CN106834407A - 一种生物法绿色生产黄姜皂素的方法 - Google Patents

一种生物法绿色生产黄姜皂素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物法绿色生产黄姜皂素的方法，首先通过分别培养系列微生物菌株，混合制成微生物菌群A和B，采用菌群A处理黄姜浆液，得到含大量游离皂苷和淀粉的发酵液；然后采用双酶法水解该发酵液中的淀粉，进一步促进皂苷游离；再通过板框过滤得到滤液和固形渣；滤液经膜分离分别获得黄姜糖化液和皂苷浓缩液；再采用菌群B发酵处理皂苷浓缩液或皂苷浓缩液与固形渣的醇提浸膏的混合液，然后经过滤、溶剂提取等方法精制即可得到黄姜皂素产品。该方法完全不用酸，黄姜皂素收率高(120％～143％)，溶剂用量少，废水量低，污染小，且废渣量少，黄姜资源可利用度高，易于进行产业化放大，在黄姜皂素产业中具有极大的工业推广应用价值。

Description

一种生物法绿色生产黄姜皂素的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种生物法绿色生产黄姜皂素的方法。
背景技术
黄姜(Dioscorea zingiberensis C.H.Wright)学名盾叶薯蓣，又称火头根，多年生缠绕草本植物，为我国特有的野生植物资源，主要分布于湖南、陕西、四川、贵州及云南等省。黄姜的根状茎含薯蓣皂苷等甾体皂苷类成分、40％左右的淀粉、50％的纤维素以及一些水溶性苷类、生物碱类、黄酮苷类、强心苷类、单宁、色素等化学成分。黄姜的主要有效成分是薯蓣皂苷元，也称皂素(以下均称皂素)。黄姜皂素是黄姜皂苷的配基，在黄姜中主要以皂苷的形式存在。以黄姜皂素合成的甾体激素中间体及皮质激素、性激素、蛋白同化激素等产品为主的数百种国计民生特需的药物，被誉为“药用黄金”。甾体激素类药物已迅速发展为仅次于抗生素的第二大类药物。
盾叶薯蓣植物中的淀粉、蛋白质、果胶等成分对甾体皂苷具有一定的包裹作用，而甾体皂苷又通过3位糖苷键与植物纤维相连。因而简单的酸水解方法收率低，很难将植物中的薯蓣皂素提取完全，仅能提取其中的1/4。
黄姜皂素的生产目前仍采用基于Marker和Wall为代表的先萃取后水解及Rothrok提出的先水解后萃取的分离方法(直接酸解工艺)。传统皂素生产工艺废水废渣排放量大，污染严重，废水含酸高、色素浓，治理难度大成本高。黄姜加工企业多位于丹江口库区周边及南水北调中线的源头，污染水的排放严重危及南水北调中线水源区水质安全。然而，若全面禁止黄姜皂素生产行业，势必造成百万姜农的民生利益受损，而且给下游甾体激素行业产生严重影响。我国在Rothrok法的基础上，围绕提高提取率，解决污染等问题，相继出现了淀粉物理分离法、酶解糖液分离法和醇浸膏法等清洁生产工艺，即便如此，依然存在诸多不足。
专利CN1515585A公开了一种环保无污染生产薯蓣皂素的方法，但其中过筛分离40％的纤维素部分会带走一些与纤维素结合的皂苷，从而降低了皂素的得率，且膜过滤在实际工业化过程中存在通量低、易堵塞等问题。专利CN1970785A公开了一种薯蓣皂素清洁生产及综合利用的方法，将黄姜原料粉碎后直接进行溶剂提取，与黄姜木质纤维素结构共价偶联的结合态皂苷无法获得，皂素得率存在提升空间，且未能将黄姜其他组分高值化利用。专利CN1821380A公开了一种处理黄姜的高效复合微生物菌群，其使用的微生物菌群涵盖细菌、霉菌、酵母菌等多种复合微生物，但存在问题是真菌生长时间较长，且细菌与真菌在生长过程中存在拮抗作用，大多数微生物在对黄姜木质纤维素处理过程中，存在分阶段生长的情况，与自然发酵过程一样存在不可控性，且微生物对皂苷元母核可能会有降解与转化作用，从而降低皂素得率。专利CN 103060416A公开了一种利用微生物技术清洁生产黄姜皂素的方法，其使用单一微生物结合蒸汽爆破处理黄姜干粉或鲜料的方法获得了较好的收率，且大幅度降低了酸、水及有机溶剂的用量，但依然存在需要改进的地方：单一微生物处理黄姜的能力有限，因而必须结合蒸汽爆破等物理化学手段对黄姜进行预处理，而蒸汽爆破处理过程噪音大能耗高，不利于工业化放大，同时在生产皂素的过程中依然使用了酸，不能做到全过程的清洁生产。
最大限度提高黄姜皂素收率，同时摒弃传统酸水解法，大幅减少有机溶剂用量，从而大幅降低黄姜皂素生产成本和污染程度成为核心问题，迫切需要通过科技创新，研发新的绿色生产工艺并进行工业化放大应用。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种生物法绿色生产黄姜皂素的方法，其目的在于通过采用系列微生物菌群，包括能够分泌木质纤维素降解酶系、糖基转移酶活力很高且能分泌表面活性物质的高效微生物菌群A以及能够分泌高活性糖苷酶的微生物菌群B分别进行黄姜发酵、皂苷富集以及转化皂苷为皂素，由此解决黄姜皂素生产过程中黄姜皂苷转化率低、黄姜皂素收率低、能耗高、环境污染严重、淀粉利用不充分等突出问题，大幅降低了皂素生产成本，从而提高了皂素市场竞争力。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种黄姜皂素的制备方法，包括如下步骤：
(1)黄姜发酵：按照黄姜干重与水的质量比为1:5～1:15配制成均匀浆液，在浆液中接种10％～40％微生物菌群A，进行发酵培养，得到相应的发酵液；
(2)淀粉糖化：向步骤(1)得到的发酵液中加入淀粉酶酶解，再加入糖化酶糖化，经板框过滤压榨得到液相和固相，所述液相为黄姜含皂苷糖化液，所述固相为黄姜固形渣；
(3)皂苷富集：将步骤(2)所得的黄姜含皂苷糖化液经膜过滤后获得截留液和过滤液，所述截留液为皂苷浓缩液，所述过滤液为黄姜淀粉糖化液；将步骤(2)所得的黄姜固形渣使用乙醇水溶液进行萃取，溶剂回收后获得皂苷醇提浸膏；
(4)制备皂苷混合液：将步骤(3)获得的皂苷浓缩液和皂苷醇提浸膏混合加水混匀后制成皂苷混合液；
(5)微生物转化皂苷：向步骤(4)得到的皂苷混合液中接种10％～30％微生物菌群B，进行发酵培养，得到相应的发酵液；
(6)皂素产品的制备：将步骤(5)所得到的发酵液进行板框过滤压榨，得到固相和液相，所述固相为皂素酶解物，所述皂素酶解物经溶剂提取精制后获得皂素产品。
优选地，所述微生物菌群A包括Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena；
优选地，所述微生物菌群A的制备方法包括如下步骤：
(1)分别取菌株Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonasflavigena的单菌落接种于LB培养基中，在30℃～40℃，100～220r/min条件下培养8～16h，分别获得Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的一级种子；
(2)分别将步骤(1)获得的Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的一级种子按接种量1％～5％(体积百分数)接入LB培养基中，在30℃～40℃，100～300r/min，通气量0.1～1vvm条件下培养2～8h，分别获得Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的二级种子液；
(3)分别将步骤(2)获得的Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的二级种子液接入廉价细菌培养基中，在通气量0.1～1vvm，搅拌转速100～300r/min，温度30～40℃下，培养2～8h，分别获得Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的三级种子；
(4)将步骤(3)获得的Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的三级种子按照等体积比例混合制成微生物菌群A。
优选地，所述廉价细菌培养基配方如下：黄豆饼粉5～15g/L，蛋白胨2～5g/L，酵母粉1～2.5g/L，氯化钠5～12g/L，消泡剂0.05％～0.1％(v/v)。
优选地，所述步骤(1)中的均匀浆液中还包括如下成分：大豆油体积百分比0.01％～0.05％，硫酸亚铁0.006～0.01mmol/L，硫酸镁0.005～0.015mmol/L，硝酸钾5～15mmol/L，氯化钙4～10μmol/L，硫酸镁2～3mmol/L。
优选地，所述步骤(1)中的表面活性物质包括表面活性素或地衣素。
优选地，所述步骤(4)中制备皂苷混合液时皂苷浓缩液和皂苷醇提浸膏的总体积与水的体积比为1:4～7。
优选地，所述微生物菌群B包括Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger。
优选地，所述微生物菌群B的制备方法包括如下步骤：
(1)取斜面保藏菌株Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger的孢子液分别接种于YPD培养基中，分别在25～35℃，100～220r/min条件下培养10～18h，分别获得Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger的一级种子；
(2)将步骤(1)获得的Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger的一级种子分别按接种量1％～5％(体积百分数)接入YPD培养基中，在25℃～35℃，100～300r/min，通气量0.2～1vvm条件下培养16～32h，分别获得Aspergillus tubingensis和Aspergillusniger的二级种子；
(3)将步骤(2)获得的Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger的二级种子液分别接入真菌培养基中，分别在通气量0.2～1vvm，搅拌转速100～300r/min，25～35℃，培养12～24h，分别获得Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger的三级种子；
(4)将步骤(3)获得的Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger的三级种子按照等体积比例混合制成微生物菌群B。
优选地，所述的真菌培养基配方如下：蛋白胨5～10g/L，酵母粉2～5g/L，葡萄糖5～10g/L。
优选地，所述步骤(1)的发酵条件为在30～40℃转速为100～300r/min通气量为0.1～1vvm条件下培养4～24h。
优选地，所述步骤(5)的发酵条件为在28～39℃转速为100～300r/min通气量为0.2～1vvm条件下培养24～168h。
总体而言，通过本发明的上述技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
1、采用能够分泌木质纤维素降解酶系、糖基转移酶以及表面活性物质的微生物菌群A预处理黄姜原料，使木质纤维素结构松散，有效断开糖苷键，使得束缚的皂苷释放，使存在于黄姜组织细胞中被木质纤维素、果胶、淀粉等包裹的皂苷充分游离；再通过转糖基作用及表面活性物质使得游离皂苷在水中的溶解性增加，使得固形物中皂苷含量减少，大幅降低有机溶剂用量。
2、采用能够分泌系列高活性糖苷酶的微生物菌群B转化总皂苷生产皂素，所得的皂素产品得率高，纯度好。本发明的方法与直接酸解法相比，完全不用酸，且皂素得率能够提高43％。
3、本发明的一种生物法绿色生产黄姜皂素的方法，整个工艺绿色环保，无污染，成本低，产业化前景广阔。
附图说明
图1是本发明一种生物法绿色生产黄姜皂素的方法的工艺流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
一种生物法绿色生产黄姜皂素的方法,包括如下步骤：
(1)黄姜材料的预处理
取新鲜黄姜适量，洗去泥土去须，按照黄姜干重：水＝1：5～15(w/w)粉碎匀浆配制成黄姜浆液，然后加入少量营养成分，使得黄姜浆液中含有：大豆油0.01％～0.05％(v/v)，硫酸亚铁0.006～0.01mmol/L，硫酸镁0.005～0.015mmol/L，硝酸钾5～15mmol/L，氯化钙4～10μmol/L，硫酸镁2～3mmol/L。
(2)微生物菌群制备
微生物菌群A的制备方法包括如下步骤：
(1)取菌株Bacillus sp.的单菌落接种于100mL LB培养基的250mL摇瓶中，在30℃～40℃，100～220r/min条件下培养8～16h，获得Bacillus sp.的一级种子；
(2)将Bacillus sp.的一级种子接入装有50L LB培养基的种子罐中，接种量1％(v/v)，罐温30℃～40℃，100～300r/min，通气量0.1～1vvm条件下培养2～8h，获得Bacillus sp.的二级种子；
(3)将Bacillus sp.的二级种子接入装有1500L廉价细菌培养基的发酵罐中，通气量0.1～1vvm，搅拌转速100～300r/min，罐温30～40℃，培养2～8h，获得Bacillus sp.的三级种子；
采用如上同样的方法分别获得Pectobacterium carotovorum和Cellulomonasflavigena的三级种子。
(4)将Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的三级种子按照等体积比例混合制成微生物菌群A。
所述廉价细菌培养基配方如下：黄豆饼粉5～15g/L，蛋白胨2～5g/L，酵母粉1～2.5g/L，氯化钠5～12g/L，消泡剂0.05％～0.1％(v/v)；
微生物菌群B的制备方法包括如下步骤：
(1)取斜面保藏菌株Aspergillus tubingensis的孢子液接种于100mL YPD培养基的250mL摇瓶中，在25℃～35℃，100～220r/min条件下培养10～18h，获得Aspergillustubingensis的一级种子；
(2)将Aspergillus tubingensis的一级种子接入装有50L YPD培养基的种子罐中，接种量1％(v/v)，罐温25℃～35℃，100～300r/min，通气量0.2～1vvm条件下培养16～32h，获得Aspergillus tubingensis的二级种子；
(3)将Aspergillus tubingensis的二级种子接入装有1000L真菌培养基的发酵罐中，通气量0.2～1vvm，搅拌转速100～300r/min，罐温25～35℃，培养12～24h，获得Aspergillus tubingensis的三级种子。
采用如上相同的方法获得Aspergillus niger的三级种子。
(4)将Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger的三级种子按照等体积比例混合制成微生物菌群B。
所述真菌培养基配方如下：蛋白胨5～10g/L，酵母粉2～5g/L，葡萄糖5～10g/L。
(3)微生物发酵促进皂苷游离
在步骤(1)所得到的黄姜浆液中接种10～40％(v/v)的微生物菌群A，在30～40℃转速为100～300r/min通气量为0.1～1vvm条件下发酵培养4～24h，得到相应的发酵液。
(4)淀粉糖化
向步骤(3)所得到的发酵液中按黄姜干重每千克加入5万单位(U)α-淀粉酶，在pH6.2、95℃条件下液化20min，冷却至60℃以下；再按黄姜干重每千克加入5万单位(U)糖化酶，在pH 4.2、温度60℃条件下糖化6h，板框过滤压榨得到液相和固相，液相为黄姜含皂苷糖化液，固相为黄姜固形渣。
(5)皂苷富集
将步骤(4)所得的黄姜含皂苷糖化液先通过微滤得到清液，所述清液再通过孔径为1.5nm的纳滤装置，获得截留液和过滤液，截留液为皂苷浓缩液，过滤液为黄姜淀粉糖化液；使用40～90％(v/v)的乙醇水溶液对步骤(4)所得的黄姜固形渣进行萃取，溶剂回收回用后获得皂苷醇提浸膏。
(6)制备皂苷混合液
将步骤(5)获得的皂苷浓缩液和皂苷醇提浸膏混合物加水制成皂苷混合液，其中混合物的体积与所加水体积的比例为1:4～7。
(7)微生物转化皂苷
向步骤(6)所得到的皂苷混合液或黄姜固形渣重悬液中接种10％～30％(v/v)的微生物菌群B，在28～39℃转速为100～300r/min通气量为0.2～1 vvm条件下发酵培养24～168h，将皂苷转化为皂素，并获得相应的发酵液。
(8)皂素产品的制备
将步骤(7)所得到的发酵液板框过滤压榨后得到皂素酶解物，干燥后再以120#汽油索氏提取4h，回收有机溶剂循环利用，提取物结晶干燥后得到白色黄姜皂素产品。
步骤(1)中加入大豆油、硫酸亚铁、硫酸镁等营养成分的目的是为了促进微生物菌群A在发酵黄姜浆液时除了能够分泌木质纤维素降解酶系、糖基转移酶，还可以促进分泌表面活性素或地衣素等表面活性物质。
步骤(3)中微生物菌群A的接种量优选范围为15％～25％，微生物菌群A逐渐增加有助于提高其单位时间的工作能力，菌群A分泌的酶在一定反应时间内使得皂苷游离溶解于水相，但微生物菌群A的加入量过大时会导致游离的皂苷上面的糖基进一步降解从而使得皂苷溶解性下降而沉淀，影响了皂苷的溶解性。
步骤(7)中微生物菌群B的加入量优选为10％～18％，菌群B的加入量在较低水平内逐渐增加能极大的提高菌群B对皂苷的转化效率，但进一步提高其加入量则对皂苷的转化效率没有什么影响，相反还会因为加入过多微生物菌丝体阻碍转化结束后皂素的提取效率。
单一菌株的纤维素酶的酶活很低，由于半纤维素、木质素的包裹，导致微生物未能接触到纤维素结构，从而几乎不分泌纤维素酶；单一菌株分泌的木聚糖酶、甘露聚糖酶和果胶酶酶活水平很低，影响整体降解效率，发酵促进黄姜皂苷游离的效果很有限。而本发明的微生物菌群A为能够分泌木质纤维素降解酶系、糖基转移酶以及表面活性物质的混合微生物菌群，能够分工合作，既避免了不同种微生物对有限底物的竞争作用，也提高了不同底物的降解效率，同时分泌高酶活性的各种酶，各种酶之间的协同作用更明显，快速释放被包裹及共价结合的黄姜皂苷。本发明的微生物菌群B为能够分泌高活性糖苷酶的混合微生物菌群，其菌株的丰富的糖苷酶酶系相互协同配合，保证了菌株对皂苷的高效转化。
本发明通过分阶段投入不同微生物单菌株或菌群处理黄姜材料，使木质纤维素结构松散，有效断开糖苷键，使得结合态黄姜皂苷释放，再通过转糖基作用将游离的还原糖重新连接到皂苷上使其在水中的溶解性增加，同时由菌株分泌的适量表面活性物质使得游离的水不溶皂苷溶解于水相；固形物中的皂苷游离程度高，含量低，有机溶剂用量少，提取效率高；获得的皂苷采用糖苷酶活性强的微生物菌株将其全部转化为皂素，完全替代酸解。本发明黄姜皂素收率高，整个生产过程完全不用酸，溶剂用量少，废水量低，污染小，废渣量少，黄姜资源可利用度高。
本发明所述微生物菌群A包括Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena；所述微生物菌群B包括Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger。
所述Pectobacterium carotovorum没有特定的菌株限定。
所述Bacillus sp.其于2016年12月30日保藏于中国武汉，中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO: M 2016791。
所述Cellulomonas flavigena没有特定的菌株限定。
所述Aspergillus tubingensis，其于2016年7月11日保藏于中国武汉，中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO: M 2016389。
所述Aspergillus niger没有特定的菌株限定。
图1是本发明一种生物法绿色生产黄姜皂素的方法的工艺流程图。
以下为实施例：
实施例1
一种生物法绿色生产黄姜皂素的方法,包括如下步骤：
(1)黄姜材料的预处理
取新鲜黄姜若干(干重2950kg)，洗去泥土去须，按照黄姜干重：水＝1：5(w/w)粉碎匀浆配制成黄姜浆液，加入少量营养成分，使得浆液中相应组分的终浓度如下：大豆油0.01％(v/v)，硫酸亚铁0.006mmol/L，硫酸镁0.005mmol/L，硝酸钾5mmol/L，氯化钙4μmol/L，硫酸镁2mmol/L。
(2)微生物菌群制备
微生物菌群A的制备方法为：
取菌株Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的单菌落分别接种于装有100mL LB培养基的250mL摇瓶，每个菌株各5瓶，在30℃，100r/min条件下培养16h，获得一级种子。
将一级种子分别接入装有50L LB培养基的种子罐中，罐温30℃，100r/min，通气量0.1vvm条件下培养8h，获得二级种子。
将二级种子分别接入装有1500L廉价细菌培养基的3m3发酵罐中，罐温30℃，100r/min，通气量0.1vvm条件下培养8h，获得三级种子。
将上述获得的Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonasflavigena的三级种子按照等体积比例混合菌液制成微生物菌群A。
所述廉价细菌培养基配方如下：黄豆饼粉15g/L，蛋白胨2g/L，酵母粉1g/L，氯化钠5g/L，消泡剂0.1％(v/v)。
微生物菌群B的制备方法为：
取斜面保藏菌株Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger孢子液分别接种于装有100mL LB培养基的250mL摇瓶，每个菌株各5瓶，在25℃，100r/min条件下培养18h，获得一级种子。
将一级种子分别接入装有50L YPD培养基的种子罐中，罐温25℃，100r/min，通气量0.2vvm条件下培养32h，获得二级种子。
将二级种子分别接入装有1000L真菌培养基的2m3发酵罐中，罐温25℃，100r/min，通气量0.2vvm条件下培养24h，获得三级种子。
将上述获得的Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger的三级种子按照等体积比例混合菌液制成微生物菌群B。
所述真菌培养基配方如下：蛋白胨5g/L，酵母粉2g/L，葡萄糖10g/L。
(3)微生物发酵促进皂苷游离
在步骤(1)所得到的黄姜浆液中微生物菌群A，在30℃转速为100r/min通气为0.1vvm条件下发酵培养24h，得到相应的发酵液。
(4)淀粉糖化
向步骤(3)所得到的发酵液中按黄姜干重每千克加入5万单位(U)α-淀粉酶，在pH6.2、95℃条件下液化20min，冷却至60℃以下；再按黄姜干重每千克加入5万单位(U)糖化酶，在pH 4.2、温度60℃条件下糖化6h，板框过滤压榨得到液相和固相，液相为黄姜含皂苷糖化液，固相为黄姜固形渣。
(5)皂苷富集
将步骤(4)所得的黄姜含皂苷糖化液先通过微滤得到清液，所述清液再通过孔径为1.5nm的纳滤装置，获得截留液和过滤液，截留液为皂苷浓缩液，过滤液为黄姜淀粉糖化液；使用40％(v/v)的乙醇水溶液对步骤(4)所得的黄姜固形渣进行萃取，溶剂回收回用后获得皂苷醇提浸膏。
(6)制备皂苷混合液
将步骤(5)获得的皂苷浓缩液和皂苷醇提浸膏混合加水制成皂苷混合液，总体积为11m3，其中皂苷浓缩液和皂苷醇提浸膏混合物与所加水的体积比例为1:4。
(7)微生物转化皂苷
向步骤(6)所得到的皂苷混合液中接入微生物菌群B，在28℃转速为100r/min通气为0.2vvm条件下发酵培养168h，将皂苷转化为皂素，并获得相应的发酵液。
(8)皂素产品的制备
将步骤(7)所得到的发酵液板框过滤压榨除去上清后得到皂素酶解物，干燥后再以120#汽油索氏提取4h，回收有机溶剂循环利用，提取物结晶干燥后得到白色黄姜皂素产品。
与直接酸解法相比，本发明的方法完全不用酸，且获得的皂素得率提高了20％。
实施例2
一种生物法绿色生产黄姜皂素的方法,包括如下步骤：
(1)黄姜材料的预处理
取新鲜黄姜若干(干重1750kg)，洗去泥土去须，按照黄姜干重：水＝1:15(w/w)粉碎匀浆配制成黄姜浆液，加入少量营养成分，使得浆液中相应组分的终浓度如下：大豆油0.05％(v/v)，硫酸亚铁0.01mmol/L，硫酸镁0.015mmol/L，硝酸钾15mmol/L，氯化钙10μmol/L，硫酸镁3mmol/L。
(2)微生物菌群制备
微生物菌群A的制备方法为：
取菌株Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的单菌落分别接种于装有100mL LB培养基的250mL摇瓶，每个菌株各5瓶，在40℃，220r/min条件下培养8h，获得一级种子。
将一级种子分别接入装有50L LB培养基的种子罐中，罐温40℃，300r/min，通气量1vvm条件下培养2h，获得二级种子。
将二级种子分别接入装有1500L廉价细菌培养基的3m3发酵罐中，罐温40℃，300r/min，通气量1vvm条件下培养2h，获得三级种子，
将上述获得的Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonasflavigena的三级种子按照等体积比例混合菌液制成微生物菌群A。
所述廉价细菌培养基配方如下：黄豆饼粉5g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，氯化钠12g/L消泡剂0.05％(v/v)。
微生物菌群B的制备方法为：
取斜面保藏菌株Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger孢子液分别接种于装有100mL LB培养基的250mL摇瓶，每个菌株各5瓶，在35℃，220r/min条件下培养10h，获得一级种子。
将一级种子分别接入装有50L YPD培养基的种子罐中，罐温35℃，300r/min，通气量1vvm条件下培养16h，获得二级种子。
将二级种子分别接入装有1000L真菌培养基的2m3发酵罐中，罐温35℃，300r/min，通气量1vvm条件下培养12h，获得三级种子。
将上述获得的Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger的三级种子按照等体积比例混合菌液制成微生物菌群B。
所述真菌培养基配方如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖5g/L。
(3)微生物发酵促进皂苷游离
在步骤(1)所得到的黄姜浆液中接入微生物菌群A，在40℃转速为300r/min通气为1vvm条件下发酵培养4h，得到相应的发酵液。
(4)淀粉糖化
向步骤(3)所得到的发酵液中按黄姜干重每千克加入5万单位(U)α-淀粉酶，在pH6.2、95℃条件下液化20min，冷却至60℃以下；再按黄姜干重每千克加入5万单位(U)糖化酶，在pH 4.2、温度60℃条件下糖化6h，板框过滤压榨得到液相和固相，液相为黄姜含皂苷糖化液，固相为黄姜固形渣。
(5)皂苷富集
将步骤(4)所得的黄姜含皂苷糖化液先通过微滤得到清液，所述清液再通过孔径为1.5nm的纳滤装置，获得截留液和过滤液，截留液为皂苷浓缩液，过滤液为黄姜淀粉糖化液；使用90％(v/v)的乙醇水溶液对步骤(4)所得的黄姜固形渣进行萃取，溶剂回收回用后获得皂苷醇提浸膏。
(6)制备皂苷混合液
将步骤(5)获得的皂苷浓缩液和皂苷醇提浸膏混合加水制成皂苷混合液，总体积为7m3，其中皂苷浓缩液和皂苷醇提浸膏混合物与所加水的体积比例为1:7。
(7)微生物转化皂苷
向步骤(6)所得到的皂苷混合液中接入微生物菌群B，在39℃转速为300r/min通气为1vvm条件下发酵培养24h，将皂苷转化为皂素，并获得相应的发酵液。
(8)皂素产品的制备
将步骤(7)所得到的发酵液板框过滤压榨除去上清后得到皂素酶解物，干燥后再以120#汽油索氏提取4h，回收有机溶剂循环利用，提取物结晶干燥后得到白色黄姜皂素产品。
与直接酸解法相比，本发明的方法完全不用酸，且获得的皂素得率提高了24％。
实施例3
一种生物法绿色生产黄姜皂素的方法,包括如下步骤：
(1)黄姜材料的预处理
取新鲜黄姜若干(干重2250kg)，洗去泥土去须，按照黄姜干重：水＝1:10(w/w)粉碎匀浆配制成黄姜浆液，加入少量营养成分，使得浆液中相应组分的终浓度如下：大豆油0.03％(v/v)，硫酸亚铁0.008mmol/L，硫酸镁0.01mmol/L，硝酸钾10mmol/L，氯化钙6μmol/L，硫酸镁2.3mmol/L。
(2)微生物菌群制备
微生物菌群A的制备方法为：
取菌株Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的单菌落分别接种于装有100mL LB培养基的250mL摇瓶，每个菌株各5瓶，在37℃，200r/min条件下培养12h，获得一级种子。
将一级种子分别接入装有50L LB培养基的种子罐中，罐温37℃，250r/min，通气量0.3vvm条件下培养6h，获得二级种子。
将二级种子分别接入装有1500L廉价细菌培养基的3m3发酵罐中，罐温37℃，250r/min，通气量0.3vvm条件下培养6h，获得三级种子。
将上述获得的Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonasflavigena的三级种子按照等体积比例混合菌液制成微生物菌群A。
所述廉价细菌培养基配方如下：黄豆饼粉10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2.5g/L，氯化钠10g/L，消泡剂0.08％(v/v)。
微生物菌群B的制备方法为：
取斜面保藏菌株Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger孢子液分别接种于装有100mL LB培养基的250mL摇瓶，每个菌株各5瓶，在28℃，200r/min条件下培养12h，获得一级种子。
将一级种子分别接入装有50L YPD培养基的种子罐中，罐温28℃，280r/min，通气量0.5vvm条件下培养24h，获得二级种子。
将二级种子分别接入装有1000L真菌培养基的2m3发酵罐中，罐温28℃，280r/min，通气量0.5vvm条件下培养16h，获得三级种子。
将Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger的三级种子按照等体积比例混合菌液制成微生物菌群B。
所述真菌培养基配方如下：蛋白胨6g/L，酵母粉3g/L，葡萄糖6g/L。
(3)微生物发酵促进皂苷游离
在步骤(1)所得到的黄姜浆液中接种微生物菌群A，在37℃转速为300r/min通气为0.5vvm条件下发酵培养8h，得到相应的发酵液。
(4)淀粉糖化
向步骤(3)所得到的发酵液中按黄姜干重每千克加入5万单位(U)α-淀粉酶，在pH6.2、95℃条件下液化20min，冷却至60℃以下；再按黄姜干重每千克加入5万单位(U)糖化酶，在pH 4.2、温度60℃条件下糖化6h，板框过滤压榨得到液相和固相，液相为黄姜含皂苷糖化液，固相为黄姜固形渣。
(5)皂苷富集
将步骤(4)所得的黄姜含皂苷糖化液先通过微滤得到清液，所述清液再通过孔径为1.5nm的纳滤装置，获得截留液和过滤液，截留液为皂苷浓缩液，过滤液为黄姜淀粉糖化液；使用70％(v/v)的乙醇水溶液对步骤(4)所得的黄姜固形渣进行萃取，溶剂回收回用后获得皂苷醇提浸膏。
(6)制备皂苷混合液
将步骤(5)获得的皂苷浓缩液和皂苷醇提浸膏混合加水制成皂苷混合液，总体积为17m3，其中皂苷浓缩液和皂苷醇提浸膏混合物与所加水的体积比例为1:5。
(7)微生物转化皂苷
向步骤(6)所得到的皂苷混合液中接入微生物菌群B，在30℃转速为300r/min通气为0.5vvm条件下发酵培养72h，将皂苷转化为皂素，并获得相应的发酵液。
(8)皂素产品的制备
将步骤(7)所得到的发酵液板框过滤压榨除去上清后得到皂素酶解物，干燥后再以120#汽油索氏提取4h，回收有机溶剂循环利用，提取物结晶干燥后得到白色黄姜皂素产品。
与直接酸解法相比，本发明的方法完全不用酸，且获得的皂素得率提高了43％。
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种生物法绿色生产黄姜皂素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)黄姜发酵：按照黄姜干重与水的质量比为1:5～1:15配制成均匀浆液，在浆液中接种体积比为10％～40％能够分泌木质纤维素降解酶系、糖基转移酶以及表面活性物质的微生物菌群A，进行发酵培养，得到相应的发酵液；
(2)淀粉糖化：向步骤(1)得到的发酵液中加入淀粉酶酶解，再加入糖化酶糖化，经板框过滤压榨得到液相和固相，所述液相为黄姜含皂苷糖化液，所述固相为黄姜固形渣；
(3)皂苷富集：将步骤(2)所得的黄姜含皂苷糖化液经膜过滤后获得截留液和过滤液，所述截留液为皂苷浓缩液，所述过滤液为黄姜淀粉糖化液；将步骤(2)所得的黄姜固形渣使用乙醇水溶液进行萃取，溶剂回收后获得皂苷醇提浸膏；
(4)制备皂苷混合液：将步骤(3)获得的皂苷浓缩液和皂苷醇提浸膏混合加水混匀后制成皂苷混合液；
(5)微生物转化皂苷：向步骤(4)得到的皂苷混合液中接种10％～30％能够分泌系列高活性糖苷酶的微生物菌群B，进行发酵培养，得到相应的发酵液；
(6)皂素产品的制备：将步骤(5)所得到的发酵液进行板框过滤压榨，得到固相和液相，所述固相为皂素酶解物，所述皂素酶解物经溶剂提取精制后获得皂素产品。
2.如权利要求1所述的生物法绿色生产黄姜皂素的方法，其特征在于，所述微生物菌群A包括Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena。
3.如权利要求1所述的生物法绿色生产黄姜皂素的方法，其特征在于，所述微生物菌群A的制备方法包括如下步骤：
(1)分别取菌株Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonasflavigena的单菌落接种于LB培养基中，在30℃～40℃，100～220r/min条件下培养8～16h，分别获得Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的一级种子；
(2)分别将步骤(1)获得的Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的一级种子按接种量体积百分数1％～5％接入LB培养基中，在30℃～40℃，100～300r/min，通气量0.1～1vvm条件下培养2～8h，分别获得Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的二级种子液；
(3)分别将步骤(2)获得的Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的二级种子液接入廉价细菌培养基中，在通气量0.1～1vvm，搅拌转速100～300r/min，温度30～40℃下，培养2～8h，分别获得Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonas flavigena的三级种子，所述廉价细菌培养基优选配方如下：黄豆饼粉5～15g/L，蛋白胨2～5g/L，酵母粉1～2.5g/L，氯化钠5～12g/L，消泡剂体积百分数0.05％～0.1％；
(4)将步骤(3)获得的Bacillus sp.、Pectobacterium carotovorum和Cellulomonasflavigena的三级种子按照等体积比例混合制成微生物菌群A。
4.如权利要求1所述的生物法绿色生产黄姜皂素的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的均匀浆液中还包括如下成分：大豆油体积百分比0.01％～0.05％，硫酸亚铁0.006～0.01mmol/L，硫酸镁0.005～0.015mmol/L，硝酸钾5～15mmol/L，氯化钙4～10μmol/L，硫酸镁2～3mmol/L。
5.如权利要求1所述的生物法绿色生产黄姜皂素的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的表面活性物质包括表面活性素或地衣素。
6.如权利要求1所述的生物法绿色生产黄姜皂素的方法，其特征在于，所述步骤(4)中制备皂苷混合液时皂苷浓缩液和皂苷醇提浸膏的总体积与水的体积比为1:4～7。
7.如权利要求1所述的生物法绿色生产黄姜皂素的方法，其特征在于，所述微生物菌群B包括Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger。
8.如权利要求1所述的生物法绿色生产黄姜皂素的方法，其特征在于，所述微生物菌群B的制备方法包括如下步骤：
(1)分别取斜面保藏菌株Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger的孢子液接种于YPD培养基中，在25～35℃，100～220r/min条件下培养10～18h，分别获得Aspergillustubingensis和Aspergillus niger的一级种子；
(2)分别将步骤(1)获得的Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger的一级种子按接种量体积百分数1％～5％接入YPD培养基中，在25℃～35℃，100～300r/min，通气量0.2～1vvm条件下培养16～32h，分别获得Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger的二级种子；
(3)分别将步骤(2)获得的Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger的二级种子液接入真菌培养基中，在通气量0.2～1vvm，搅拌转速100～300r/min，25～35℃，培养12～24h，分别获得Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger的三级种子，所述的真菌培养基优选配方如下：蛋白胨5～10g/L，酵母粉2～5g/L，葡萄糖5～10g/L；
(4)将步骤(3)获得的Aspergillus tubingensis和Aspergillus niger的三级种子按照等体积比例混合制成微生物菌群B。
9.如权利要求1所述的生物法绿色生产黄姜皂素的方法，其特征在于：步骤(1)所述的发酵条件为在30～40℃转速为100～300r/min通气量为0.1～1vvm条件下培养4～24h。
10.如权利要求1所述的生物法绿色生产黄姜皂素的方法，其特征在于：步骤(5)所述的发酵条件为在28～39℃转速为100～300r/min通气量为0.2～1vvm条件下培养24～168h。
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