CN115896179A

CN115896179A - 一种极端从毛红曲霉菌利用酿酒废水生产高附加值产物的方法

Info

Publication number: CN115896179A
Application number: CN202211575367.7A
Authority: CN
Inventors: 郑羽西; 罗寒; 宋桐伊; 张超龙
Original assignee: Moutai University
Current assignee: Moutai University
Priority date: 2022-12-08
Filing date: 2022-12-08
Publication date: 2023-04-04

Abstract

本发明提供了一种极端从毛红曲霉菌利用酿酒废水生产高附加值产物的方法，属于微生物培养技术领域。本发明将极端从毛红曲霉菌接种到酿酒废水中进行发酵培养，获得菌丝体，提取菌丝体中高附加值产物；所述酿酒废水中还添加了葡萄糖、木糖、葡聚糖、木聚糖、淀粉、硫酸铵、尿素、酵母浸膏、维生素B和维生素C中的任意一种或几种；所述高附加值产物包括脂类、蛋白质、甲壳素和壳聚糖。本发明利用酿酒废水对能够在极端环境中生长的微生物进行发酵培养，以提取高附加值产物，为处理酿酒废水提供了新方向，能够提高酿酒废水的利用率，实现酿酒废水的绿色深度处理以及资源化利用。

Description

一种极端从毛红曲霉菌利用酿酒废水生产高附加值产物的方法

技术领域

本发明属于微生物培养技术领域，尤其涉及一种极端从毛红曲霉菌利用酿酒废水生产高附加值产物的方法。

背景技术

目前，白酒的酿造主要以高粱、玉米、小麦作为原材料制成的，在清洗和蒸馏环节会产生大量酿酒废水。目前，白酒产业采用物理法、化学法和生化法相结合的方法来处理酿酒废水，主要采用过滤、重力沉降、气浮、离心、酸碱中和、厌氧降解、好氧降解、厌氧-好氧降解等工艺。酿酒废水处理存在着处理技术低、经济成本高、有机物的利用率低、产生大量污泥难以处置的问题。并且由于酿酒废水中淀粉、蛋白质、氨基酸和糖类有机物含量高，直接排入污水处理厂不仅处理困难易造成环境污染，还会导致资源浪费。

极端微生物指的是能够生长在极端环境中的微生物，由于具有独特的基因类型、特殊的生理机制及特殊的代谢产物，极端微生物在工业、农业、环保等领域拥有巨大的应用潜力。因此，利用酿酒废水对能够在极端环境中生长的微生物进行发酵培养，以提取高附加值产物，为处理酿酒废水提供了新方向，能够提高酿酒废水的利用率，实现酿酒废水的绿色深度处理以及资源化利用。

目前，从酱香白酒酿造环境中获得一株生长良好的极端从毛红曲霉菌，其代谢产物主要为短链脂肪酸、副产物醇类。该菌种能够耐受超高浓度的酿酒废水，主要研究了其将废水中复杂的碳水化合物转化为短链脂肪酸的能力。该菌种发酵机理并不明确，研究中发现改变环境胁迫因子的强度、改变发酵条件、改善短链脂肪酸代谢的氧化还原失衡，能够影响菌种的代谢性生长和代偿性生长，进而影响菌种代谢产物产量。

目前，并没有利用极端从毛红曲霉菌菌丝体生产高附加值产物的相关报道。真菌高附加值产物包括甲壳素，甲壳素是多数真菌细胞壁的主要成分，而不同种类真菌产甲壳素能力不同。探究极端从毛红曲霉菌利用酿酒废水生产甲壳素的能力有利于实现酿酒废水资源化利用。而目前关于利用真菌生产甲壳素的研究主要集中在菌种的筛选和甲壳素提取工艺，并没有极端微生物利用酿酒废水发酵生产甲壳素的报道。微生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌种本身的性能，而且要赋以合适的环境条件，酿酒废水成分复杂，环境极端，存在高浓度的无机盐、有机酸和乙醇等发酵抑制物，改变使用酿酒废水发酵时的条件能够极大的影响发酵结果。因此，研究如何促进极端从毛红曲霉菌在酿酒废水中进行代偿性生长，提高高附加产物含量具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种极端从毛红曲霉菌利用酿酒废水生产高附加值产物的方法，所述极端从毛红曲霉菌利用酿酒废水发酵培养，菌丝体能够提取获得高含量的高附加值产物，提高了酿酒废水的利用率。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种极端从毛红曲霉菌利用酿酒废水生产高附加值产物的方法，包括如下步骤：

将极端从毛红曲霉菌接种到酿酒废水中进行发酵培养，获得菌丝体，提取菌丝体中高附加值产物；

所述酿酒废水中还添加了葡萄糖、木糖、葡聚糖、木聚糖、淀粉、硫酸铵、尿素、酵母浸膏、维生素B和维生素C中的任意一种或几种；

所述高附加值产物包括脂类、蛋白质、甲壳素和壳聚糖。

优选的，所述极端从毛红曲霉菌为从毛红曲霉丝状真菌YX-1125。

优选的，所述酿酒废水包括高浓度有机废水和低浓度有机废水。

优选的，所述葡萄糖、木糖、葡聚糖、木聚糖、淀粉添加浓度为5-25g/L。

优选的，所述硫酸铵、尿素、酵母浸膏添加浓度为20-40g/L。

优选的，所述维生素B、维生素C添加浓度为0.1-0.3g/L。

优选的，所述发酵培养温度为25-45℃，发酵培养时间为3-7天，震荡速率为80-180rpm。

优选的，所述步骤还包括极端从毛红曲霉菌的活化。

优选的，接种极端从毛红曲霉菌前，将所述酿酒废水稀释至酿酒废水含量为20-50％。

优选的，调节所述酿酒废水的pH值为7.5-8.5。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了利用酿酒废水培养极端从毛红曲霉菌来提取高附加值产物的方法，通过调整酿酒废水的成分组成以及发酵条件，有效的促进了菌体的生长，并提高了极端从毛红曲霉菌菌丝体中脂类、蛋白质、甲壳素、壳聚糖的含量。

本发明提供的方法具有操作简便、成本低、无污染等特点，满足了酿酒行业的需求。将该方法用于酿酒废水的处理，可在一定程度上带动酿酒行业的发展，并实现酿酒废水资源化的利用，提高酿酒废水的利用率，实现酿酒废水的绿色深度处理以及资源化利用。

附图说明

图1：从毛红曲霉丝状真菌YX-1125；

图2：酿酒废水中培养出的从毛红曲霉丝状真菌YX-1125上层；

图3：酿酒废水中培养出的从毛红曲霉丝状真菌YX-1125下层；

图4：从毛红曲霉丝状真菌YX-1125菌丝体中提取出的脂类；

图5：从毛红曲霉丝状真菌YX-1125菌丝体中提取出的甲壳素。

具体实施方式

本发明提供了一种极端从毛红曲霉菌利用酿酒废水生产高附加值产物的方法，包括如下步骤：将极端从毛红曲霉菌接种到酿酒废水中进行发酵培养，获得菌丝体，提取菌丝体中高附加值产物；所述酿酒废水中还添加了葡萄糖、木糖、葡聚糖、木聚糖、淀粉、硫酸铵、尿素、酵母浸膏、维生素B、维生素C中的任意一种或几种；所述高附加值产物包括脂类、蛋白质、甲壳素、壳聚糖。本发明有效的促进了菌体的生长，并提高了极端从毛红曲霉菌菌丝体中脂类、蛋白质、甲壳素、壳聚糖的含量。

本发明中，所述极端从毛红曲霉菌为从毛红曲霉丝状真菌YX-1125，该菌株为文献《Monascus pilosus YX-1125:An efficient digester for directly treating ultra-high-strength liquor wastewater and producing short-chain fatty acids undermultiple-stress conditions》中公开的菌株，保藏号为CGMCC 21938，保藏单位名称为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为：2021年03月29日。

本发明中，所述酿酒废水包括高浓度有机废水和低浓度有机废水，其中，低浓度有机废水为酿酒过程中的冷却水、场地冲洗水、洗瓶水，高浓度有机废水为底锅水、黄水、粮食浸泡水。酿酒废水中含有大量的可溶性有机物，还具有极高的COD值、高醇度、高酸度和高盐度的多重极端环境特征，本发明在研究过程中发现，从毛红曲霉丝状真菌YX-1125对酿酒废水中的极端环境因子的耐受性不同，改变酿酒废水的组成，发酵结果产生显著变化。

本发明中，所述酿酒废水中还添加了葡萄糖、木糖、葡聚糖、木聚糖、淀粉、硫酸铵、尿素、酵母浸膏、维生素B和维生素C中的任意一种或几种；优选添加葡萄糖、淀粉、硫酸铵、尿素、维生素B和维生素C中的任意一种或几种；更优选为添加淀粉、硫酸铵和维生素C中的任意一种或几种。本发明中，酿酒废水成分复杂，环境极端，存在高浓度的无机盐、有机酸和乙醇等发酵抑制物，改变使用酿酒废水发酵时的条件能够极大的影响发酵结果。本发明在研究中发现，在酿酒废水中添加不同的外源营养物质时，某些外源物质使微生物在发酵过程中进行代偿性生长，使更多代谢流进入菌体构建相关的合成代谢，而某些外源物质会缓解微生物的代偿性生长，减少菌体的积累，降低菌丝体中高附加值物质的含量。本发明提供的外源物质能够有效提高菌丝体中高附加值物质的含量。

本发明中，所述葡萄糖、木糖、葡聚糖、木聚糖、淀粉添加浓度为5-25g/L，优选添加浓度为7-15g/L，更优选为8-12g/L。

本发明中，所述硫酸铵、尿素、酵母浸膏添加浓度为20-40g/L，优选添加浓度为24-36g/L，更优选为28-32g/L。

本发明中，所述维生素B、维生素C添加浓度为0.1-0.3g/L，优选添加浓度为0.15-0.25g/L。

本发明中，所述发酵培养温度为25-45℃，发酵培养时间为3-7天，震荡速率为80-180rpm，优选的发酵培养温度为33-41℃，发酵培养时间为4-6天，震荡速率为100-120rpm。

本发明中，所述步骤还包括极端从毛红曲霉菌的活化。所述极端从毛红曲霉菌使用马铃薯葡糖琼脂培养基活化，作为一种可实施的方式，本发明采取划线方式将菌种接种于培养基，于25-45℃静置培养5-7天，每隔3天观察菌落的大小、密集程度、透明度颜色、污染情况，挑选生长情况好的菌落进行传代培养，经五次活化培养后选择生长较好的极端从毛红曲霉菌备用。

其中，所述马铃薯葡糖琼脂培养基(250g)中组分包括：马铃薯浸粉5g、琼脂15g、葡萄糖20g、pH值5.8-6.2、氯霉素0.1g。

本发明中，接种极端从毛红曲霉菌前，将所述酿酒废水稀释至酿酒废水含量为20-50％，稀释液优选为用水稀释，作为一种可实施的的方式，本发明使用蒸馏水稀释；优选稀释至酿酒废水含量为25-35％。

本发明中，调节所述酿酒废水的pH值为7.5-8.5。

如无特殊说明，本发明涉及的试剂、耗材等均可从商业途径获得，如未注明实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件进行。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

极端从毛红曲霉菌的活化

本实施例中极端从毛红曲霉菌为从毛红曲霉丝状真菌YX-1125

称取39g马铃薯葡萄糖琼脂培养基加入到1000mL烧杯中，加入蒸馏水至1000mL后混合均匀，将配制好的培养基分装在250mL锥形瓶中，每个锥形瓶中加入200mL配制好的培养基；将准备好的马铃薯葡萄糖琼脂培养基及培养皿放入高压灭菌锅中(温度为121℃；压强为0.155Mpa)高温灭菌30分钟；灭菌后于消毒后的操作台进行倒平板操作，待培养基冷却凝固后，将培养皿倒置备用；

使用接种环划线接种，将培养皿分为4个区域，每个区域划三至五根线，且每个区域的划线首尾相连，于35℃静置培养7天，每隔3天观察菌落的大小、密集程度、透明度颜色、污染情况，挑选生长情况好的菌落进行传代培养，经五次活化培养后选择生长较好的从毛红曲霉丝状真菌YX-1125为备用菌种(如图1所示)。

实施例2

极端从毛红曲霉菌的发酵

将从酿酒厂取回的高浓度酿酒废水过滤掉颗粒较大的杂质；

使用蒸馏水稀释酿酒废水至酿酒废水含量为30％，并调节其pH为8.0；

将100mL酿酒废水倒入锥形瓶，添加1g葡萄糖，使用棉花塞紧瓶口，并用纱布及报纸包裹好瓶口，高压灭菌(温度为121℃；压强为0.155Mpa)30min；

冷却后接种实施例1中获得的从毛红曲霉丝状真菌YX-1125备用菌种，接种完成后用棉花塞紧瓶口，并用纱布及报纸包裹好瓶口，培养温度为40℃，震荡速率为120rmp，培养7天。

实施例3

本实施例与实施2的区别在于100mL酿酒废水中添加1g淀粉。

实施例4

本实施例与实施2的区别在于100mL酿酒废水中添加3g尿素。

实施例5

本实施例与实施2的区别在于100mL酿酒废水中添加3g硫酸铵。

实施例6

本实施例与实施2的区别在于100mL酿酒废水中添加3g酵母浸膏。

实施例7

本实施例与实施2的区别在于100mL酿酒废水中添加0.02g维生素B。

实施例8

本实施例与实施2的区别在于100mL酿酒废水中添加0.02g维生素C。

对比例1

本对比例与实施例2的区别在于未在酿酒废水中添加外源物质。

对比例2

本对比例与实施例2的区别在于100mL酿酒废水中添加1g乳酸。

对比例3

本对比例与实施例2的区别在于100mL酿酒废水中添加0.02g维生素E。

实施例9

本实施例对比了不同方法获得的菌丝体重量

本发明从毛红曲霉丝状真菌YX-1125在酿酒废水中培养如图2、图3所示，丝状真菌整体呈块状，上层为白色菌丝，下层为深棕色并有褶皱。

将实施例2-8以及对比例1-3发酵获得的丝状真菌丛毛红曲霉YX-1125从锥形瓶中取出并过滤，使用蒸馏水将菌体洗至滤液为无色透明时，说明菌体已经洗净。将洗净的菌体放入容量为300ml的烧杯中，然后将烧杯放入烘箱中将温度调为105℃烘干2h至恒重，获得丝状真菌丛毛红曲霉YX-1125干菌体，用研钵进行研磨为粉末状，称重，结果如表1所示。

表1菌丝体干重

由表1可知酿酒废水中添加不同外源物质时，从毛红曲霉丝状真菌YX-1125菌丝体生长量不同，添加乳酸和添加维生素E的酿酒废水长出的丝状真菌较少。因此在酿酒废水中添加乳酸和维生素E并不能提高从毛红曲霉丝状真菌YX-1125菌丝体中高附加产物的提取量。

实施例10

本实施例对比了不同方法获得的菌丝体中高附加值产物的含量

1.脂类的提取

取已研磨成粉末状的菌丝体，用滤纸将其包裹好。完成上述操作后将其放入组装好的索式提取器中，倒入石油醚溶液，置于100℃的恒温水浴锅内，通电水浴加热，提取2h，待冷却到室温后取下装置将其溶液倒出，倒出的溶液呈黄色，如图4所示。待石油醚挥发后称取脂类重量(G_L)，结果如表2所示。

2.蛋白质、甲壳素和壳聚糖的提取

培养获得的菌体经过滤、烘干、磨碎后，将研磨好的粉末状菌丝体倒入烧杯中，并向烧杯中加入1mol/L NaOH溶液，使菌体含量达25g/L，在水浴锅中加热1h，期间不停用玻璃棒搅拌。待菌丝体溶入NaOH溶液中，将其取出冷却至室温，将冷却后的混合物过滤，将固液分离获得碱不溶物，蛋白质溶于液体中，将碱性不溶物用蒸馏水洗涤至中性后烘干称重，差值为蛋白质的含量，结果如表2所示。

在上述步骤获得的固体物质中加入100倍体积的2％(体积分数)的乙酸，放入水浴锅中加热至95℃水解24h，完成上述操作后将其过滤，得到固体物质甲壳素如图5所示，称取重量，甲壳素含量如表2所示。

上述步骤中过滤得到的上清液用NaOH溶液调节pH至9，再进行过滤，将固体水洗后再用乙醇洗涤，完成上述操作后可获得壳聚糖，将其称重后得到壳聚糖的含量，壳聚糖含量如表2所示

表2菌丝体提取高附加值产物含量

根据表2结果可知，与对比例相比，添加外源营养物质可提高极端从毛红曲霉菌高附加值产物的提取量，然而不同物质对极端从毛红曲霉菌菌丝体的积累以及高附加值产物含量的影响并不相同。

通过对比菌体干重、脂类含量、蛋白质含量、甲壳素和壳聚糖的含量，在酿酒废水中加入10g/L淀粉时，脂类含量占5.97％、蛋白质含量占57.3％、甲壳素含量占23.79％、壳聚糖含量占6.93％；在酿酒废水中加入30g/L硫酸铵时，脂类含量占5.10％、蛋白质含量占61.85％、甲壳素含量占24.73％、壳聚糖含量占7.15％；在酿酒废水中加入0.2g/L维生素C时，脂类含量占5.48％、蛋白质含量占55.72％、甲壳素含量占18.99％、壳聚糖含量占5.59％，有效提高了极端从毛红曲霉菌菌丝体中高附加值产物含量，并实现酿酒废水资源化的利用，提高酿酒废水的利用率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种极端从毛红曲霉菌利用酿酒废水生产高附加值产物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

所述高附加值产物包括脂类、蛋白质、甲壳素和壳聚糖。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述极端从毛红曲霉菌为从毛红曲霉丝状真菌YX-1125。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酿酒废水包括高浓度有机废水和低浓度有机废水。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖、木糖、葡聚糖、木聚糖、淀粉添加浓度为5-25g/L。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫酸铵、尿素、酵母浸膏添加浓度为20-40g/L。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述维生素B、维生素C添加浓度为0.1-0.3g/L。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养温度为25-45℃，发酵培养时间为3-7天，震荡速率为80-180rpm。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤还包括极端从毛红曲霉菌的活化。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，接种极端从毛红曲霉菌前，将所述酿酒废水稀释至酿酒废水含量为20-50％。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，调节所述酿酒废水的pH值为7.5-8.5。