CN103060416B - 一种利用微生物技术清洁生产黄姜皂素的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用微生物技术清洁生产黄姜皂素的方法，属于生物工程领域，解决现有黄姜产业废水废渣排放量大、不能有效利用黄姜淀粉的问题。本发明先微生物处理释放黄姜皂苷，得到含黄姜皂苷和淀粉的发酵液；然后双酶法处理上述发酵液中淀粉得到水解糖，进一步释放黄姜皂苷；固液分离黄姜糖化醪；再先后采用微滤和纳滤膜分离分别富集水解糖和黄姜皂苷，或者通过特定微生物发酵分离得到胞内产物和黄姜皂苷，浓缩的黄姜皂苷溶液经糖苷酶或少量酸水解及少量有机溶剂提取即可得到黄姜皂素。该方法黄姜皂素收率高(90～95％)，生产过程废水量少且污染程度低，且微生物处理成本低、用时短、黄姜淀粉回收充分，在黄姜产业中具有极大的工业应用推广价值。
Description
技术领域
本发明属于生物工程和生物化工领域，具体涉及一种利用微生物技术清洁生产黄姜皂素的方法,该方法以分泌纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、木聚糖酶活力高且淀粉酶活力低的微生物预处理黄姜原料，然后利用双酶法高温水解淀粉得到水解糖并同时灭活预处理用的微生物；再结合膜分离清洁生产水解糖和黄姜皂素，或者利用产胞内产物的微生物发酵直接利用掉水解糖，在得到胞内产物的同时，实现黄姜皂苷与水解糖分离。
背景技术
黄姜，学名盾叶薯蓣，多年生草本植物，是我国特有的药材，含2～3%的黄姜皂素（薯蓣皂苷元）。黄姜皂素是甾体激素药物合成的初级原料，可加工成180多种药物，被称为药物中的黄金。黄姜还含有30～40%的淀粉，40～50%的纤维素，用途广泛。黄姜皂素是薯蓣属植物中黄姜皂苷的配基，以黄姜皂苷的形式存在，其中水溶性皂苷占90%左右，脂溶性皂苷占10%左右。自然状态下，黄姜皂苷被黄姜细胞壁中大量的纤维素、半纤维素和果胶质等物质所包裹，并伴有木质素存在，其结构紧密，机械强度大，难以破坏。
传统的黄姜皂素生产采用直接酸解法，这一工艺不仅酸用量大，导致废水废渣排放量大，每生产1吨黄姜皂素会产生至少500吨废水和8～9吨废渣，废水中COD浓度高达30000～50000mg/L，污染极其严重，而且淀粉也难以再利用，此法黄姜皂素收率较低，大量使用溶剂汽油，易燃易爆，十分危险。我国湖北省十堰市是黄姜的主要种植和黄姜皂素生产加工地区，位于南水北调的源头，大量未经处理高糖高酸废水的排放将严重威胁到南水北调的水质安全，引起社会各界的广泛关注。
为减少黄姜皂素生产带来的污染，人们试图将黄姜皂苷同淀粉、纤维素以及果胶等分开，以减少酸的用量和废水废渣的排放量，我国每年黄姜皂素的产量约1500吨，同时能生产至少75000吨淀粉副产品，因此，对于黄姜淀粉的综合利用，逐渐引起人们的关注，如黄进和张声华从黄姜中提取葡萄糖副产品（申请号：00131274.X），余盛树利用黄姜原料同时生产出皂素和酒精两个产品（申请号：02138773.7），刘慧、王焰新和鲍建国利用黄姜酶解糖液制备保健糖浆（黄姜生产皂素副产酶解糖液生产保健糖浆的方法（申请号：200510018758.9）等。这些研究都综合利用了黄姜淀粉，但尚存在黄姜皂素收率较低、污染依然较严重等问题，黄姜皂素的清洁生产工艺研究显得尤为迫切。
国内围绕黄姜皂素清洁生产技术研究取得的一些进展，主要有：十堰秦岭中地科技公司的“直接分离法”清洁生产技术，该工艺是通过物理方法对黄姜进行粉碎后压滤冲洗先分离纤维素，再从淀粉与黄姜皂苷混合物中分离出淀粉，再酸解提取皂素，因此，用酸量减少85%，每生产1吨皂素可回收淀粉12吨、纤维素15吨，但此方法酸水解之前需要先浓缩含黄姜皂苷的溶液，耗费电量较大，而且还需增加黄姜洗皮去须预处理步骤，用水量很大，皂素收率较低，且在淀粉和纤维素中残留的皂苷含量仍然较高，淀粉和纤维素需要进一步纯化才能被综合利用，因此，生产成本依然很高。中国地质大学、竹溪创艺公司发明的“糖化膜分离水解”清洁生产工艺，即通过对黄姜浆料进行液化糖化，使黄姜中淀粉转化为糖，再通过膜分离技术将糖溶液与渣料分离，淀粉糖得到回收利用，渣料酸解提取皂素。该技术皂素回收率较高，每生产1吨黄姜皂素酸用量减少60%以上，且废水排放量小于70吨，但也存在一些突出问题需要进一步解决，如流失了大量水溶性黄姜皂苷、工艺路线较长、膜分离需要进行三级分离操作难度大、运行成本高等。黄姜皂苷被黄姜细胞壁中大量的纤维素、半纤维素和果胶质等物质所包裹，并伴有木质素存在，其结构紧密，机械强度大，难以破坏。因此，提取它的步骤通常需要采用一些方法使植物细胞壁的结构变得松散，促进黄姜皂苷释放出来。在本发明的申请人2010年已公布的专利（申请号201010152619.6）技术中，公布了先使用蒸汽爆破和多种酶协同处理黄姜原料，得到含黄姜皂苷的淀粉水解糖液，然后采用微生物发酵利用水解糖生产胞外有机酸，并将发酵过程与多级膜分离耦合，实现菌体浓缩回流到发酵罐高效利用水解糖大量生产有机酸，同时膜分离进一步将有机酸和黄姜皂苷分开，使黄姜皂苷得到浓缩富集，再使用少量的薯蓣皂苷酶或酸将黄姜皂苷水解为黄姜皂素。这一技术可以大幅减少酸和有机溶剂的用量，实现了利用黄姜原料清洁生产黄姜皂素联产有机酸，但也还存在预处理时间偏长（20～30小时），乳酸、琥珀酸等胞外发酵产物与水溶性黄姜皂苷混合存在于发酵液中增加了膜分离难度等问题。
综上所述，黄姜皂素清洁生产工艺要实现大规模生产应用，还需要进一步解决上述发明存在的各种问题。
发明内容
本发明针对上述问题，提供了一种利用微生物技术清洁生产黄姜皂素的方法，整个生产工艺避免了大量使用强酸长时间高温处理以及大量使用有机溶剂，生产过程十分安全、操作工艺简单，且用时较短、用水量少、能耗低，同时黄姜皂素易于提取、收率高，并实现了黄姜淀粉高值化利用。总生产成本较低，工业化应用效益显著。
本发明提供的一种利用微生物技术清洁生产黄姜皂素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
第1步 微生物处理释放黄姜皂苷步骤：
按照黄姜干重与水的质量比为1:5～1:10混合均匀制成浆液，在浆液中接种微生物进行发酵处理，该微生物能分泌包括纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶和木聚糖酶中的任二种或二种以上，但分泌淀粉酶能力小于或者等于0.1U每毫升发酵液，得到含大量黄姜皂苷和淀粉的微生物发酵液；
第2步 双酶法处理上述微生物发酵液中淀粉得到水解糖，并从发酵液的固体颗粒中进一步释放黄姜皂苷步骤：
向上述发酵液中按黄姜干重每千克加入6万～10万单位（U）α-淀粉酶,在pH值4.0～7.0、温度90～92℃条件下液化5min～30min，发酵液中微生物此时已被高温灭活，不会利用水解糖；将高温发酵液冷却至60℃以下后，再按黄姜干重每千克加入6万～10万单位（U）糖化酶，在pH4.0～7.0、温度40～60℃条件下糖化6h～24h，得到含有大量黄姜皂苷和水解糖的黄姜糖化醪；
第3步 固液分离黄姜糖化醪步骤：
通过固液分离去除上述黄姜糖化醪中未被酶解的固体残渣和灭活的微生物，得到经第2步处理后形成的含有大量黄姜皂苷和水解糖的混合液，即糖化液；
第4步 糖化液中黄姜皂苷和水解糖的分离步骤：
通过以下两种方式分离上述糖化液中含有的黄姜皂苷和水解糖：
第一种方式：通过微滤得到清液，再通过纳滤装置，截留分子量较大的黄姜皂苷，滤过分子量较小的水解糖，分别得到浓缩的黄姜皂苷溶液和水解糖溶液两种粗产品；
第二种方式：以上述糖化液为碳源，配制培养基，灭菌后接种耐黄姜皂苷且产大量胞内产物的菌株，发酵后固液分离，将菌体及黄姜皂苷溶液分开，分别得到富含胞内发酵产物的菌体和黄姜皂苷溶液两种粗产品；
第5步 水解含黄姜皂苷的溶液获得黄姜皂素粗品；
第6步 所述黄姜皂素粗品再经混合有活性炭的有机溶剂提取即得到黄姜皂素，所述活性炭的质量百分比浓度为0.3～0.8%。
上述技术方案可以采用下述一种或几种方式进行改进：（一）第1步中的发酵处理时间为3h～10h；（二）第4步的第二种方式中，接种的微生物为耐黄姜皂苷且产胞内产物的菌株，如产γ-亚油酸的小克银汉霉，或者为将菌体本身作为高蛋白饲料的产朊假丝酵母，或者产多杀菌素的刺糖多胞菌等；（三）第4步的第一种方式中，微滤装置的孔径为0.10～0.45μm，纳滤装置孔径为1～2nm，纳滤膜是截留分子量为200～500道尔顿的有机膜。（四）第5步中，对于第4步中第一种方式得到浓缩的黄姜皂苷溶液，可直接水解含黄姜皂苷溶液，黄姜皂素不溶于水而沉淀，固液分离后获得黄姜皂素粗品；对于第4步中第二种方式得到的黄姜皂苷溶液，先采用减压浓缩（减压浓缩条件为：60～90℃，真空度-0.1～0.08Mpa）后，得到浓缩的黄姜皂苷溶液，再对其进行水解成为黄姜皂素，黄姜皂素不溶于水而沉淀，固液分离后获得黄姜皂素粗品。
上述技术方案可以采用下述方式进行进一步改进：所述黄姜原料为鲜黄姜或黄姜干粉，鲜黄姜经洗净去杂后，在温度120～130℃、压力0.1～0.2MPa条件下，蒸汽爆破15～20min，冷却至室温后使用；黄姜干粉由黄姜块根干燥后粉碎至30目～100目得到，或进一步采用与鲜黄姜相同条件的爆破处理后得到。对于原料为鲜黄姜时，上述第2步中，按每千克鲜黄姜加入2万～3.3万单位（U）液态α-淀粉酶，按每千克鲜黄姜加入2万～3.3万单位（U）液态糖化酶。
本发明方法第5步中水解可优选下述二种方式：（一）在黄姜皂苷溶液中，按照10～15U/L加入薯蓣糖苷酶，在30～40℃条件下搅拌30～40min，黄姜皂素不溶于水而沉淀，固液分离后得到黄姜皂素粗品；（二）向浓缩黄姜皂苷溶液中加入硫酸，使硫酸终浓度为0.75～1.50mol/L，在100～104℃条件下酸解2～4h，黄姜皂素不溶于水而沉淀，固液分离后得黄姜皂素粗品。
以上所有步骤中用到固液分离均采用板框过滤或离心分离。
第6步中的有机溶剂可采用石油醚、汽油、乙酸乙酯中的任何一种。
本发明突破现有工艺瓶颈，使用微生物发酵方法替代处理时间长且成本高的复合酶方法，处理黄姜原料的微生物是分泌纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、木聚糖酶活力高且淀粉酶活力很低的细菌或真菌高效预处理黄姜原料，使存在于植物组织中被纤维素、果胶质、淀粉等包裹的黄姜皂苷充分释放到溶液中。在双酶法后固液分离所得的糖化液中，再先后采用微滤和纳滤膜分离分别得到含水解糖或黄姜皂苷的溶液；或接种耐黄姜皂苷且产胞内产物的菌株如产γ-亚油酸的小克银汉霉、将菌体本身作为高蛋白饲料的产朊假丝酵母等，通过发酵后固液分离，即可将菌体及黄姜皂苷溶液分开，分别得到富含胞内产物的菌体和富含黄姜皂苷的溶液两种粗产品，这种方法可减少膜分离设备投资及生产成本；本发明还可通过在黄姜原料制成浆液前利用蒸汽爆破处理，进一步提高黄姜皂素的收率、降低生产成本，同时缩短生产时间。本发明方法完全克服了以往专利存在的诸多不足，真正实现了黄姜皂素的清洁生产和高值化综合利用，并易于实现工业化应用，为黄姜产业健康持续发展提供了有力的技术支撑。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
首先说明以下各实施例所用的测量方法：
（1）有机酸的定量测定方法：采用高效液相色谱法，单位g/L，参考Oh,H.,Wee,Y.J.,Yun,J.S.,Han,S.H.,Jung,S.W.,Ryu,H.W.,2005.Lacticacid production from agricultural resources as cheap raw materials.Bioresour.Technol.96:1492-1498.及Meynial-Salles,I.,Dorotyn,S.,Soucaille,P.A.newprocess for thecontinuous production of succinic acid from glucose at high yield,titer,and productivity[J].Biotechnology and Bioengineering.208,99(1):12.
（2）还原糖的定量测定方法：采用3,5-二硝基水杨酸法（DNS法），单位g/L，参考Miller,G.L.,1959.Use ofdinitrosalicylic acid reagent fordetermination of reducing sugar.Anal.Chem31:426-429.
（3）黄姜皂素的定量测定方法：高效液相色谱法，色谱条件为：C18反相柱（syncronis C18250×4.6mm）,检测波长204nm，流动相为纯甲醇，流速1ml/min，进样量10μL。
实施例1包括下列步骤：
1.黄姜原料预处理步骤
500克黄姜块根干燥后粉碎至100目，在温度120～130℃、压力0.1～0.2MPa条件下，蒸汽爆破15min，冷却至室温；
2.微生物处理释放黄姜皂苷步骤
上述黄姜干粉按照黄姜干粉：水=1:5（w/v）加水搅拌均匀；然后接入10%种子液，于pH值6.0、温度37℃条件下，搅拌转速150rpm，发酵处理10h后结束。
所述种子液是普通的LB培养基，即每升水加入蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，调节pH值至7.0，混合成种子培养基并灭菌，冷却至室温，得到无菌种子培养基；将产纤维素酶、果胶酶酶系的菌种接种于无菌种子培养基，在pH值7、温度37℃条件下搅拌，搅拌速度120rpm，时间10h，得到种子液；所述能产纤维素酶、果胶酶组成的酶系的菌种是地衣芽孢杆菌Hg-1；
3.双酶法处理上述发酵液中淀粉得到水解糖，并从发酵液的固体颗粒中进一步释放黄姜皂苷步骤
上述发酵液置于高温下灭活菌种，适当冷却后向其中加入3万单位α-淀粉酶,在pH值7.0、温度90℃条件下液化5minmin，冷却至60℃以下；再加入3万液态糖化酶，在pH值4.0、温度60℃条件下糖化6h，得到黄姜糖化醪。
4.固液分离获得含黄姜皂苷和水解糖的混合液步骤。
步骤三中糖化醪再通过固液分离（5000rpm离心8min）去除其中未被酶解的固体残渣，得到经微生物及双酶法处理形成的含有大量黄姜皂苷和糖分的混合液，经SBA-生物传感仪测定得到其葡萄糖浓度为59g/L。
5.糖化液中黄姜皂苷和水解糖的分离步骤。
上述含有大量水溶性黄姜皂苷和糖分的混合液进一步通过微滤得到清液，再通过孔径为1nm的纳滤装置，截留分子量较大（M=869.05）的黄姜皂苷，滤过分子量较小的水解糖，分别得到水解糖溶液和浓缩的黄姜皂苷溶液两种粗产品。
6.水解含黄姜皂苷的浓缩液获得黄姜皂素粗品步骤。
本实例中，上述浓缩的黄姜皂苷溶液中，加入一定浓度硫酸，使硫酸终浓度为1.5mol/L，在100℃条件下酸解2h，水洗除去液体部分即得黄姜皂素粗品。
所述黄姜皂素粗品再以石油醚混合0.3%活性炭为提取剂，在85℃温度下回流提取4h，趁热除去活性炭，在压力0.01～0.05Mpa、温度60℃条件下旋转蒸发，回收有机溶剂石油醚循环利用，并得到白色黄姜皂素固体。
7.利用黄姜淀粉糖化液发酵生产酒精
将上述黄姜淀粉糖化液糖浓度调整为含糖量150g/L加（15%左右淀粉浆）入发酵罐进行高压蒸汽灭菌，冷却到室温后，向发酵罐中接入体积比17%的种子液，于pH值4.5、温度28.5℃条件下，静置发酵84h。
所述种子液按如下方法制备：取一定量的活性干酵母置于10倍重量的5%灭菌待用的糖水中，38℃水浴中活化50min，即可用来接种。
生产结果：每100克干黄姜生产出皂素2.17克，酒精25.97g。
实施例2包括下列步骤：
1.黄姜原料预处理步骤
1000克黄姜块根干燥后，粉碎至60目。
2.微生物处理释放黄姜皂苷步骤
按照黄姜干粉：水=1:10（w/v）加水混合均匀；冷却后接种10%种子液，于pH值6.0、温度37℃条件下，搅拌转速150rpm，发酵处理6h后结束。
所述种子液是普通的LB培养基，即每升水加入蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，调节pH值至7.0，混合成种子培养基并灭菌，冷却至室温，得到无菌种子培养基；将能产纤维素酶、半纤维素、果胶酶组成的酶系的两种菌种分别接种于无菌种子培养基，在pH值7、温度37℃条件下搅拌，搅拌速度120rpm，时间10h，得到两种种子液；所述能产纤维素酶、半纤维素、果胶酶酶系的菌种是地衣芽孢杆菌Hg-1和Hg-6，两种菌株种子液同时添加5%复合处理；
3.双酶法处理上述发酵液中淀粉得到水解糖，并进一步释放黄姜皂苷步骤
上述发酵液置于高温下灭活菌种，适当冷却后加入8万单位α-淀粉酶,在pH值4.0、温度91℃条件下液化20min，冷却至60℃以下；再按每千克黄姜干粉加入8万单位糖化酶，在pH值7.0、温度60℃条件下糖化16h，得到黄姜糖化醪。
4.固液分离获得含黄姜皂苷和水解糖的混合液步骤
上述糖化醪再通过固液分离（5000rpm离心8min）去除其中未被酶解的固体残渣，得到经微生物及双酶法处理形成的含有大量黄姜皂苷和糖分的混合液，经SBA-生物传感仪测定得到混合液中葡萄糖浓度为62g/L。
5.糖化液中黄姜皂苷和水解糖的分离步骤。
步骤4中混合液进一步通过微滤得到清液，再通过孔径为1.5nm的纳滤装置，截留分子量较大（M=869.05）的黄姜皂苷，滤过分子量较小的水解糖，分别得到水解糖溶液和浓缩的黄姜皂苷溶液两种粗产品。
6.酶法或酸法水解含黄姜皂苷的溶液获得黄姜皂素粗品步骤
上述浓缩的黄姜皂苷溶液中，加入一定浓度硫酸，使硫酸终浓度为1.0mol/L，在102℃条件下酸解3h，水洗除去液体部分即得黄姜皂素粗品。
所述黄姜皂素粗品再以石油醚混合0.5%的活性炭为提取剂，在85℃温度下回流提取4h，趁热除去活性炭，在压力0.01～0.05Mpa、温度60℃条件下旋转蒸发，回收有机溶剂石油醚循环利用，并得到白色黄姜皂素固体。7.利用黄姜淀粉糖化液发酵生产酒精
通过添加葡萄糖将上述黄姜淀粉糖化液糖浓度调整为150g/L（15%左右淀粉浆），加入发酵罐进行高压蒸汽灭菌，冷却到室温后，向发酵罐中接入体积比15%的种子液，于pH值4.5、温度28.5℃条件下，静置发酵84h。
所述种子液按如下方法制备：取一定量的活性干酵母置于10倍重量的5%灭菌待用的糖水中，38℃水浴中活化50min，即可用来接种。
生产结果：每100克干黄姜生产出皂素2.20克，酒精26.84g。
实施例3包括下列步骤：
1.黄姜原料预处理步骤
鲜黄姜洗净去杂后，取20千克在温度120～130℃、压力0.1～0.2MPa条件下，蒸汽爆破20min，冷却至室温。
2.微生物处理释放黄姜皂苷步骤
将经过预处理后的黄姜块茎粉碎至浆液，按照鲜黄姜：水=1:2（w/v）加水搅拌均匀；然后接入10%种子液，于pH值6.0、温度37℃条件下，搅拌转速150rpm，发酵处理10h后结束。
所述种子液是普通的LB培养基，即每升水加入蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，调节pH值至7.0，混合成种子培养基并灭菌，冷却至室温，得到无菌种子培养基；将产纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶或木聚糖酶的菌种接种于无菌种子培养基，在pH值7、温度37℃条件下搅拌，搅拌速度120rpm，时间10h，得到种子液；所述能产纤维素酶、果胶酶等组成的酶系的菌种是地衣芽孢杆菌Hg-5；
3.双酶法处理上述发酵液中淀粉得到水解糖，并进一步释放黄姜皂苷步骤。
上述发酵液置于高温下灭活菌种，适当冷却后加入40万单位α-淀粉酶,在pH值6.2、温度92℃条件下液化15min～20min，冷却至60℃以下；再加入66万单位糖化酶，在pH值4.2、温度60℃条件下糖化24h，得到黄姜糖化醪。
4.固液分离获得含黄姜皂苷和水解糖的混合液步骤
上述糖化醪再通过固液分离（板框过滤）去除其中未被酶解的固体残渣，得到经微生物及双酶法发酵处理形成的含有大量黄姜皂苷和糖分的混合液，经SBA-生物传感仪测定得到混合液葡萄糖浓度为60g/L。
5.糖化液中黄姜皂苷和水解糖的分离步骤。
步骤4混合液进一步通过微滤得到清液，清夜再通过孔径为2nm的纳滤装置，截留分子量较大（M=869.05）的黄姜皂苷，滤过分子量较小的水解糖，分别得到水解糖溶液和浓缩的黄姜皂苷溶液两种粗产品。
6.酶法或酸法水解含黄姜皂苷的溶液获得黄姜皂素粗品
上述纳滤截留的黄姜皂苷浓缩液中，每升加入15U薯蓣皂苷酶，在pH值为6.0、温度40℃条件下搅拌40min，除去上清即得黄姜皂素粗品。
所述皂素粗液再以汽油混合0.8%活性炭为提取剂，在60℃温度下回流提取4h，趁热过滤活性炭，在压力0.01～0.05Mpa、温度60℃条件下旋转蒸发，回收有机溶剂汽油循环利用，并得到白色黄姜皂素固体。
7.利用黄姜淀粉糖化液发酵生产酒精
通过添加葡萄糖将上述黄姜淀粉糖化液糖浓度调整为含糖量150g/L（15%左右淀粉浆）入发酵罐进行高压蒸汽灭菌，冷却到室温后，向发酵罐中接入体积比17%的种子液，于pH值4.5、温度28.5℃条件下，静置发酵84h。
所述种子液按如下方法制备：取一定量的活性干酵母置于10倍重量的5%灭菌待用的糖水中，38℃水浴中活化50min，即可用来接种。
生产结果：每100克鲜黄姜生产出皂素0.75克，酒精25.97g。
实施例4包括下列步骤：
1.黄姜原料预处理步骤
7.5千克黄姜块根干燥后，粉碎至30目，在温度120～130℃、压力0.1～0.2MPa条件下，蒸汽爆破20min，冷却至室温。
2.微生物处理释放黄姜皂苷步骤
经过预处理的黄姜原料按照黄姜干粉：水=1:7（w/v）加水搅拌均匀；然后接入10%种子液，于pH值6.0、温度37℃条件下，搅拌转速150rpm，发酵处理4h后结束。
所述种子液是普通的LB培养基，即每升水加入蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，调节pH值至7.0，混合成种子培养基并灭菌，冷却至室温，得到无菌种子培养基；将能产纤维素酶、果胶酶组成的酶系的两种菌种分别接种于无菌种子培养基，在pH值7、温度37℃条件下搅拌，搅拌速度120rpm，时间10h，得到两种种子液；所述产纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶或木聚糖酶的菌种分别是地衣芽孢杆菌Hg-1和Hg-5，两种菌株种子液同时添加5%复合处理；
3.双酶法处理上述发酵液中淀粉得到水解糖，并进一步释放黄姜皂苷步骤
上述发酵液置于高温下灭活菌种，适当冷却后，加入75万单位α-淀粉酶,在pH值6.2、温度92℃条件下液化30min，冷却至60℃以下；再加入75万单位糖化酶，在pH值4.0、温度60℃条件下糖化6h，得到黄姜糖化醪。
4.固液分离获得含黄姜皂苷和水解糖的混合液步骤
上述糖化醪再通过固液分离（板框过滤）去除其中未被酶解的固体残渣，得到经微生物及双酶法预处理形成的含有大量黄姜皂苷和糖分的混合液，经SBA-生物传感仪测定得到混合液葡萄糖浓度62g/L。
5.糖化液中黄姜皂苷和水解糖的分离步骤
步骤4混合液进一步通过微滤得到清液，再通过孔径为1nm纳滤装置，截留分子量较大（M=869.05）的黄姜皂苷，滤过分子量较小的水解糖，分别得到水解糖溶液和浓缩的黄姜皂苷溶液两种粗产品。
6.酶法或酸法水解含黄姜皂苷溶液获得黄姜皂素粗品步骤
上述浓缩的黄姜皂苷溶液中，每升加入10U薯蓣皂苷酶，在pH值为5.0、温度37℃条件下搅拌30min，除去上清即得黄姜皂素粗品。
所述皂素粗品再以乙酸乙酯混合0.5%活性炭为提取剂，在80℃温度下回流提取4h，趁热除去活性炭，在压力0.01～0.05Mpa、温度60℃条件下旋转蒸发，回收有机溶剂乙酸乙酯循环利用，并得到白色黄姜皂素固体。
7.利用黄姜淀粉糖化液发酵生产酒精
将上述黄姜淀粉糖化液糖浓度调整为含糖量150g/L（15%左右淀粉浆）加入发酵罐进行高压蒸汽灭菌，冷却到室温后，向发酵罐中接入体积比15%的种子液，于pH值4.5、温度28.5℃条件下，静置发酵84h。
所述种子液按如下方法制备：取一定量的活性干酵母置于10倍重量的5%灭菌待用的糖水中，38℃水浴中活化50min，即可用来接种。
生产结果：每100克干黄姜生产出皂素2.10克，酒精26.84g。
实施例5包括下列步骤：
1.黄姜原料预处理步骤
鲜黄姜洗净去杂后，取1500克在温度120～130℃、压力0.1～0.2MPa条件下，蒸汽爆破15min，冷却至室温。
2.微生物处理释放皂苷步骤
将上述经过预处理的黄姜块茎粉碎至浆液，按照鲜黄姜：水=1:2（w/v）加水搅拌均匀；然后接种10%种子液，于pH值6.0、温度37℃条件下，搅拌转速150rpm，预处理4h后结束。
所述种子液是普通的LB培养基，即每升水加入蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，调节pH值至7.0，混合成种子培养基并灭菌，冷却至室温，得到无菌种子培养基；将能产纤维素酶、果胶酶组成酶系的菌种接种于无菌种子培养基，在pH值7、温度37℃条件下搅拌，搅拌速度120rpm，时间10h，得到种子液；所述能产纤维素酶、果胶酶组成酶系的菌种是地衣芽孢杆菌Hg-1；
3.双酶法处理上述发酵液中淀粉得到水解糖，并进一步释放黄姜皂苷步骤。
上述发酵液置于高温下灭活菌种，适当冷却后加入3万单位α-淀粉酶,在pH值6.2、温度90℃条件下液化15min，冷却至60℃以下；再加入4.5万单位糖化酶，在pH值4.2、温度60℃条件下糖化20h，得到黄姜糖化醪。
4.固液分离获得含黄姜皂苷和水解糖的混合液步骤
上述糖化醪再通过固液分离（5000rpm离心8min）去除其中未被酶解的固体残渣，得到经微生物及双酶法预处理形成的含有大量水溶性黄姜皂苷和糖分的混合液，经SBA-生物传感仪测定得到混合液葡萄糖浓度为60g/L。
5.糖化液中黄姜皂苷和水解糖的分离步骤。
配制生产γ-亚油酸的发酵培养基，送入发酵罐进行高压蒸汽灭菌，冷却到室温后，向发酵罐中接入体积比10%的种子液，于自然pH值、温度28℃、搅拌速度180rpm条件下培养3天，然后在温度20℃搅拌速度180rpm条件下继续培养3天。
所述种子液按如下方法制备：取PDA固体培养上生长至对数期的小克银汉霉与带玻璃珠的无菌水在无菌条件下混合，在温度28℃条件下搅拌，搅拌速度150rpm，时间20min，得到孢子悬液即为生产γ-亚油酸的种子液。
生产γ-亚油酸的发酵培养基组成为：将上述黄姜淀粉糖化液糖浓度调整为还原糖100g/L；每升黄姜酶解糖液中添加0.3g MgSO4·7H2O，2gKH2PO4，1g酵母膏，3g NH4NO3，20mg Fe2+,20mg Ca2+,20mg Cu2+,20mgZn2+，pH5.0～6.0。
发酵完毕后，离心或者抽滤发酵液，即可得到小克银汉霉菌体及含黄姜皂苷的发酵液两种粗产品；
γ-亚油酸提取：将小克银汉霉菌体烘干后磨碎，按照小克银汉霉菌体质量：石油醚体积=1:1萃取40min，在5000rpm条件下离心10min,上清石油醚相即为γ-亚油酸粗提液，在压力0.01～0.05Mpa、温度60℃条件下旋转蒸发，回收有机溶剂石油醚循环利用，并得到γ-亚油酸粗油。
6.酶法或酸法水解含黄姜皂苷溶液获得黄姜皂素粗品步骤
上述含黄姜皂苷的发酵液中，每升加入15U薯蓣皂苷酶，在pH值为5.5、温度37℃条件下搅拌30min，除去上清即得黄姜皂素粗品。
所述皂素粗液再以石油醚混合0.5%活性炭为提取剂，在85℃温度下回流提取4h，趁热过滤活性炭，在压力0.01～0.05Mpa、温度60℃条件下旋转蒸发，回收有机溶剂石油醚循环利用，并得到白色黄姜皂素固体。
生产结果：每100克干黄姜生产出皂素2.23g，γ-亚油酸1.62g。
实施例6包括下列步骤：
1.黄姜原料预处理步骤
500克黄姜块根干燥后，粉碎至30目。
2.微生物处理释放步骤
上述经过预处理的黄姜干粉按照黄姜干粉：水=1:7（w/v）加水搅拌均匀；然后接入10%种子液，于pH值6.0、温度37℃条件下，搅拌转速150rpm，发酵处理4h后结束。
所述种子液是普通的LB培养基，即每升水加入蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，调节pH值至7.0，混合成种子培养基并灭菌，冷却至室温，得到无菌种子培养基；将产木聚糖酶、果胶酶组成酶系的两种菌种分别接种于无菌种子培养基，在pH值7、温度37℃条件下搅拌，搅拌速度120rpm，时间10h，得到两种种子液；所述产木聚糖酶、果胶酶组成的酶系的菌种分别是地衣芽孢杆菌Hg-2和Hg-3，两种菌株种子液同时添加5%复合处理；
3.双酶法处理释放水解糖和黄姜皂苷步骤
上述发酵液置于高温下灭活菌种，然后加入6万单位α-淀粉酶,在pH值6.2、温度90～92℃条件下液化30min，冷却至60℃以下；再加入10万单位糖化酶，在pH值4.2、温度60℃条件下糖化12h，得到黄姜糖化醪。4.固液分离获得含黄姜皂苷和水解糖的混合液步骤
上述糖化醪再通过固液分离（5000rpm离心8min）去除其中未被酶解的固体残渣，得到经微生物及双酶法预处理形成的含有大量水溶性黄姜皂苷和糖分的混合液，经SBA-生物传感仪测定得到混合液葡萄糖浓度为62g/L。
5.糖化液中黄姜皂苷和水解糖的分离步骤
步骤4混合液进一步通过微滤得到清液，再通过孔径为2nm的纳滤装置，截留分子量较大（M=869.05）的黄姜皂苷，滤过分子量较小的水解糖，分别得到水解糖溶液和浓缩的黄姜皂苷溶液两种粗产品。
6.酶法或酸法水解含黄姜皂苷溶液获得黄姜皂素粗品步骤
上述纳滤截留的黄姜皂苷浓缩液中，每升加入10U薯蓣皂苷酶，在pH值为6.0、温度40℃条件下搅拌40min，除去上清即得黄姜皂素粗品。
所述皂素粗液再以石油醚混合活性炭为提取剂，在85℃温度下回流提取4h，趁热过滤活性炭，在压力0.01～0.05Mpa、温度60℃条件下旋转蒸发，回收有机溶剂石油醚循环利用，并得到白色黄姜皂素固体。
7.利用黄姜淀粉糖化液发酵生产琥珀酸
配制生产琥珀酸的发酵培养基，送入发酵罐进行高压蒸汽灭菌，冷却到室温后，向发酵罐中接入体积比10%的种子液，于pH值7.0、温度33℃条件下，按照速度1L/min通入CO2并搅拌，搅拌转速200rpm，当发酵液中还原糖浓度小于2g/L时发酵结束。
所述种子液按如下方法制备：每升水加入葡萄糖15g、蛋白胨15g、酵母粉7.5g，混合成种子培养基并灭菌，冷却至室温，得到无菌种子培养基；将产琥珀酸菌种接种于无菌种子培养基，在pH值7、温度50℃条件下搅拌，搅拌速度200rpm，时间18h，得到种子液；所述产琥珀酸菌种是产琥珀酸放线杆菌FZ53。
生产琥珀酸的发酵培养基组成为：将上述黄姜淀粉糖化液糖浓度调整为还原糖150g/L；每升黄姜酶解糖液中添加酵母粉5g、蛋白胨10g、K2HPO42g，调节pH值至7.0；
生产结果：每100克鲜黄姜生产出皂素0.76克，琥珀酸24.26g。
实施例7包括下列步骤：
1.黄姜原料预处理步骤
1000克黄姜块根干燥后，粉碎至100目，在温度120～130℃、压力0.1～0.2MPa条件下，蒸汽爆破20min，冷却至室温。
2.微生物处理释放皂苷步骤
上述经过预处理的黄姜干粉按照黄姜干粉：水=1:6（w/v）加水搅拌均匀；然后接种10%种子液，于自然pH值、温度25℃条件下，搅拌转速150rpm，预处理10h后结束。
所述种子液是富含孢子的悬液，先称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加10～20g葡萄糖和17～20g琼脂，充分溶解后灭菌，冷却至室温，得到无菌种子培养基；将产纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶组成的酶系的菌种接种于无菌种子培养基，在温度25℃条件下静置培养时间24～48h，形成大量菌丝体后加入无菌水振荡得到种子液；所述产纤维素酶、果胶酶组成酶系的菌种是白腐真菌Hg-4；
3.双酶法处理上述发酵液中淀粉得到水解糖，并进一步释放黄姜皂苷步骤
上述发酵液置于高温下灭活菌种，适当冷却后加入10万单位α-淀粉酶,在pH值6.2、温度90～92℃条件下液化15min～20min，冷却至60℃以下；再加入8万单位糖化酶，在pH值4.2、温度60℃条件下糖化20h，得到黄姜糖化醪。
4.固液分离获得含黄姜皂苷和水解糖的混合液步骤
上述糖化醪再通过固液分离（5000rpm离心8min）去除其中未被酶解的固体残渣，得到经微生物及双酶法预处理形成的含有大量黄姜皂苷和糖分的混合液，经SBA-生物传感仪测定得到混合液葡萄糖浓度为65g/L。
5.糖化液中黄姜皂苷和水解糖的分离步骤
步骤4混合液进一步通过微滤得到清液，再通过孔径为1nm的纳滤装置，截留分子量较大（M=869.05）的黄姜皂苷，滤过分子量较小的水解糖，分别得到水解糖溶液和浓缩的黄姜皂苷溶液两种粗产品。
6.酶法或酸法水解含黄姜皂苷溶液获得黄姜皂素粗品步骤
上述纳滤截留的黄姜皂苷浓缩液中，每升加入15U薯蓣皂苷酶，在pH值为5.0、温度37℃条件下搅拌30min，除去上清即得黄姜皂素粗品。
所述皂素粗液再以石油醚混合0.3%活性炭为提取剂，在85℃温度下回流提取4h，趁热过滤活性炭，在压力0.01～0.05Mpa、温度60℃条件下旋转蒸发，回收有机溶剂石油醚循环利用，并得到白色黄姜皂素固体。
7.利用黄姜淀粉糖化液发酵生产乳酸
配制生产乳酸的发酵培养基，送入发酵罐进行高压蒸汽灭菌，冷却到室温后，向发酵罐中接入体积比8%的种子液，于pH值5.5、温度30℃条件下，搅拌转速50rpm，当发酵液中还原糖浓度小于3g/L时，发酵结束。
所述种子液按如下方法制备：每升水加入葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母粉5g，混合成种子培养基并灭菌，冷却至室温，得到无菌种子培养基；将产乳酸菌种接种于无菌种子培养基，在pH值5.5、温度30℃条件下搅拌，搅拌速度50rpm，时间10h，得到种子液；所述产乳酸菌种是鼠李糖乳杆菌L.rhamnosus HG09F-27。
生产乳酸的发酵培养基组成为：将上述黄姜淀粉糖化液糖浓度调整为还原糖160g/L；每升黄姜酶解糖液中添加酵母粉5g、蛋白胨10g、K2HPO42g，调节pH值至5.5；
生产结果：每100克干黄姜生产出皂素2.13克，乳酸34.56g。
实施例8包括下列步骤：
1.黄姜原料预处理步骤
鲜黄姜洗净去杂后，取2000克在温度120～130℃、压力0.1～0.2MPa条件下，蒸汽爆破18min，冷却至室温，粉碎至浆。
2.微生物处理释放步骤
上述经过预处理的黄姜块茎按照鲜黄姜：水=1:1（w/v）加水搅拌均匀；然后接种10%种子液，于pH值6.0、温度37℃条件下，搅拌转速150rpm，发酵处理4h后结束。
所述种子液是普通的LB培养基，即每升水加入蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，调节pH值至7.0，混合成种子培养基并灭菌，冷却至室温，得到无菌种子培养基；将产纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶组成的酶系的两种菌种分别接种于无菌种子培养基，在pH值7、温度37℃条件下搅拌，搅拌速度120rpm，时间10h，得到两种种子液；所述产纤维素酶、果胶酶的组成的酶系的菌种分别是地衣芽孢杆菌Hg-1和Hg-6，两种菌株种子液同时添加5%复合处理；
3.双酶法处理上述发酵液中淀粉得到水解糖，并进一步释放黄姜皂苷步骤
上述发酵液置于高温下灭活菌种，然后加入5万单位α-淀粉酶,在pH值6.2、温度92℃条件下液化5min，冷却至60℃以下；再加入5万单位糖化酶，在pH值4.2、温度60℃条件下糖化24h，得到黄姜糖化醪。
4.固液分离获得含黄姜皂苷和水解糖的混合液步骤
上述糖化醪再通过固液分离（5000rpm离心8min）去除其中未被酶解的固体残渣，得到经微生物及双酶法预处理形成的含有大量黄姜皂苷和糖分的混合液，经SBA-生物传感仪测定得到混合液葡萄糖浓度为65g/L。
5.糖化液中黄姜皂苷和水解糖的分离步骤
步骤4混合液进一步通过微滤得到清液，再通过孔径为1.5nm的纳滤装置，截留分子量较大（M=869.05）的黄姜皂苷，滤过分子量较小的水解糖，分别得到水解糖溶液和浓缩的黄姜皂苷溶液两种粗产品。
6.酶法或酸法水解含黄姜皂苷溶液获得黄姜皂素粗品步骤
上述纳滤截留的黄姜皂苷浓缩液中，每升加入15U薯蓣皂苷酶，在pH值为5.0、温度37℃条件下搅拌30min，除去上清即得黄姜皂素粗品。
所述皂素粗液再以石油醚混合0.5%活性炭为提取剂，在85℃温度下回流提取4h，趁热过滤活性炭，在压力0.01～0.05Mpa、温度60℃条件下旋转蒸发，回收有机溶剂石油醚循环利用，并得到白色黄姜皂素固体。
7.利用黄姜淀粉糖化液发酵生产乳酸
配制产朊假丝酵母生长发酵培养基，送入发酵罐进行高压蒸汽灭菌，冷却到室温后，向发酵罐中接入体积比10%的种子液，于pH值6.0、温度37℃条件下，搅拌转速180rpm，当发酵液中还原糖浓度为2g/L时，发酵结束。
所述种子液按如下方法制备：每升水加入葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母粉10g，混合成种子培养基并灭菌，冷却至室温，得到无菌种子培养基；将产朊假丝酵母接种于无菌种子培养基，在pH值6.0、温度30℃条件下搅拌，搅拌速度180rpm，时间12h，得到种子液。
生长菌体的发酵培养基组成为：在上述黄姜淀粉糖化液糖中按每添加酵母粉10g、蛋白胨21.3g，调节pH值至6.0；
生产结果：每100克鲜黄姜生产出皂素0.77克，产软假丝酵母菌体干重1.2克。
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。
Claims (6)
1.一种利用微生物技术清洁生产黄姜皂素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
第1步微生物处理释放黄姜皂苷步骤：
按照黄姜干重与水的质量比为1∶5～1∶10混合均匀制成浆液，在浆液中接种微生物，微生物能够分泌纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶和木聚糖酶中的任二种或二种以上，但分泌淀粉酶能力小于或者等于0.1U每毫升发酵液，再进行发酵处理，发酵处理时间为3h～10h，得到含黄姜皂苷和淀粉的微生物发酵液；
第2步双酶法处理上述微生物发酵液中淀粉得到水解糖，并从发酵液的固体颗粒中进一步释放黄姜皂苷步骤：
向上述发酵液中按黄姜干重每千克加入6万～10万单位(U)α-淀粉酶，在pH值4.0～7.0、温度90～92℃条件下液化5min～30min，发酵液中微生物此时已被高温灭活，不会利用水解糖；将高温发酵液冷却至60℃以下后，再按黄姜干重每千克加入6万～10万单位(U)糖化酶，在pH4.0～7.0、温度40～60℃条件下糖化6h～24h，得到含有大量黄姜皂苷和水解糖的黄姜糖化醪；
第3步固液分离黄姜糖化醪步骤：
通过固液分离去除上述黄姜糖化醪中未被酶解的固体残渣和灭活的微生物，得到经第2步处理后形成的含有水溶性黄姜皂苷和水解糖的混合液，即糖化液；
第4步糖化液中黄姜皂苷和水解糖的分离步骤：
通过以下两种方式分离上述糖化液中含有的黄姜皂苷和水解糖：
第一种方式：通过微滤得到清液，再通过纳滤装置，截留分子量较大
的黄姜皂苷，滤过分子量较小的水解糖，分别得到浓缩的黄姜皂苷溶液和水解糖溶液两种粗产品；所述微滤装置的孔径为0.10～0.45μm，所述纳滤装置孔径为0.5～lnm，纳滤膜是截留分子量为100～500道尔顿的有机膜;
第二种方式：以上述糖化液为碳源，配制培养基，灭菌后接种耐黄姜皂苷且产胞内产物的菌株，发酵处理后，离心发酵液，即将菌体及黄姜皂苷溶液分开，分别得到富含胞内发酵产物的菌体和黄姜皂苷溶液两种粗产品；所述耐黄姜皂苷且产胞内产物的菌株为产γ-亚油酸的小克银汉霉、或者为将菌体本身作为高蛋白饲料的产朊假丝酵母；
第5步水解含黄姜皂苷溶液获得黄姜皂素粗品；
第6步所述黄姜皂素粗品再经混合有活性炭的有机溶剂提取即得到黄姜皂素，所述活性炭的质量百分比浓度为0.3～0.8％;
以上所有步骤中用到固液分离均采用板框过滤或离心分离;
第6步中的有机溶剂为石油醚、汽油、乙酸乙酯中的任何一种。
2.如权利要求1所述的一种利用微生物技术清洁生产黄姜皂素的方法，其特征在于，第5步包括二种方式，第一种方式对于第4步中的第一种方式得到浓缩的黄姜皂苷溶液，直接水解含黄姜皂苷溶液，黄姜皂素不溶于水而沉淀，固液分离后获得黄姜皂素粗品；第二种方式对于第4步中第二种方式得到的黄姜皂苷溶液，先采用减压浓缩后，得到浓缩的黄姜皂苷溶液，再水解含黄姜皂苷溶液，黄姜皂素不溶于水而沉淀，固液分离后获得黄姜皂素粗品。
3.如权利要求1或2所述的利用微生物技术清洁生产黄姜皂素的方法，其特征在于，所述黄姜为鲜黄姜或黄姜干粉，鲜黄姜经洗净去杂后，在温度120～130℃、压力0.1～0.2MPa条件下，蒸汽爆破15～20min，冷却至室温后使用；黄姜干粉由黄姜块根干燥后粉碎至30目～100目得到，或进一步采用与鲜黄姜相同条件的爆破处理后得到。
4.如权利要求1或2所述的利用微生物技术清洁生产黄姜皂素的方法， 其特征在于，当所述黄姜为鲜黄姜时，第2步中，按每千克鲜黄姜加入2万～3.3万单位α-淀粉酶，按每千克鲜黄姜加入2万～3.3万单位糖化酶。
5.如权利要求2所述的一种利用微生物技术清洁生产黄姜皂素的方法，其特征在于，第5步的第一种方式中，在黄姜皂苷溶液中，按照10～15U/L加入薯蓣糖苷酶，在30～40℃条件下搅拌30～40min，得到黄姜皂素粗品。
6.如权利要求2所述的一种利用微生物技术清洁生产黄姜皂素的方法，其特征在于，第5步的第二种方式中，向浓缩黄姜皂苷溶液中加入硫酸，使硫酸终浓度为0.75～1.50mol/L，在100～104℃条件下酸解2～4h，即得黄姜皂素粗品。
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