糖的多种生物活性已被证实，但至今还没有开发出象香菇多糖、灵芝多糖等能够应用的产品。因此，在黑木耳多糖提取与应用过程中如何确保其活性最大程度的保留已是当务之急。

由于黑木耳细胞壁的关键组分几丁质和β-葡聚糖，质地异常坚韧，故破壁处理是提取多糖首要考虑的问题。破壁方法中酶法操作是重要手段之一。选用适当的酶(系)，可以使细胞壁与间质中的关键组分降解，减小传质屏障对多糖扩散的传质阻力，有效地使目标物溶出，并控制非目标物的溶出，为后续精制创造有利条件。

细胞壁溶解酶是几种酶的复合物，同其他酶一样具有高度专一性，蛋白酶只能水解蛋白质，葡聚糖酶只对葡聚糖起作用，因此利用溶酶系统处理细胞必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的使用次序。Asenjo等人对酵母细胞的酶溶进行了研究，分析了溶解机理，建立了数学模型，设计了反应器。Asenjo提出了酵母细胞结构模式，细胞壁由甘露糖-蛋白质层和葡聚糖层组成，加入溶酶后，蛋白酶打开了外层上的蛋白质-甘露糖结构，使二者溶解，裸露出的内层受到葡聚糖酶攻击，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释放出胞内质。国内在酶法破碎真菌细胞壁方面，蹇华丽(2005)以环状芽饱杆菌A1.383为出发菌株，对其进行诱变后，获得了一株稳定高产胞壁溶解酶的突变株A1.383-2，其胞壁溶解酶产量比亲株提高了116.9％。通过对B.circulars A1.383-2发酵产酶条件的优化，得出其高产胞壁溶解酶的适宜条件为：碳源采用10g/L的酵母葡聚糖、氮源采用总浓度为4g/L的蛋白胨与(NH₄)₂SO₄混合液、接种量6％～10％(v/v)、摇瓶装液量250mL、三角瓶装液40mL、发酵温度30℃～35℃，培养基初始pH 6.5～7.0。并通过单因素及均匀实验设计，确定了将B.circulars A1.383-2胞壁溶解酶用于红法夫酵母破壁提取虾青素的最佳酶作用条件。

国内外酶解破壁的专利检索情况如下，国内相关专利如卢挺(2002)在专利“油菜蜂花粉生物破壁技术”中，将曲酶属、酵母属和丹麦强力复合酶ViscozymeL加入花粉溶液酶解破壁0.5～72小时，酶解破壁温度为25℃～60℃；林陆山(2005)在专利“一种动植物和微生物细胞壁溶解酶反应液及其应用”中描述了一种酶解技术，采用细胞壁溶解酶(以枯草杆菌Bacillus SubtilisK-77或枯草杆菌Bacillus Subtilis YT-25，蜡状芽孢杆菌BM CirlulansAL.1为菌种制备的溶解酶)进行破壁处理，提取细胞内的小分子蛋白、游离氨基酸、亚麻酸和多肽等生物活性物质；齐崴等(2006)在专利“复合酶水解丹参强化提取丹参多酚酸的方法”中，将纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶中的两种或多种复合酶配制成复合酶系进行有效破壁，制得具有多种缩酚酸类功效物质的丹参水溶性提取物干粉；李森柱等(2006)在专利“全灵芝孢子油的制备方法”中，利用菌丝生长过程中不断分泌的纤维素酶、蛋白酶、果胶酶等多种复合酶来酶解孢子壁制备三萜类化合物。国外关于酶法破壁方面的专利，Schroder Glad等(2003)在美国专利“不同的细胞壁溶解酶”中，对来源不同的细胞壁溶解酶的分子结构及理化性质进行了描述。

酶法破壁由于作用条件温和，无残留，是一种非常有前景的细胞破壁技术。传统的黑木耳多糖提取采用水提醇沉，多糖难以从胞内扩散出来；而酸、碱法容易破坏多糖的结构，降低其生物利用率。为黑木耳保健食品的开发提取一条新的工艺路线和方法，这对于黑木耳的综合开发及提高其经济价值具有实际意义。

(三)发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种以黑木耳为原料，利用特定酶结合热水浸提工艺，并结合超滤膜处理，进一步提纯多糖的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种黑木耳多糖的酶法提取方法，包括如下步骤：取干燥黑木耳机械粗粉碎，过40～100目筛，然后按照1∶50～200的料水比混合，在几丁质酶作用下于35～50℃、pH 5.0～9.0及几丁质酶添加量为100～600U/g的条件下提取60～180min；再将提取温度提高到80～95℃提取60～180min，所得提取液离心后得到上清液与沉淀物；取上清液加入乙醇沉淀多糖，离心分离得到沉淀物，沉淀物用水溶解，浓缩除去残留的乙醇，然后在浓缩液中加入硅藻土与活性炭的混合物，所述混合物加入的量为浓缩液质量的2～8wt％，所述混合物中硅藻土与活性炭的质量比为1∶1～4，混合充分搅拌后，过滤，取滤液用30～100kD的聚砜膜进行膜过滤，收集未滤过膜的大分子浓缩液，将大分子浓缩液进行干燥得到黑木耳多糖。

进一步，本发明优选料水比为1∶98。

进一步，本发明在几丁质酶作用下于42℃的条件下提取，提取时间优选为99min。

进一步，在上述技术方案中，优选将提取温度提高到85℃，提取120min。

进一步，本发明优选几丁质酶添加量为200～400U/g。

本发明优选所述的黑木耳多糖的酶法提取方法为：取干燥黑木耳机械粗粉碎，过60目筛，然后按照1∶98的料水比混合，在几丁质酶作用下于温度42℃、pH为8.0及几丁质酶添加量为400U/g的条件下提取99min，再将提取温度提高到85℃，提取120min，提取液离心后得到上清液与沉淀物，取上清液加入乙醇沉淀多糖，离心分离得到沉淀物，沉淀物用水溶解，浓缩除去残留的乙醇，然后在浓缩液中加入硅藻土与活性炭按质量比1∶3混合的混合物，所述混合物加入的量为浓缩液的2～8wt％，充分搅拌后，过滤，取滤液用50kD的聚砜膜进行膜过滤，收集未滤过膜的大分子浓缩液，将大分子浓缩液进行干燥得到黑木耳多糖。

进一步，优选所述硅藻土与活性炭按质量比1∶3混合的混合物的加入量为所述浓缩液的5wt％。

进一步，所述过滤优选使用板框过滤机，用6～8层滤布压滤。

进一步，本发明所述的大分子浓缩液干燥优选微波真空干燥，所述微波频率2450MHz，微波功率1kW，真空度为35-45mmHg，干燥5～30分钟。

进一步，本发明所述的用50kD的聚砜膜进行膜过滤，优选采用切向流过滤技术，即液体流动方向与过滤方向呈垂直方向的过滤形式，相对于常规的垂直流过滤有着能保持稳定的过滤速度、能连续循环进行过滤和在膜表面不形成凝胶层的特点。

本发明所述的几丁质酶是从浙江省食用菌生产基地的土壤中分离得到的地衣芽孢杆菌产生的。

本发明以黑木耳为原料，采用特异性的几丁质酶作用于黑木耳子实体，提高了多糖的得率，并结合超滤膜处理，进一步提纯多糖。发明的技术要点在于特定酶水解破壁并结合热水浸提，充分促使多糖有效溶出，并结合超滤膜处理，得到的多糖纯度高、活性破坏小。

本发明的有益效果主要体现在：

1.所制得产品纯度高，其中多糖含量可高达40％以上，生物活性高。

2.针对黑木耳细胞壁质地坚韧，细胞壁内所含有的多糖类物质很难透过细胞壁，筛选特异性的作用于黑木耳细胞壁的几丁质酶，可有效破壁，黑木耳粗多糖的得率可达12.36％，比传统的直接采用热水浸提得到的粗多糖提高了3.17倍，比采用商品化的果胶酶、蛋白酶得到的粗多糖分别提高了2.19倍、2.08倍。该工艺条件温和，不易损坏多糖结构，绿色环保，符合保健食品的生产要求。

3.采用聚砜膜，将切向流过滤技术应用到黑木耳多糖的制备中，在过滤的同时也对聚砜膜表面冲刷，使膜表面不会形成杂质，确保稳定快速的超滤速度，大大缩短工艺时间，提纯过程中的同时亦对样液进行浓缩，便于工业化生产。

(四)附图说明

图1为料液比与提取时间对多糖得率影响的响应面图；

图2为料液比与提取温度对多糖得率影响的响应面图；

图3为提取时间与提取温度对多糖得率影响的响应面图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

1材料与试剂

黑木耳(由浙江省富来森绿色产业集团公司提供)；中性蛋白酶，果胶酶，几丁质酶，3，5-二硝基水杨酸(DNS)，无水乙醇、浓硫酸、葡萄糖、苯酚，均为分析纯。

2实验仪器

UV-2100紫外可见分光光度计，Mettler Tolefo 320-S pH计，TOMY ES-315高压灭菌锅，ZHWY-2102C恒温摇床培养箱，精密增力电动搅拌器JJ-1，HH-2数显恒温水浴锅，DL-5M台式高速离心机，DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱，EL204电子天平。

3实验方法

3.1多糖提取技术路线

黑木耳粉碎，过60目筛→以1∶100的料水比，在pH值8.0下，400U/g的酶添加量，在45℃下提取1.65h→提高温度到85℃提取1.5h→过滤，收集滤液→加3倍体积95％的乙醇、混匀→置4℃冰箱沉淀过夜→3000r/min离心10min→沉淀水溶并稀释定容→多糖含量测定。

3.2多糖标准曲线制作

0.1mg/mL葡萄糖标准溶液：葡萄糖干燥恒重后准确称取1.000g，用去离子水溶解并定容至1L，然后梯度稀释到0.1mg/mL。分别取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6mL的葡萄糖标准溶液于试管中，补蒸馏水到2mL；混合均匀后分别加入5％苯酚1mL，浓硫酸5mL，摇匀；静置10min再放入30℃水浴锅15min；按后在分光光度计485nm下测吸光度值。

3.3多糖溶出量计算

多糖采用改良的苯酚-硫酸法对其进行含量测定，然后按下式计算多糖含量。

计算公式：

C——经过稀释后，测定的多糖含量(μg)

V——提取后得到的上清体积(mL)

N——稀释倍数

v——用于测定的上清体积(mL)

M——用于提取的黑木耳质量(mg)

3.4试验方法

先设置5因素多水平做单因素试验，后根据试验结果做中心组合设计。5个因素分别为料水比、提取时间、提取温度、提取pH、酶的添加量。

经各单因素提取条件实验后，设定pH和酶的添加量为固定因素，选择液料比、提取温度、提取时间为自变量，根据Box-Benhnken实验设计原理，采用三因素三水平的响应面分析法，研究了各个因素及其交互作用后对黑木耳多糖提取率的影响。

3.5统计及分析方法

统计方法：三因素5水平中心组合设计；分析方法：minitab中响应面分析程序。

3.6其他提取方法

在同等条件下比较热水浸提法、蛋白酶提取、果胶酶提取是在相同的酶添加量，料水比条件下，按各自最适合pH及温度提取，提取相同的时间。

3.7黑木耳多糖(APS)的进一步精制

按3.4方法优取出的最佳工艺，取提取的上清液，加入上清液质量5％的硅藻土活性炭的混合物(硅藻土与活性炭按质量比1∶3混合)，充分搅拌后，以板框过滤机用6层滤布压滤，取滤液用聚砜膜材料进行膜过滤，采用切向流超滤技术，使用50kD聚砜膜材料(北京特里高膜技术有限公司)，压力不超过0.4MPa，收集未滤过膜的大分子浓缩溶液，大分子浓缩溶液微波真空干燥，微波频率2450MHz，微波功率1kW，真空度为35mmHg，干燥得到黑木耳多糖。

4实验结果

4.1多糖标准曲线

由标准曲线得到计算公式：多糖含量(μg/mL)＝(OD₄₈₅+0.018)/0.0095，R²＝0.9975。

4.2响应面优化胞壁溶解酶作用条件

4.2.1部分因素设计及结果

按单因素实验结果，分别用x1、x2、x3、x4、x5来表示料水比、酶的添加量、pH、提取时间及提取温度，按方程Xi＝(xi-x0)/Δx对自变量进行编码，其中，Xi为变量的编码值，xi为变量的真实值，x0为实验中心点变量的真实值，Δx为步长。以3次实验所得多糖提取率的平均值为响应值(Y)。实验中所设计的变量及水平见表1。

表1部分因素设计水平及取值表

部分因素设计及结果分析分别见表2和表3。

表2部分因素设计分析结果

表3部分因素设计回归分析结果

对部分因素设计结果进行回归分析见表3。由表3可以看出，料水比、提取时间、提取温度的影响多糖得率的显著因素，他们都在95％的概率水平上差异显著，其他因素在这个水平上均不显著。因此，选择料水比、提取时间、提取温度进行下一步优化。

由试验结果拟合回归方程：Y＝8.423+0.371X1+0.089X2+0.081X3+0.196X4-0.306X5

由方差分析(ANOVA)可知，该方程模型在α＝0.05水平上拟合了试验数据，R-Sq(调整)＝95.26％，表明95.26％的试验数据可以用此方程解释。

根据部分因素回归分析结果，可以看出提取温度，提取时间，料水比对多糖得率有显著影响，而提取pH、酶添加量对多糖得率影响不显著，所以在下一步的培养基优化中不予考虑。

4.2.2中心组合试验设计和响应面分析结果

根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，综合单因素试验结果及部分因素结果，选取对多糖得率影响较大的3个因素，即：料水比、提取时间和提取温度，仍然以X1、X4、和X5表示。试验因素和水平设计见表4。试验设计及结果见表5，回归系数方差分析结果和回归模型方差分析分别见表6和表7。

表4分析因素及水平编码表

表5试验设计及结果

表6中心组合试验的回归系数方差分析结果

表7回归模型方差分析

回归方程中各变量对指标(响应值)影响的显著性，由F检验来判定，概率P(F＞Fα)的值越小，则相应变量的显著程度越高。由表6可以看出，各因素的一次项，二次项和交互项各因素对黑木耳多糖提取得率影响达到极显著水平(P＜0.01)，可得下面的回归方程：

Y＝11.1353+0.7757X1+0.2586X4-0.5833X5-1.3402X12-0.6064X42-1.0952X52-0.2134X1*X4-2.2934X1*X5-0.4376X4*X5

由表7可以看出F model＝999.52，P＝0.000＜0.01，表明模型回归效果极显著，不同处理间的差异极显著，相关系数R＝0.9979说明该模型拟合程度良好，响应值(提取率)的变化有99.79％来源于所选变量。

因此，回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该回归方程优化最佳提取工艺条件。由于响应面为三维图，其中Y轴为响应值，所以每次只可以对其中两个因素做响应面图，优化图结果分别见图1，图2，图3。

图1显示的是在X5＝0的条件下，X1和X4对Y的响应面，即料液比与提取时间对多糖得率影响的响应面图；图2显示的是在X4＝0的条件下，X1和X5对Y的响应面，即料液比与提取温度对多糖得率影响的响应面图；图3显示的是在X1＝0的条件下，X4和X5对Y的响应面，即提取时间与提取温度对多糖得率影响的响应面图。

应用Minitab15.0进行响应优化，得到结果为：X1＝0.764451，X4＝0.288793，X5＝-0.594573。代入前述的变换公式得到提取最佳工艺条件为：温度42.03℃，水料比97.64，提取时间1.644h，此时，多糖得率Y＝11.9992，合意性＝0.999601。考虑到实际情况将最佳提取工艺条件修正为温度42℃，时间1.65h，料液比1∶98。在此修正条件下，实际测得提取率为12.36％。

4.3多糖的进一步精制

取黑木耳粉20g，加水1960g，加几丁质酶400U/g，温度42℃条件下提取99min后再将温度升高到85℃，提取120min，离心并浓缩后，得上清液540ml，加3倍体积95％的乙醇、混匀，置4℃冰箱沉淀过夜，3000r/min离心10min，沉淀物水溶解浓缩后定容到300ml，将该300ml(300g，密度以水的密度计算)提取液，加入其质量9％(27g)的硅藻土活性炭的混合物(硅藻土与活性炭按质量比1∶3混合)，充分搅拌后，以板框过滤机用6层滤布压滤，取滤液用聚砜膜材料进行膜过滤，采用切向流超滤技术，使用50kD聚砜膜材料(北京特里高膜技术有限公司)，压力不超过0.4MPa，收集未滤过膜的大分子浓缩溶液，大分子浓缩溶液微波真空干燥，微波频率2450MHz，微波功率1kW，真空度为35mmHg，干燥9分钟得到黑木耳多糖2.842g，多糖含量43.16％。

比较例1

实验操作同实施例1，所不同的是，在步骤3.1中，黑木耳粉碎，过60目筛，取20g以1∶98的料水比，在85℃提取3.15h，离心浓缩后，得上清液510ml，加3倍体积95％的乙醇、混匀，置4℃冰箱沉淀过夜，3000r/min离心10min，沉淀水溶并稀释定容到300ml，再按照步骤3.7，将该300ml(300g，密度以水的密度计算)提取液，加入其质量9％(27g)的硅藻土活性炭的混合物(硅藻土与活性炭按质量比1∶3混合)，后续的步骤操作都同实施例1，得到黑木耳多糖0.772g，多糖含量31.54％。黑木耳多糖的溶出量见下表1。

表1不同工艺黑木耳多糖的溶出量

	黑木耳多糖热水提取	黑木耳多糖酶法提取
			多糖溶出量(％)	3.86	14.21

由表1可知，黑木耳的提取工艺对多糖的溶出量影响很大，先采用几丁质酶破壁处理再使用热水浸提可使多糖溶出量大大增长，多糖的溶出量是直接采用热水浸提的3.68倍。

比较例2

实验操作同实施例1，所不同的是，在步骤3.1中，黑木耳粉碎，过60目筛，取20g以1∶98的料水比，在pH值5.0下，加入0.04％的果胶酶，在45℃下提取1.65h后，提高温度到85℃提取1.5h，离心浓缩后，得上清液528ml，后续的步骤操作都同比较例1，得到黑木耳多糖0.986g，多糖含量33.65％。黑木耳多糖的溶出量见下表2。

表2不同酶提取黑木耳多糖的溶出量

	黑木耳多糖果胶酶提取	黑木耳多糖几丁质酶法提取
			多糖溶出量(％)	4.93	14.21

由表2可知，黑木耳采用不同酶提取对多糖的溶出量影响很大，对比果胶酶，采用特异性的几丁质酶可使多糖溶出量大大增长，多糖的溶出量是果胶酶提取的2.88倍。

比较例3

实验操作同实施例1，所不同的是，在步骤3.1中，黑木耳粉碎，过60目筛，取20g以1∶98的料水比，在pH值7.0下，加入0.2％的蛋白酶，在37℃下提取1.65h后，提高温度到85℃提取1.5h，离心浓缩后，得上清液516ml，后续的步骤操作都同比较例1，得到黑木耳多糖1.114g，多糖含量34.28％，黑木耳多糖的溶出量见下表3。

表3不同酶提取黑木耳多糖的溶出量

	黑木耳多糖蛋白酶提取	黑木耳多糖几丁质酶法提取
			多糖溶出量(％)	5.57	14.21

由表3可知，黑木耳采用不同酶提取对多糖的溶出量影响很大，对比蛋白酶，采用特异性的几丁质酶可使多糖溶出量大大增长，多糖的溶出量是蛋白酶提取的2.55倍。

比较例4

实验操作同实施例1，所不同的是，在步骤3.1中，黑木耳粉碎，过60目筛，取20g以1∶98的料水比，在pH值5.0下，加入0.2％的纤维素酶，在50℃下提取1.65h后，提高温度到85℃提取1.5h，离心浓缩后，得上清液507ml，后续的步骤操作都同比较例1，得到黑木耳多糖1.750g，多糖含量33.21％。黑木耳多糖的溶出量见下表4。

表4不同酶提取黑木耳多糖的溶出量

	黑木耳多糖纤维素酶提取	黑木耳多糖几丁质酶法提取
			多糖溶出量(％)	7.85	14.21

由表4可知，黑木耳采用不同酶提取对多糖的溶出量影响很大，对比纤维素酶，采用特异性的几丁质酶可使多糖溶出量大大增长，多糖的溶出量是纤维素酶提取的1.81倍。

实施例2

实验操作同实施例1，所不同的是在步骤3.1中，黑木耳粉碎，过60目筛，取20g以1∶98的料水比，在pH值8.0下，加几丁质酶200U/g，温度42℃条件下提取99min后再将温度升高到85℃，提取90min，后续的步骤操作都同实施例1，得到黑木耳多糖2.57g，多糖含量41.26％，黑木耳多糖的溶出量为12.85％。

实施例3

实验操作同实施例1，所不同的是在步骤3.1中，黑木耳粉碎，过60目筛，取20g以1∶98的料水比，在pH值8.0下，加几丁质酶600U/g，温度42℃条件下提取99min后再将温度升高到85℃，提取90min，后续的步骤操作都同实施例1，得到黑木耳多糖2.974g，多糖含量44.61％，黑木耳多糖的溶出量为14.87％。

实施例4

实验操作同实施例1，所不同的是在步骤3.1中，黑木耳粉碎，过60目筛，取20g以1∶98的料水比，在pH值8.0下，加几丁质酶400U/g，温度42℃条件下提取99min后再将温度升高到90℃，提取90min，后续的步骤操作都同实施例1，得到黑木耳多糖2.984g，多糖含量44.16％，黑木耳多糖的溶出量为14.92％。

实施例5

实验操作同实施例1，所不同的是在步骤3.1中，黑木耳粉碎，过60目筛，取20g以1∶98的料水比，在pH值8.0下，加几丁质酶400U/g，温度42℃条件下提取99min后再将温度升高到80℃，提取90min，后续的步骤操作都同实施例1，得到黑木耳多糖2.768g，多糖含量42.17％，黑木耳多糖的溶出量为13.84％。

实施例6

实验操作同实施例1，所不同的是在步骤3.1中，黑木耳粉碎，过60目筛，取20g以1∶98的料水比，在pH值8.0下，加几丁质酶400U/g，温度42℃条件下提取99min后再将温度升高到100℃，提取90min，后续的步骤操作都同实施例1，得到黑木耳多糖3.122g，多糖含量44.82％，黑木耳多糖的溶出量为15.61％。

Claims

1.一种黑木耳多糖的酶法提取方法，包括如下步骤：取干燥黑木耳机械粗粉碎，过40～100目筛，然后按照1∶50～200的料水比混合，在几丁质酶作用下于35～50℃、pH 5.0～9.0及几丁质酶添加量为100～600U/g的条件下提取60～180min；再将提取温度提高到80～95℃提取60～180min，所得提取液离心后得到上清液与沉淀物；取上清液加入乙醇沉淀多糖，离心分离得到沉淀物，沉淀物用水溶解，浓缩除去残留的乙醇，然后在浓缩液中加入硅藻土与活性炭的混合物，所述混合物加入的量为浓缩液质量的2～8wt％，所述混合物中硅藻土与活性炭的质量比为1∶1～4，混合充分搅拌后，过滤，取滤液用30～100kD的聚砜膜进行膜过滤，收集未滤过膜的大分子浓缩液，将大分子浓缩液进行干燥得到黑木耳多糖；所述的料水比为质量体积比，料以质量计，水以体积计，单位为g/ml。

2.如权利要求1所述的黑木耳多糖的酶法提取方法，其特征在于所述的料水比为1∶98。

3.如权利要求1所述的黑木耳多糖的酶法提取方法，其特征在于：在几丁质酶作用下于42℃进行提取。

4.如权利要求3所述的黑木耳多糖的酶法提取方法，其特征在于：在几丁质酶作用下于42℃进行提取99min。

5.如权利要求1所述的黑木耳多糖的酶法提取方法，其特征在于：将提取温度提高到85℃提取120min。

6.如权利要求1所述的黑木耳多糖的酶法提取方法，其特征在于所述的方法为：取干燥黑木耳机械粗粉碎，过60目筛，然后按照1∶98的料水比混合，在几丁质酶作用下于温度42℃、pH为8.0及几丁质酶添加量为400U/g的条件下提取99min，再将提取温度提高到85℃，提取120min，提取液离心后得到上清液与沉淀物，取上清液加入乙醇沉淀多糖，离心分离得到沉淀物，沉淀物用水溶解，浓缩除去残留的乙醇，然后在浓缩液中加入硅藻土与活性炭按质量比1∶3混合的混合物，所述混合物加入的量为浓缩液的2～8wt％，充分搅拌后，过滤，取滤液用50kD的聚砜膜进行膜过滤，收集未滤过膜的大分子浓缩液，将大分子浓缩液进行干燥得到黑木耳多糖。

7.如权利要求1～6之一所述的黑木耳多糖的酶法提取方法，其特征在于所述硅藻土与活性炭的混合物的加入量为所述浓缩液的5wt％。

8.如权利要求1～6之一所述的黑木耳多糖的酶法提取方法，其特征在于所述过滤为：使用板框过滤机，用6～8层滤布压滤。

9.如权利要求1～6之一所述的黑木耳多糖的酶法提取方法，其特征在于所述的大分子浓缩液采用微波真空干燥，所述微波频率2450MHz，微波功率1kW，真空度为35-45mmHg，干燥5～30分钟。

10.如权利要求1～6之一所述的黑木耳多糖的酶法提取方法，其特征在于所述的用聚砜膜进行膜过滤采用切向流过滤技术。